测定脂蛋白质的胆甾醇负载能力的方法及试剂盒

摘要

本发明涉及测定脂蛋白质的胆甾醇负载能力的方法。另外，本发明涉及脂蛋白质的胆甾醇负载能力的测定用试剂盒。再者，本发明涉及可在这些方法及试剂盒中使用的附加了标签的胆甾醇。

权利要求

1.测定脂蛋白质的胆甾醇负载能力的方法，其包括：通过使试样中的脂蛋白质和附加了标签的胆甾醇接触而使所述脂蛋白质负载所述附加了标签的胆甾醇后，再向其接触特异性地结合于上述脂蛋白质的抗体，由此形成含负载了上述附加了标签的胆甾醇的上述脂蛋白质和上述抗体的复合物的工序，通过使特异性地结合于上述标签的捕获体和标记物质结合于上述复合物，对上述复合物进行标记的工序，及检测由结合于上述复合物的标记物质发生的信号的工序，其中在上述复合物中，上述标签露出到脂蛋白质的外表面，上述捕获体与露出到脂蛋白质的外表面的上述标签特异性地结合。

2.权利要求1所述的方法，其中上述附加了标签的胆甾醇是标签直接或经接头结合于胆甾醇的C20位～C27位之任一位的胆甾醇。

3.权利要求1所述的方法，其中在上述形成工序中，使上述复合物在固相上形成。

4.权利要求1所述的方法，其中在上述形成工序和上述标记工序之间还包括除去未形成复合物的未反应的游离成分的B/F分离工序。

5.权利要求1所述的方法，其中在上述标记工序和上述检测工序之间还包括除去未结合于复合物的未反应的游离成分的B/F分离工序。

6.权利要求1所述的方法，其中上述标记物质是酶，上述信号是通过使上述酶和底物接触而发生的化学发光信号。

7.权利要求6所述的方法，其中上述酶是过氧化物酶或碱性磷酸酶。

8.权利要求1所述的方法，其中上述捕获体是特异性地结合于上述标签的抗体、亲和素或链霉亲和素。

9.权利要求1所述的方法，其中结合于上述脂蛋白质的抗体是抗ApoAI抗体。

10.权利要求1所述的方法，其中上述附加了标签的胆甾醇由下述的式(III)表示：【化1】

式中

R1是任选有甲基的碳原子数1～6的亚烷基，X及Y相同或不同，其表示-R2-NH-、-NH-R2-、-R2-(C＝O)-NH-、-(C＝O)-NH-R2-、-R2-NH-(C＝O)-、-NH-(C＝O)-R2-、-R2-(C＝O)-、-(C＝O)-R2-、-R2-(C＝O)-O-、-(C＝O)-O-R2-、-R2-O-(C＝O)-、-O-(C＝O)-R2-、-R2-(C＝S)-NH-、-(C＝S)-NH-R2-、-R2-NH-(C＝S)-、-NH-(C＝S)-R2-、-R2-O-、-O-R2-、-R2-S-、或者-S-R2-，其中，R2各自独立地是：连键、任选有取代基的碳原子数1～10的亚烷基、任选有取代基的碳原子数6～12的亚芳基或杂亚芳基、或者，任选有取代基的碳原子数3～8的环亚烷基或杂环亚烷基，L表示-(CH2)d-[R3-(CH2)e]f-、或者-[(CH2)e-R3]f-(CH2)d-，其中，R3是：氧原子、硫原子、-NH-、-NH-(C＝O)-或-(C＝O)-NH-，TAG是标签，

a及c相同或不同，是0～6的整数，

b是0或1，

d及e相同或不同，是0～12的整数，f是0～24的整数。

11.权利要求1所述的方法，其中上述附加了标签的胆甾醇具有作为标签而附加了下列物质的结构：下述的式(I)：

【化2】

所表示的结构、或者

下述的式(II)：

【化3】

所表示的结构、或者

2,4-二硝基苯基。

12.权利要求11所述的方法，其中上述附加了标签的胆甾醇由下述的式(IV)表示：

【化4】

或者

由下述的式(V)表示：

【化5】

式中，n是0～24的整数；或者

由下述的式(VI)表示：

【化6】

13.权利要求1所述的方法，其中上述试样是血液、血清或血浆。

14.权利要求1所述的方法，其中上述脂蛋白质是高比重脂蛋白质。

15.附加了标签的胆甾醇、特异性地结合于脂蛋白质的抗体、特异性地结合于上述标签的捕获体和标记物质用于制造脂蛋白质的胆甾醇负载能力测定用试剂盒的用途，其中所述脂蛋白质的胆甾醇负载能力通过包括下列工序的方法进行：通过使试样中的脂蛋白质和附加了标签的胆甾醇接触而使所述脂蛋白质负载所述附加了标签的胆甾醇后，再向其接触特异性地结合于上述脂蛋白质的抗体，由此形成含负载了上述附加了标签的胆甾醇的上述脂蛋白质和上述抗体的复合物的工序，通过使特异性地结合于上述标签的捕获体和标记物质结合于上述复合物，对上述复合物进行标记的工序，及检测由结合于上述复合物的标记物质发生的信号的工序，其中在上述复合物中，上述标签露出到脂蛋白质的外表面，上述捕获体与露出到脂蛋白质的外表面的上述标签特异性地结合。

16.权利要求15所述的用途，其中上述附加了标签的胆甾醇是标签直接或经接头结合于胆甾醇的C20位～C27位之任一位的胆甾醇。

17.权利要求15所述的用途，其中在上述形成工序中，使上述复合物在固相上形成。

18.权利要求15所述的用途，其中在上述形成工序和上述标记工序之间还包括除去未形成复合物的未反应的游离成分的B/F分离工序。

19.权利要求15所述的用途，其中在上述标记工序和上述检测工序之间还包括除去未结合于复合物的未反应的游离成分的B/F分离工序。

20.权利要求15所述的用途，其中上述标记物质是酶，上述信号是通过使上述酶和底物接触而发生的化学发光信号。

21.权利要求20所述的用途，其中上述酶是过氧化物酶或碱性磷酸酶。

22.权利要求15所述的用途，其中上述捕获体是特异性地结合于上述标签的抗体、亲和素或链霉亲和素。

23.权利要求15所述的用途，其中结合于上述脂蛋白质的抗体是抗ApoAI抗体。

24.权利要求15所述的用途，其中上述附加了标签的胆甾醇由下述的式(III)表示：【化1】

式中

R1是任选有甲基的碳原子数1～6的亚烷基，X及Y相同或不同，其表示-R2-NH-、-NH-R2-、-R2-(C＝O)-NH-、-(C＝O)-NH-R2-、-R2-NH-(C＝O)-、-NH-(C＝O)-R2-、-R2-(C＝O)-、-(C＝O)-R2-、-R2-(C＝O)-O-、-(C＝O)-O-R2-、-R2-O-(C＝O)-、-O-(C＝O)-R2-、-R2-(C＝S)-NH-、-(C＝S)-NH-R2-、-R2-NH-(C＝S)-、-NH-(C＝S)-R2-、-R2-O-、-O-R2-、-R2-S-、或者-S-R2-，其中，R2各自独立地是：连键、任选有取代基的碳原子数1～10的亚烷基、任选有取代基的碳原子数6～12的亚芳基或杂亚芳基、或者，任选有取代基的碳原子数3～8的环亚烷基或杂环亚烷基，L表示-(CH2)d-[R3-(CH2)e]f-、或者-[(CH2)e-R3]f-(CH2)d-，其中，R3是：氧原子、硫原子、-NH-、-NH-(C＝O)-或-(C＝O)-NH-，TAG是标签，

a及c相同或不同，是0～6的整数，

b是0或1，

d及e相同或不同，是0～12的整数，f是0～24的整数。

25.权利要求15所述的用途，其中上述附加了标签的胆甾醇具有作为标签而附加了下列物质的结构：下述的式(I)：

【化2】

所表示的结构、或者

下述的式(II)：

【化3】

所表示的结构、或者

2,4-二硝基苯基。

26.权利要求25所述的用途，其中上述附加了标签的胆甾醇由下述的式(IV)表示：

【化4】

或者

由下述的式(V)表示：

【化5】

式中，n是0～24的整数；或者

由下述的式(VI)表示：

【化6】

27.权利要求15所述的用途，其中上述试样是血液、血清或血浆。

28.权利要求15所述的用途，其中上述脂蛋白质是高比重脂蛋白质。

说明书

测定脂蛋白质的胆甾醇负载能力的方法及试剂盒

【技术领域】

[0001] 本发明涉及测定脂蛋白质的胆甾醇负载能力的方法。另外，本发明涉及脂蛋白质的胆甾醇负载能力的测定用试剂盒。再者，本发明涉及可在这些方法及试剂盒中使用的附加了标签的胆甾醇。【背景技术】

[0002] 已知胆甾醇的代谢异常与各种的疾病相关，血中的胆甾醇浓度成为其指标。但是，胆甾醇浓度有时不反映疾病的存在或疾病风险等。从而，不仅是胆甾醇浓度等的量的指标，关注于胆甾醇的功能的质的指标被关注。

[0003] 例如，即使血中的高比重脂蛋白质胆甾醇(HDL-C)浓度高，也有不降低心血管疾病(CVD)风险的情况，指出HDL-C浓度不完全地反映CVD风险的可能性。高比重脂蛋白质(HDL)的功能受到关注，被报告由HDL来自的末梢组织的胆甾醇的排出功能是对于CVD风险的负的预后因子。

[0004] 作为研究HDL的功能的方法，例如，在专利文献1中，记载了不使用培养细胞而由荧光标记胆甾醇判断脂质异常症的方法。在此方法中，将含低比重脂蛋白质(LDL)或HDL等的各种的脂蛋白质的周缘的单层用荧光标记胆甾醇(胆甾醇芘)标记，基于测定被标记的脂蛋白质而得到的荧光光谱，判断受试者是脂质异常症与否。再者，在此文献中，记载了可由超离心分离法、透析、或者使用凝胶过滤柱的FPLC分离标记的脂蛋白质和游离的荧光标记胆甾醇。

[0005] 【现有技术文献】

[0006] 【专利文献】

[0007] 专利文献1：国际公开第2012/104411号单行本【发明内容】

[0008] 【发明要解决的技术课题】

[0009] 作为脂蛋白质的功能解析法，关注于脂蛋白质的胆甾醇负载能力的测定法は尚少，要求进一步的的测定法的开发。

[0010] 【解决课题的技术方案】

[0011] 本发明提供测定脂蛋白质的胆甾醇负载能力的方法，其包括：通过使试样中的脂蛋白质、附加了标签的胆甾醇和特异性地结合于脂蛋白质的抗体接触，形成含负载了附加了标签的胆甾醇的脂蛋白质和上述的抗体的复合物的工序，通过使特异性地结合于上述标签的捕获体和标记物质结合于此复合物，标记复合物的工序，及检测由与复合物结合的标记物质发生的信号的工序。

[0012] 另外，本发明提供含附加了标签的胆甾醇、特异性地结合于脂蛋白质的抗体、特异性地结合于上述标签的捕获体和标记物质的脂蛋白质的胆甾醇负载能力测定用试剂盒。

[0013] 另外，本发明提供下述的式(III)表示的附加了标签的胆甾醇：

[0014] 【化1】

[0015]

[0016] 式中，R1是任选有甲基的碳原子数1～6的亚烷基，

[0017] X及Y相同或不同，其表示-R2-NH-、-NH-R2-、-R2-(C＝O)-NH-、-(C＝O)-NH-R2-、-R2-NH-(C＝O)-、-NH-(C＝O)-R2-、-R2-(C＝O)-、-(C＝O)-R2-、-R2-(C＝O)-O-、-(C＝O)-O-R2-、-R2-O-(C＝O)-、-O-(C＝O)-R2-、-R2-(C＝S)-NH-、-(C＝S)-NH-R2-、-R2-NH-(C＝S)-、-NH-(C＝S)-R2-、-R2-O-、-O-R2-、-R2-S-、或者-S-R2-，其中，R2各自独立地是：连键、任选有取代基的碳原子数1～10的亚烷基、任选有取代基的碳原子数6～12的亚芳基或杂亚芳基、或者，任选有取代基的碳原子数3～8的环亚烷基或杂环亚烷基，

[0018] L表示-(CH2)d-[R3-(CH2)e]f-、或者-[(CH2)e-R3]f-(CH2)d-，其中，R3是：氧原子、硫原子、-NH-、-NH-(C＝O)-或-(C＝O)-NH-，

[0019] TAG是标签，

[0020] a及c相同或不同，是0～6的整数，

[0021] b是0或1，

[0022] d及e相同或不同，是0～12的整数，

[0023] f是0～24的整数。

[0024] 【发明效果】

[0025] 由本发明提供脂蛋白质的胆甾醇负载能力的测定方法。【附图说明】

[0026] 【图1】是显示由夹心ELISA法测定的被固相上的抗载脂蛋白AI(ApoAI)抗体捕获的复合物的量的坐标图。

[0027] 【图2】是显示由夹心ELISA法测定的被抗ApoAI抗体捕获的复合物中的被HDL负载的附加了标签的胆甾醇的量的坐标图。

[0028] 【图3A】是显示本实施方式涉及的试剂盒的外观的一例的图。

[0029] 【图3B】是显示本实施方式涉及的试剂盒的外观的一例的图。

[0030] 【图3C】是显示本实施方式涉及的试剂盒的外观的一例的图。

[0031] 【图3D】是显示本实施方式涉及的试剂盒的外观的一例的图。

[0032] 【图3E】是显示本实施方式涉及的试剂盒的外观的一例的图。

[0033] 【图3F】是显示本实施方式涉及的试剂盒的外观的一例的图。

[0034] 【图4】是显示由夹心ELISA法测定的被抗ApoAI抗体捕获的复合物中的被HDL负载的附加了标签的胆甾醇的量的坐标图。

[0035] 【图5】是显示由使用磁性粒子的ELISA法测定的被抗ApoAI抗体捕获的复合物中的被HDL负载的附加了标签的胆甾醇的量的坐标图。

[0036] 【实施方式】

[0037] 本实施方式涉及的测定脂蛋白质的胆甾醇负载能力的方法(以下，也简称为“测定方法”)，如后所述，由于向试样中的脂蛋白质直接负载附加了标签的胆甾醇，也可如以往的胆甾醇排出功能的测定法一样，不使用巨噬细胞等的蓄积胆甾醇的细胞。从而，本实施方式涉及的测定方法在后述的任何的工序中都可用无细胞系进行。其中，无细胞系是指不以在脂蛋白质的胆甾醇负载能力的测定中利用的目的添加细胞。即，本实施方式的测定方法可无需为了测定而添加细胞而利用其性质及功能等实施。再者认为，在本实施方式中，即使在使用的试样中含受试者来源的细胞时，其细胞自体基本不影响脂蛋白质的标签附加标记胆甾醇的负载，测定方法看作是无细胞系。

[0038] 在本实施方式涉及的测定方法中的，向脂蛋白质负载的附加了标签的胆甾醇的检测原理如下所述。脂蛋白质和附加了标签的胆甾醇接触，则脂蛋白质使附加了标签的胆甾醇酯化而负载。向脂蛋白质负载的胆甾醇从脂蛋白质粒子的表层向中心部移动。在附加了标签的胆甾醇中，向脂蛋白质负载的是胆甾醇部分，标签被认为露出到脂蛋白质的外表面。其中，“脂蛋白质的外表面”是指脂蛋白质粒子的外侧的面。“露出到外表面”是指在脂蛋白质的外表面上存在，及从脂蛋白质的外表面突出的两者。在本实施方式中，通过使露出到此外表面的标签和与该标签特异性地结合的捕获体结合，检测被脂蛋白质负载的胆甾醇。接下来，对于本实施方式涉及的测定方法的各工序进行说明。

[0039] 在本实施方式涉及的测定方法中，首先，通过使试样中的脂蛋白质、附加了标签的胆甾醇和特异性地结合于脂蛋白质的抗体接触，形成含该负载了附加了标签的胆甾醇的脂蛋白质和该抗体的复合物。

[0040] 在本实施方式中，试样只要是含哺乳动物的脂蛋白质、优选为人的脂蛋白质，就不特别限定。作为这样的试样，例如，可举出称为血液、血清及血浆的血液试样。

[0041] 成为本实施方式的测定对象的脂蛋白质可为HDL、LDL、中间比重脂蛋白质(IDL)、超低比重脂蛋白质(VLDL)、或者乳糜微粒(CM)。HDL是有1.063g/mL以上的密度的脂蛋白质。LDL是有1.019g/mL以上、不足1.063g/mL的密度的脂蛋白质。IDL是有1.006g/mL以上、不足
1.019g/mL的密度的脂蛋白质。VLDL是有0.95g/mL以上、不足1.006g/mL的密度的脂蛋白质。
CM是有不足0.95g/mL的密度的脂蛋白质。

[0042] 本实施方式的测定时，由超离心分离法或聚乙二醇(PEG)沉淀法等的公知的方法分离血液试样，可取得含指定的脂蛋白质的级分。

[0043] 在本实施方式中，也可为了调整脂蛋白质浓度，以将上述的血液试样及指定的脂蛋白质级分用水性介质稀释而得到的液作为试样使用。作为这样的水性介质，例如，可举出水、生理盐水、磷酸缓冲生理盐水(PBS)及Tris-HCl等的缓冲液等。再者，试样中的脂蛋白质浓度由于作为脂蛋白质的主要的构成成分的ApoAI的浓度成为指标，在本实施方式中，也可取试样的一部分，将其中所含的ApoAI的浓度由公知的免疫学测定法(例如免疫比浊法)测定。基于得到的ApoAI的浓度，可调整试样中的脂蛋白质浓度。

[0044] 也可根据需要，向试样添加牛血清白蛋白(BSA)、脂质体等的封闭剂等。另外，由于已知脂蛋白质将胆甾醇酯化而负载，也可向试样添加由脂蛋白质的胆甾醇的酯化反应必要的脂肪酸或含其的组合物(例如脂质体)。

[0045] 在本实施方式中，作为被脂蛋白质负载的胆甾醇，使用附加了标签的胆甾醇。其中，附加了标签的胆甾醇是指标签直接或经接头结合于与天然存在的胆甾醇的C17位结合的烷基链(C20位～C27位)的任何的位置的胆甾醇。在附加了标签的胆甾醇中的胆甾醇部分可为有天然存在的胆甾醇的结构，或者，也可为有从与天然存在的胆甾醇的C17位结合的烷基链除1个以上的亚甲基及/或甲基的胆甾醇(也称为去甲胆固醇)的结构。

[0046] 附加到胆甾醇的标签只要是不抑制由脂蛋白质的胆甾醇的负载，并且，存在或得到可与该标签特异性地结合的物质(与后述的“与标签特异性地结合的捕获体”相同的)，就不特别限定。

[0047] 如上所述，由于脂蛋白质使胆甾醇酯化而负载，更优选使用由脂蛋白质酯化的附加了标签的胆甾醇。再者，在本实施方式的方法中，附加了标签的胆甾醇在与试样接触时，由该试样中所含的生物体来源的卵磷脂-胆甾醇酰基转移酶(LCAT)酯化。确认由脂蛋白质的附加了标签的胆甾醇的酯化的方法自体是在现有技术中公知的，可由本领域技术人员程序性地进行。

[0048] 在本实施方式中，标签可为天然来源的物质及也可为合成的物质的任何，例如，可举出化合物、肽、蛋白质、核酸及它们的组合等。化合物只要是存在或得到可与其特异性地结合的物质，就也可为在现有技术中公知的标记化合物，例如，可举出染料化合物等。

[0049] 现有技术中已知，通过胆甾醇被酯化而脂溶性增大，由脂蛋白质的负载被促进。附加到胆甾醇的标签也可为脂溶性或疏水性的物质。

[0050] 作为标签和可与该标签特异性地结合的物质的组合，例如，可举出抗原和识别该抗原的抗体、半抗原和抗半抗原抗体、肽或蛋白质和识别它们的适体、配体及其受体、寡核苷酸及有其互补链的寡核苷酸、生物素和亲和素(或者链霉亲和素)、组氨酸标签(含6～10残基的组氨酸的肽)和镍、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和谷胱甘肽等。作为标签的抗原可为在现有技术中公知的肽标签及蛋白标签，例如，可举出FLAG(注册商标)、凝血素(HA)、Myc蛋白质、绿色荧光蛋白质(GFP)等。作为标签的半抗原，例如，可举出2,4-二硝基苯酚等。

[0051] 作为标签的例，可举出如下标签，其有

[0052] 下述的式(I)所表示的结构：

[0053] 【化2】

[0054] 或者

[0055] 下述的式(II)所表示的结构：

[0056] 【化3】

[0057]

[0058] 式(I)所表示的结构是硼二吡咯亚甲基(BODIPY(注册商标))骨架，式(II)所表示的结构示生物素的一部分。含式(I)或(II)所表示的结构的附加了标签的胆甾醇由于一般可得到对于这些标签的捕获体而优选。另外，附加有2,4-二硝基苯基(DNP)基的标签的胆甾醇也由于抗DNP抗体在市售而优选。

[0059] 作为附加了标签的胆甾醇，例如，可举出由下述的式(III)表示的附加了标签的胆甾醇：

[0060] 【化4】

[0061]

[0062] (式中，R1是任选有甲基的碳原子数1～6的亚烷基，

[0063] X及Y相同或不同，其表示-R2-NH-、-NH-R2-、-R2-(C＝O)-NH-、-(C＝O)-NH-R2-、-R2-NH-(C＝O)-、-NH-(C＝O)-R2-、-R2-(C＝O)-、-(C＝O)-R2-、-R2-(C＝O)-O-、-(C＝O)-O-R2-、-R2-O-(C＝O)-、-O-(C＝O)-R2-、-R2-(C＝S)-NH-、-(C＝S)-NH-R2-、-R2-NH-(C＝S)-、-NH-(C＝S)-R2-、-R2-O-、-O-R2-、-R2-S-、或者-S-R2-，其中，R2各自独立地是：连键、任选有取代基的碳原子数1～10的亚烷基、任选有取代基的碳原子数6～12的亚芳基或杂亚芳基、或者，任选有取代基的碳原子数3～8的环亚烷基或杂环亚烷基，

[0064] L表示-(CH2)d-[R3-(CH2)e]f-、或者-[(CH2)e-R3]f-(CH2)d-，其中，R3是：氧原子、硫原子、-NH-、-NH-(C＝O)-或-(C＝O)-NH-，

[0065] TAG是标签，

[0066] a及c相同或不同，是0～6的整数，

[0067] b是0或1，

[0068] d及e相同或不同，是0～12的整数，

[0069] f是0～24的整数。)。

[0070] 在式(III)中，当a、b及c均是0之时，由此式表示的附加了标签的胆甾醇无接头，标签和胆甾醇部分直接键合。在式(III)中，当a、b及c均不是0之时，由此式表示的附加了标签的胆甾醇在标签和胆甾醇部分之间有接头(-[X]a-[L]b-[Y]c-)。由接头，认为露出到脂蛋白质的外表面的标签和捕获体变得更容易结合。接下来，对于式(III)的各取代基进行说明。

[0071] R1以碳原子数1～6的亚烷基作为主链，也可在任何的位置有甲基。R1相当于与天然存在的胆甾醇的C17位结合的烷基链。在本实施方式中，R1在碳原子数1～5的情况中，优选在天然存在的胆甾醇中的C20的位置有甲基的。R1在碳原子数6的情况中，优选与天然存在的胆甾醇的C20位～C27位的烷基链相同的结构的。

[0072] [X]a相当于R1和L、[Y]c或标签的连接部分。[Y]c相当于R1、[X]a或L和标签的连接部分。X及Y根据使胆甾醇部分和接头结合的反应及使接头和标签结合的反应的种类决定。

[0073] 关于R2，连键是指其间不经其他原子直接键合的。当R2是碳原子数1～10的亚烷基之时，作为这样的亚烷基，例如，可举出亚甲基、亚乙基、亚丙基、异亚丙基、亚丁基、异亚丁基、亚戊基、新亚戊基、亚己基、亚庚基、亚辛基、2-乙基亚己基、亚壬基及亚癸基等的基。在它们之中，也优选碳原子数1～4的亚烷基。当R2是有取代基的亚烷基之时，在上述的碳原子数中，不含取代基的碳原子数。

[0074] 当R2是亚芳基或杂亚芳基之时，这样的基只要是也可含从N、S、O及P选择的1个以上的杂原子的碳原子数6～12的芳香环即可。例如，可举出亚苯基、亚萘基、亚联苯基、亚呋喃基、亚吡咯基、亚苯硫基、亚三唑基、亚噁二唑基、亚吡啶基、亚嘧啶基等的基。当R2是有取代基的亚芳基或杂亚芳基之时，在上述的碳原子数中，不含取代基的碳原子数。

[0075] 当R2是环亚烷基或杂环亚烷基之时，这样的基只要是也可含从N、S、O及P选择的1个以上的杂原子的碳原子数3～8的非芳香环即可。例如，可举出环亚丙基、环亚丁基、环亚戊基、环亚己基、环亚庚基、环亚辛基、亚吡咯烷基、亚哌啶基、亚吗啉基等的基。当R2是有取代基的环亚烷基或杂环亚烷基之时，在上述的碳原子数中，不含取代基的碳原子数。

[0076] 作为R2中的取代基，例如，可举出羟基、氰基、烷氧基、＝O、＝S、-NO2、-SH、卤素、卤烷基、杂烷基、羧基烷基、胺、酰胺、及硫醚等的基。R2也可有多个取代基。其中，卤素表示氟、氯、溴、或者碘。烷氧基示-O-烷基，此烷基是碳原子数1～5、优选为碳原子数1或2的直链状或支链状的饱和脂肪族烃基。

[0077] 优选为，a及c均是1，X及Y相同或不同，是-(C＝O)-NH-、或者-NH-(C＝O)-。

[0078] L相当于间隔物，有向接头赋予指定的长度的聚合物结构。此聚合物结构部分优选为不抑制由脂蛋白质的胆甾醇的负载，并且，接头部分难被脂蛋白质负载的性质。作为这样的聚合物，可举出聚乙二醇(PEG)等的亲水性聚合物。在优选的实施方式中，L是-(CH2)d-[O-(CH2)e]f-、或者-[(CH2)e-O]f-(CH2)d-所表示的结构。其中，d及e相同或不同，0～12的整数、优选为2～6的整数、更优选同为2。f是0～24的整数、优选为2～11的整数、更优选为4～11的整数。

[0079] 作为无接头的附加了标签的胆甾醇，例如，可举出由下述的式(IV)表示的荧光标记胆甾醇(23-(二吡咯亚甲基硼二氟)-24-去甲胆固醇)：

[0080] 【化5】

[0081]

[0082] 此荧光标记胆甾醇在市售(商品名TopFluor Cholesterol、CAS No：878557-19-8、Avanti Polar Lipids公司)。由式(IV)表示的附加了标签的胆甾醇是，标签(有BODIPY骨架结构的荧光部分)直接键合于胆甾醇的C23位。作为与有上述的BODIPY骨架结构的荧光部分特异性地结合的捕获体，抗BODIPY抗体(BODIPY FL Rabbit IgG Fraction、A-5770、Lifetechnologies公司)在市售。

[0083] 作为标签经接头结合的附加了标签的胆甾醇，可举出由下述的式(V)表示的附加了生物素的胆甾醇：

[0084] 【化6】

[0085]

[0086] (式中，n是0～24的整数、优选为2～11的整数、更优选为4～11的整数。)。

[0087] 在此附加了标签的胆甾醇中，标签(由式(II)表示的生物素部分)经接头(聚乙二醇)与胆甾醇部分结合。作为与生物素部分特异性地结合的捕获体，亲和素或链霉亲和素是适宜的。另外，结合了辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP)等的标记物质的亲和素或链霉亲和素也在市售。

[0088] 另外，可举出由下述的式(VI)表示的DNP附加胆甾醇：

[0089] 【化7】

[0090]

[0091] 在此附加了标签的胆甾醇中，DNP经接头(-(C＝O)-NH-CH2-CH2-NH-)与胆甾醇部分结合。作为与DNP特异性地结合的捕获体，抗DNP抗体是适宜的。另外，结合了HRP、ALP等的标记物质的抗DNP抗体也在市售。

[0092] 胆甾醇部分和标签的结合样式不特别限定，可为使胆甾醇部分和标签结合，也可为将胆甾醇部分和标签经接头结合。连键段不特别限定，例如，利用官能团的交联简便且优选。官能团不特别限定，氨基、羧基及巯基由于可利用市售的交联剂而优选。

[0093] 胆甾醇由于在与C17位结合的烷基链上无官能团，在标签的附加中，优选使用在该烷基链有官能团的胆甾醇衍生物的。作为这样的胆甾醇衍生物，例如，可举出胆汁酸的前体、类固醇的前体等。具体而言，优选3β-羟基-Δ5-胆烯酸、24-氨基-5-胆烯-3β-醇等。标签的官能团根据标签的种类而不同。例如，在标签中使用肽或蛋白质时，可利用氨基、羧基及巯基(SH基)，在标签中使用生物素时，可利用侧链的羧基。接头优选在两端有官能团的聚合物化合物。再者，以生物素作为标签附加时，也可使用市售的生物素标记试剂。此试剂含结合了在末端有氨基等的官能团的各种各样的长度的间隔物臂(PEG等)的生物素。

[0094] 接下来，说明代表性的官能团的交联的反应。作为官能团有氨基的化合物可作为反应基与有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯或异硫氰基的化合物交联(参照下图)。例如，当将有氨基的胆甾醇和有氨基的标签交联时，也可使用两端有NHS酯的交联试剂或接头。

[0095] 【化8】NHS酯和氨基的反应

[0096]

[0097] X＝H或SO3Na

[0098] 异硫氰基和氨基的反应

[0099]

[0100] 作为官能团有羧基的化合物首先与有碳二亚胺基(-N＝C＝N-)的化合物反应(下图参照。在图中，与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐反应)。其中由于使NHS反应，使不稳定的NHS酯形成。进而，其中，通过使有氨基的化合物反应，可与有羧基的化合物交联。例如，当将有羧基的胆甾醇和有氨基的标签交联时，可这样交联。另外，当将有羧基的胆甾醇和有羧基的标签交联时，也可使用两端有氨基的交联试剂或接头。

[0101] 【化9】(第1步骤)

[0102]

[0103] (第2步骤)

[0104]

[0105] X＝H或SO3Na

[0106] (第3步骤)

[0107]

[0108] 作为官能团有巯基的化合物可作为反应基与有马来酰亚胺基或溴(或者碘)乙酰胺基的化合物交联(参照下图)。例如，当将有巯基的胆甾醇和有巯基的标签交联时，也可使用两端有马来酰亚胺的交联试剂或接头。

[0109] 【化10】马来酰亚胺基和巯基的反应

[0110]

[0111] 溴(碘)乙酰胺基和巯基的反应

[0112]

[0113] X＝Br或I

[0114] 上述的交联反应可在常温常压下进行。在反应中使用的溶剂只要对于上述的反应无活性，并可溶解或分散供于反应的各化合物，不特别限定。作为这样的溶剂，例如，可举出苯、甲苯、二甲苯等的芳香族烃类、二乙基醚、四氢呋喃、乙二醇二甲基醚、1,4-二噁烷等的醚类、N,N-二甲基甲酰胺等的酰胺类、二甲基亚砜等的亚砜类、二氯甲烷、氯仿等的卤化烃类等。可以这些溶剂作为单独或混液使用。

[0115] 在本实施方式中，特异性地结合于脂蛋白质的抗体(以下，也称为“抗脂蛋白质抗体”)只要是可与脂蛋白质的表面的一部分特异性地结合的抗体，就不特别限定，优选为，可与作为脂蛋白质的构成成分的载脂蛋白特异性地结合的抗体。作为这样的抗体，例如，可举出抗ApoAI抗体、抗ApoAII抗体等，在它们之中，也特别优选抗ApoAI抗体。在本实施方式中，也可使用市售的抗脂蛋白质抗体及抗ApoAI抗体。

[0116] 抗脂蛋白质抗体可为单克隆抗体，也可为多克隆抗体。抗体的来源不特别限定，也可为来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊、马、骆驼等的任何的哺乳动物的抗体。另外，抗体的同种型可为IgG、IgM、IgE、IgA等的任何，优选为IgG。在本实施方式中，作为抗脂蛋白质抗体，也可使用该抗体的片段及其衍生物，例如，可举出Fab片段、F(ab')2片段等。

[0117] 当作为抗脂蛋白质抗体使用抗ApoAI抗体时，也可在使抗ApoAI抗体和负载了附加了标签的胆甾醇的脂蛋白质接触之前，将该脂蛋白质用氧化剂处理。可由氧化剂的作用改善抗ApoAI抗体和脂蛋白质的反应性。作为这样的氧化剂，例如，可举出过氧化氢、过氧化亚硝酸、二氧化氯、次氯酸等。

[0118] 在本实施方式中，试样中的脂蛋白质、附加了标签的胆甾醇和抗脂蛋白质抗体的接触，例如，可通过将含脂蛋白质的试样和附加了标签的胆甾醇溶液和抗脂蛋白质抗体溶液混合来进行。将这些混合之后，脂蛋白质开始负载附加了标签的胆甾醇，形成了负载了附加了标签的胆甾醇的脂蛋白质和抗脂蛋白质抗体的复合物。

[0119] 使试样中的脂蛋白质和附加了标签的胆甾醇和抗脂蛋白质抗体接触的顺序不特别限定，可为将这些同时混合，也可为依次混合。在本实施方式中，优选将脂蛋白质和附加了标签的胆甾醇先混合，使脂蛋白质负载附加了标签的胆甾醇之后，使抗脂蛋白质抗体接触的。是因为如果使附加了标签的胆甾醇和抗脂蛋白质抗体先接触，则考虑结合了抗脂蛋白质抗体的附加了标签的胆甾醇变得难以被脂蛋白质负载的可能性。

[0120] 在本实施方式中，附加了标签的胆甾醇的添加量不特别限定，也可略过量地添加附加了标签的胆甾醇保证其不枯渴。例如，可将附加了标签的胆甾醇添加到试样中至成为终浓度0.1～30μM、优选为1～10μM。抗脂蛋白质抗体的添加量不特别限定，本领域技术人员可根据抗体的种类等适宜设定。

[0121] 在接触中的温度及时间的条件不特别限定，例如，可将试样和附加了标签的胆甾醇和抗脂蛋白质抗体的混合液于20～48℃、优选为25～42℃温育1分钟～24小时、优选为10分钟～2小时。温育之间、混合液可为静置，也可为搅拌或振荡。

[0122] 当将脂蛋白质和附加了标签的胆甾醇先混合时，可将混合液于20～48℃、优选为25～42℃，温育1分钟～24小时、优选为10分钟～2小时。其后，可向混合液添加抗脂蛋白质抗体，于20～48℃、优选为25～42℃温育1分钟～24小时、优选为10分钟～2小时。温育之间、混合液可为静置，也可为搅拌或振荡。

[0123] 在本实施方式中，也可在固相上形成负载了附加了标签的胆甾醇的脂蛋白质和抗脂蛋白质抗体的复合物。此时，例如，也可使含脂蛋白质的试样、附加了标签的胆甾醇溶液、抗脂蛋白质抗体溶液和固相接触。另外，也可将含脂蛋白质的试样、附加了标签的胆甾醇溶液和抗脂蛋白质抗体溶液混合之后，使得到的混合液和固相接触。或者，也可将抗脂蛋白质抗体预先固定于固相上而使用。例如，可通过使固定化了抗脂蛋白质抗体的固相与含脂蛋白质的试样和附加了标签的胆甾醇溶液的混合液接触，在固相上形成复合物。在接触中的温度及时间的条件不特别限定，例如，也可为与上述的复合物的形成工序同样的条件。

[0124] 作为固相，优选为能捕获复合物中的抗脂蛋白质抗体的固相。固相的种类不特别限定，例如，可举出物理吸附抗体的材质的固相、固定化了与抗体特异性地结合的分子的固相等。作为与抗体特异性地结合的分子，可举出蛋白A或G、特异性地识别该抗体的抗体(即第二抗体)等。另外，也可使用介于抗体和固相之间的物质的组合，使两者结合。作为这样的物质的组合，可举出生物素和亲和素(或者链霉亲和素)、半抗原和抗半抗原抗体等的组合。例如，当预先生物素修饰抗脂蛋白质抗体时，可由固定化了亲和素或链霉亲和素的固相捕获该抗体。

[0125] 作为固相的原料，可从有机高分子化合物、无机化合物、生物体高分子等选择。作为有机高分子化合物，可举出乳胶、聚苯乙烯、聚丙烯、苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、苯乙烯-缩水甘油基(甲基)丙烯酸共聚物、苯乙烯-苯乙烯磺酸盐共聚物、甲基丙烯酸聚合物、丙烯酸聚合物、丙烯腈丁二烯苯乙烯共聚物、氯乙烯-丙烯酸酯共聚物、聚醋酸乙烯基丙烯酸酯等。作为无机化合物，可举出磁性体(氧化铁、氧化铬、钴及铁素体等)、氧化硅、氧化铝、玻璃等。作为生物体高分子，可举出不溶性琼脂糖、不溶性葡聚糖、明胶、纤维素等。也可使这些中的2种以上组合使用。固相的形状不特别限定，例如，可举出粒子、微平板、微管、试管等。在它们之中，也优选微平板及粒子，特别优选96孔微平板及磁性粒子。

[0126] 在本实施方式中，在上述的复合物的形成工序和后述的标记工序之间，也可进行除去未形成复合物的未反应的游离成分的B/F分离。未反应的游离成分是指不构成复合物的成分。例如，可举出未被脂蛋白质负载的游离的附加了标签的胆甾醇、未与脂蛋白质结合的游离的抗脂蛋白质抗体等。B/F分离的手段不特别限定，例如，通过由超离心分离法等仅回收复合物，可分离复合物和未反应的游离成分。在固相上形成复合物时，固相如果是粒子，就通过仅回收捕获复合物的粒子，可分离复合物和未反应的游离成分。固相如果是微平板或微管等的容器，就通过除去含未反应的游离成分的液，可分离复合物和未反应的游离成分。也可在除去未反应的游离成分之后，将回收的复合物用PBS等的适合的水性介质清洗。

[0127] 在本实施方式涉及的测定方法中，通过使特异性地结合于上述标签的捕获体和标记物质结合于如上所述形成的复合物，对该复合物进行标记。

[0128] 与标签特异性地结合的捕获体，根据上述的附加了标签的胆甾醇的标签的种类适宜决定即可。例如，可参照上述的标签和可与该标签特异性地结合的物质的组合，从抗体、配体受体、寡核苷酸、生物素、亲和素(或者链霉亲和素)、组氨酸标签或镍、GST或谷胱甘肽等选择。在它们之中，作为捕获体，也优选与标签特异性地结合的抗体。这样的抗体可为市售的抗体，也可为由在现有技术中公知的方法制作的抗体。抗体可为单克隆抗体，也可为多克隆抗体。抗体的来源及同种型不特别限定，与对于抗HDL抗体记述的同样。另外，也可使用抗体的片段及其衍生物，例如，可举出Fab片段、F(ab')2片段等。

[0129] 标记物质可使用其自体发生信号的物质(以下，也称为“信号发生物质”)、或催化其他物质的反应而发生能检测的信号的物质。作为信号发生物质，例示荧光物质、放射性同位元素等。作为催化其他物质的反应而发生能检测的信号的物质，例示酶。作为酶，可举出过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、酪氨酸酶、酸性磷酸酶、荧光素酶等。作为荧光物质，可举出异硫氰酸荧光素(FITC)、若丹明、Alexa Fluor(注册商标)、花青苷系染料等的荧光染料、GFP等的荧光蛋白质等。作为放射性同位元素，可举出125I、14C、32P等。在它们之中，作为标记物质，也优选酶，特别优选过氧化物酶及碱性磷酸酶。

[0130] 在优选的实施方式中，通过将标记物质经与标签特异性地结合的捕获体与复合物间接结合，对该复合物进行标记。例如，可举出使与标记物质结合的捕获体结合于复合物，或者使标记物质结合于与复合物结合的捕获体。此时，可使用使标记物质预先结合的捕获体，也可使用可与捕获体特异性地结合的标记物质。

[0131] 使标记物质预先结合的捕获体，例如，可通过将与标签特异性地结合的捕获体用上述的标记物质标记得到。再者，物质的标记方法本身是在现有技术中公知的。当捕获体是抗体时，也可使用市售的标记试剂盒等标记。作为可与捕获体特异性地结合的标记物质，例如，可举出特异性地识别捕获体的标记抗体(第二抗体)等。

[0132] 在此标记工序中的温度及时间的条件不特别限定，例如，可将复合物、与标签特异性地结合的捕获体和标记物质的混合物于4～60℃、优选为25～42℃温育1秒钟～24小时、优选为10分钟～2小时。温育之间、混合物可为静置，也可为搅拌或振荡。

[0133] 在在本实施方式中，上述的标记工序和后述的检测工序之间，也可进行除去未结合于复合物的未反应的游离成分的B/F分离。作为未反应的游离成分，例如，可举出未与标签结合的游离的捕获体、未与捕获体结合的游离的标记物质等。B/F分离的手段不特别限定，与对于在上述的复合物的形成工序和后述的标记工序之间进行的B/F分离记述的同样。

[0134] 在本实施方式涉及的测定方法中，检测由与复合物结合的标记物质发生的信号。其中，“检测信号”包括，定性检测信号的有无，对信号强度进行定量，及将信号的强度如“不发生信号”、“弱”、“强”等一样以多个阶段半定量检测。由于此信号反映被脂蛋白质负载的附加了标签的胆甾醇的量，该信号的检测结果成为脂蛋白质的胆甾醇负载能力的指标。从而，上述的测定方法也可称为基于从负载了附加了标签的胆甾醇的脂蛋白质和抗脂蛋白质抗体的复合物发生的信号，评价脂蛋白质的胆甾醇负载能力的方法。

[0135] 检测由标记物质发生的信号的方法本身是在现有技术中公知的。在本实施方式中，可根据来源于上述的标记物质的信号的种类选择适合的测定方法。例如，当标记物质是酶时，可通过使用公知的装置测定通过使对于该酶的底物反应而发生的光、色等的信号进行。作为这样的测定装置，可举出分光光度计、发光计等。

[0136] 酶的底物可根据该酶的种类从公知的底物适宜选择。例如，当作为酶使用的过氧化物酶时，作为底物，可举出亮氨醇及其衍生物等的化学发光底物、2,2'-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸铵)(ABTS)、1,2-亚苯基二胺(OPD)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)等的显色基质。另外，当作为酶使用碱性磷酸酶时，作为底物，可举出CDP-Star(注册商标)(4-氯-3-(甲氧基螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,2'-(5'-氯)三环[3.3.1.13,7]癸烷]-4-基)苯基磷酸2钠)、CSPD(注册商标)(3-(4-甲氧基螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,2-(5'-氯)三环[3.3.1.13,7]癸烷]-4-基)苯基磷酸2钠)等的化学发光基质、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(BCIP)、5-溴-6-氯-吲哚基磷酸2钠、p-硝基苯基磷酸等的显色基质。

[0137] 当标记物质是放射性同位素时，可使用闪烁计数器等的公知的装置测定作为信号的放射线。另外，当标记物质是荧光物质时，可使用荧光酶标仪等的公知的装置测定作为信号的荧光。再者，激发波长及荧光波长可根据使用的荧光物质的种类适宜决定。

[0138] 在进一步的的实施方式中，也可在受试者是脂质异常症与否的判断中利用在上述的测定方法中得到的脂蛋白质的胆甾醇负载能力的结果。即提供包括以下的工序的辅助脂质异常症的判断的方法：

[0139] 通过使从受试者得到的试样中的脂蛋白质、附加了标签的胆甾醇和特异性地结合于脂蛋白质的抗体接触，形成含该负载了附加了标签的胆甾醇的脂蛋白质和上述抗体的复合物的工序，

[0140] 通过使特异性地结合于上述标签的捕获体和标记物质结合于上述复合物，对复合物进行标记的工序，

[0141] 检测由结合于上述复合物的标记物质发生的信号的工序，及

[0142] 基于检测结果，取得关于上述的受试者的脂质异常的信息的工序。

[0143] 通过蓄积由上述的测定方法从健康者及脂质异常症患者的试样得到的信号测定值的数据，可定关于脂蛋白质的胆甾醇负载能力的阈值或基准范围。进而，通过对其阈值或基准范围和使用受试者的受试体时的信号测定值进行比较，可取得关于该受试者的脂质异常的信息、即，受试者的脂蛋白质的胆甾醇负载能力是正常或基准的范围内与否的信息。基于此信息，可辅助受试者是脂质异常症与否的判断。

[0144] 在本发明的范围中，也含在上述的测定方法中使用的试剂盒。即，提供含附加了标签的胆甾醇和特异性地结合于脂蛋白质的抗体(抗脂蛋白质抗体)、与标签特异性地结合的捕获体和标记物质的脂蛋白质的胆甾醇负载能力测定用试剂盒(以下，也简称为“试剂盒”)。当标记物质是酶时，本实施方式的试剂盒也可还含对于该酶的底物。

[0145] 附加了标签的胆甾醇、抗脂蛋白质抗体、与标签特异性地结合的捕获体、标记物质、及底物的形态不特别限定，可为固体(例如，粉末、结晶、冷冻干燥品等)，也可为液体(例如，溶液、悬浮液、乳浊液等)。在本实施方式中，附加了标签的胆甾醇、抗脂蛋白质抗体、与标签特异性地结合的捕获体、标记物质、及底物优选保存在各自不同的容器或个别地包装。再者，试样、附加了标签的胆甾醇、特异性地结合于脂蛋白质的抗体、与标签特异性地结合的捕获体、标记物质及酶的底物的种类、以及这些处理等的细节与对于上述的测定方法的说明中所述的同样。图3A显示本实施方式的试剂盒的外观的一例。图中，11表示收容附加了标签的胆甾醇的第1容器，22表示收容抗脂蛋白质抗体的第2容器，33表示收容与标签特异性地结合的捕获体的第3容器，44表示收容作为标记物质的酶的第4容器，55表示收容对于酶的化学发光底物的第5容器。

[0146] 上述的试剂盒也可还含用于使抗脂蛋白质抗体固定化的固相。此时，附加了标签的胆甾醇、抗脂蛋白质抗体、与标签特异性地结合的捕获体、标记物质、底物和固相优选储存在各自不同的容器或个别地包装。图3B显示含固相的试剂盒的外观的一例。再者，对于固相的细节与在对于上述的测定方法的说明中叙述的同样。图中，66表示作为固相的96孔微平板。

[0147] 在本实施方式中，也可将抗脂蛋白质抗体、优选为抗ApoAI抗体预先固定化于固相。此时，试剂盒可成为含附加了标签的胆甾醇、与标签特异性地结合的捕获体、标记物质、底物、固定化了抗脂蛋白质抗体的固相的构成。图3C显示所述试剂盒的外观的一例。图中，11表示收容附加了标签的胆甾醇的第1容器，22表示收容与标签特异性地结合的捕获体的第2容器，33表示收容作为标记物质的酶的第3容器，44表示收容对于酶的化学发光底物的第4容器，66表示使与脂蛋白质结合的抗体固定化的固相(96孔微平板)。

[0148] 在本实施方式中，也可将标记物质预先结合于与标签特异性地结合的捕获体(得到的捕获体也称为“标记捕获体”)。此时，试剂盒可成为含附加了标签的胆甾醇、抗脂蛋白质抗体、标记捕获体和底物和固相的构成。图3D显示所述试剂盒的外观的一例。图中，11表示收容附加了标签的胆甾醇的第1容器，22表示收容抗脂蛋白质抗体的第2容器，33表示收容作为标记物质结合酶的捕获体的第3容器，44表示收容对于酶的化学发光底物的第4容器，66表示固相(96孔微平板)。

[0149] 再者，也可将抗脂蛋白质抗体、优选为抗ApoAI抗体预先固定化于固相。此时，试剂盒成为含附加了标签的胆甾醇、标记捕获体、底物、固定化了抗脂蛋白质抗体的固相的构成。图3E显示所述试剂盒的外观的一例。图中，11表示收容附加了标签的胆甾醇的第1容器，22表示收容作为标记物质结合酶的捕获体的第2容器，33表示收容对于酶的化学发光底物的第4容器，66表示使与脂蛋白质结合的抗体固定化的固相(96孔微平板)。

[0150] 在图3F中，示作为固相使用粒子时的试剂盒的外观的一例。图中示收容附加了标签的胆甾醇的第1容器，22表示收容作为标记物质结合酶的捕获体的第2容器，33表示收容有固定化了与脂蛋白质结合的抗体的粒子的第3容器，44表示收容对于酶的化学发光底物的第4容器。

[0151] 上述的试剂盒也可根据需要，作为各自个别的试剂还含用于稀释试样的水性介质、封闭剂、用于胆甾醇的酯化的脂肪酸或含其的组合物、及氧化剂等。再者，对于这些细节与在对于上述的测定方法的说明中叙述的同样。

[0152] 收容上述的试剂的容器及固相可收容到箱中而向使用者提供。此箱可为同装全部上述的试剂及固相，也可为收容仅一部分。在此箱中，也可再同装记载了试剂的使用方法等的附带文书。

[0153] 在本发明的范围中，也包括为了脂蛋白质的胆甾醇负载能力测定用试剂盒的制造而使用上述的各种试剂。即，本发明也涉及用于脂蛋白质的胆甾醇负载能力测定用试剂盒的制造的，附加了标签的胆甾醇、特异性地结合于脂蛋白质的抗体(抗脂蛋白质抗体)、与标签特异性地结合的捕获体、及标记物质的使用。当标记物质是酶时，也可还使用对于该酶的底物。另外，也可还使用固相。抗脂蛋白质抗体也可处于固定于固相的状态。

[0154] 在本发明的范围中，也含附加了标签的胆甾醇。即，提供由下述的式(III)表示的附加了标签的胆甾醇：

[0155] 【化11】

[0156]

[0157] (式中，R1是任选有甲基的碳原子数1～6的亚烷基，

[0158] X及Y相同或不同，其表示-R2-NH-、-NH-R2-、-R2-(C＝O)-NH-、-(C＝O)-NH-R2-、-R2-NH-(C＝O)-、-NH-(C＝O)-R2-、-R2-(C＝O)-、-(C＝O)-R2-、-R2-(C＝O)-O-、-(C＝O)-O-R2-、-R2-O-(C＝O)-、-O-(C＝O)-R2-、-R2-(C＝S)-NH-、-(C＝S)-NH-R2-、-R2-NH-(C＝S)-、-NH-(C＝S)-R2-、-R2-O-、-O-R2-、-R2-S-、或者-S-R2-，其中，R2各自独立地是：连键、任选有取代基的碳原子数1～10的亚烷基、任选有取代基的碳原子数6～12的亚芳基或杂亚芳基、或者，任选有取代基的碳原子数3～8的环亚烷基或杂环亚烷基，

[0159] L表示-(CH2)d-[R3-(CH2)e]f-、或者-[(CH2)e-R3]f-(CH2)d-，其中，R3是：氧原子、硫原子、-NH-、-NH-(C＝O)-或-(C＝O)-NH-，

[0160] TAG是标签，

[0161] a及c相同或不同，是0～6的整数，

[0162] b是0或1，

[0163] d及e相同或不同，是0～12的整数，

[0164] f是0～24的整数。)。

[0165] 此附加了标签的胆甾醇适宜于在上述的本实施方式的测定方法中使用。再者，对于式(III)所表示的附加了标签的胆甾醇的细节而言，与在本实施方式的测定方法中叙述的同样。

[0166] 接下来，将本发明由实施例详细地说明，但本发明不限于这些实施例。【实施例】

[0167] 【实施例1】

[0168] 在实施例1中，通过在固相上形成被HDL负载的附加了标签的胆甾醇和HDL捕获用抗体的复合物，检测被HDL负载的附加了标签的胆甾醇的所述标签，探讨可测定HDL的胆甾醇负载能力与否。

[0169] (1.1)HDL级分的负载

[0170] 向健康者(n＝3)的血清(0.1ml)混合等量的22％聚乙二醇4000(和光纯药工业株式会社)而得到悬浮液。将得到的悬浮液于室温静置20分钟之后，以3000rpm于室温离心分离15分钟。进而，以上清作为HDL级分回收。将从3名健康者的血清得到的HDL级分混合，将得到的混合物(以下，也称为“正常受试体”)于4℃保存。另外，对于脂质异常症的患者(n＝4)的血清，也同样地处理而回收HDL级分。将从4名的患者的血清得到的HDL级分混合，将得到的混合物(以下，也称为“异常受试体”)于4℃保存。在本实施例1中，以这样得的正常受试体及异常受试体作为生物体试样，在以下的操作中使用。

[0171] (1.2)在固相上的HDL和抗ApoAI抗体的复合物的形成

[0172] (i)测定用板的准备(抗ApoAI抗体向固相的固定化)

[0173] 向作为固相的96孔微平板(荧光测定用黑色板H、住友Bakelite株式会社制)的各孔各添加200μl的50mM Tris-HCl(pH 7.5)而进行清洗。合计进行2次此清洗操作。向各孔各添加100μl用50mM Tris-HCl(pH 7.5)稀释至10μg/ml的浓度的抗ApoAI抗体(clone 1C5、Cat.No.MONO5030、SANBIO公司)的溶液，于4℃静置一晚以上。除去抗体溶液，向各孔各添加200μl的PBS而进行清洗。合计进行3次此清洗操作。向各孔各添加200μl的2％BSA/PBS，于25℃以600rpm振荡2小时。

[0174] (ii)测定用试样的调制(HDL和附加了标签的胆甾醇的接触)

[0175] 从上述的正常受试体及异常受试体各自取一部分，使用ApoAI测定用试剂盒(N-测定TIA ApoAI-H、NITTOBO MEDICAL株式会社)而测定ApoAI浓度。ApoAI浓度是，正常受试体是883μg/ml，异常受试体是691μg/ml。再者，浓度测定的具体的操作根据该试剂盒附带的手册进行。测定后，将正常受试体及异常受试体用反应缓冲液(含2％BSA及2mM脂质体(日本精化株式会社制)的PBS)稀释而调制ApoAI浓度是0.05、0.1或0.3μg/ml的含有HDL级分的稀释液。作为另外，使用不含HDL级分的对照受试体(ApoAI浓度0μg/ml)，反应缓冲液。再者，反应缓冲液中所含的脂质体的组成是2mM二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、2mM胆甾醇及4mM氢加成大豆磷脂酰胆碱(HSPC)。使磷酸缓冲盐片(Sigma-Aldrich公司)溶解于水而调制PBS。

[0176] 向反应缓冲液添加0.5mM附加了BODIPY的胆甾醇(TopFluor Cholesterol、AvantiPolar Lipids公司)至成为终浓度5μM之后，再者以整体量的1/100的量添加上述的含有HDL级分的稀释液。将得到的混合物于37℃以800rpm振荡2小时。向得到的混合液添加氧化剂(8.8M过氧化氢、1.76mM亚硝酸钠及0.86mM二亚乙基三胺五醋酸(DTPA))。在添加氧化剂的溶液中的各成分的终浓度是，过氧化氢是1M、亚硝酸钠是200μM、DTPA是100μM。将这些溶液于37℃以800rpm振荡1小时，得到含使负载附加了BODIPY的胆甾醇的HDL的测定用试样。

[0177] (iii)负载胆甾醇的HDL和抗ApoAI抗体的复合物的形成

[0178] 从固定化了抗ApoAI抗体的板除去BSA溶液，向各100μl孔添加各测定用试样。进而，将板于25℃以600rpm振荡1小时，使HDL和抗ApoAI抗体的复合物形成。再者，在本实施例1中，调制2个捕获这样复合物的板。

[0179] (1.3)捕获的复合物的量的测定及由HDL的胆甾醇负载的确认

[0180] 在上述(1.2)中调制的2个板之中的1个中，向各孔各添加100μl的10mM环糊精/PBS，该将板于25℃以600rpm振荡30分钟。进而，将荧光强度用荧光板读取器(Infinite(注册商标)200Pro、TECAN公司制)测定(激发光485nm/荧光535nm)。从测定后的板除去环糊精溶液，将各孔用PBS清洗3次。将ApoAI测定用试剂盒(N-测定TIA ApoAI-H、NITTOBO MEDICAL株式会社)的山羊抗ApoAI血清用封闭缓冲液(StartingBlock、Thermo Scientific公司)稀释1000倍，向各孔各添加100μl的得到的稀释液。将板于25℃以600rpm振荡1小时之后，除去稀释液，将各孔用PBS清洗3次。将HRP标记兔抗山羊IgG多克隆抗体(P0449、Dako公司)用封闭缓冲液(StartingBlock、Thermo Scientific公司)稀释1000倍，向各孔各添加100μl的得到的稀释液。将板于25℃以600rpm振荡1小时之后，除去稀释液，将各孔用PBS清洗5次。向各孔各添加100μl的化学发光底物溶液(SuperSignal  ELISA  Pico、37069、Thermo Scientific公司)。将板于25℃以600rpm振荡2分钟之后，将发光量用酶标仪(Infinite(注册商标)F200Pro、TECAN公司制)测定。

[0181] (1.4)由化学发光的，被HDL负载的胆甾醇量的测定

[0182] 在上述(1.2)中调制的2个板之中，将其余的1个用PBS清洗5次。将兔抗BODIPY抗体(BODIPY FL Rabbit IgG Fraction、A-5770、Lifetechnologies公司)用PBS稀释100倍，向各孔各添加100μl的得到的稀释液。将板于25℃以600rpm振荡1小时之后，除去稀释液，将各孔用PBS清洗5次。将HRP标记山羊抗兔IgG多克隆抗体(P0448、Dako公司)用封闭缓冲液(StartingBlock、Thermo Scientific公司)稀释1000倍，向各孔各添加100μl的得到的稀释液。将板于25℃以600rpm振荡1小时之后，除去稀释液，将各孔用PBS清洗5次。向各孔各添加100μl的化学发光底物溶液(SuperSignal ELISA Pico、37069、Thermo Scientific公司)。
将板于25℃以600rpm振荡2分钟之后，将发光量用酶标仪(Infinite(注册商标)F200Pro、TECAN公司制)测定。

[0183] (1.5)测定结果及考察

[0184] 上述(1.3)的夹心ELISA法的结果示于图1。如图1所示，被使抗ApoAI抗体固定化的板捕获的复合物的量依赖于测定用试样的ApoAI浓度而增加。捕获的复合物的量在正常受试体和异常受试体之间未确认大的差异。另外，从捕获的复合物中的BODIPY发生的荧光的强度随捕获的复合物的量而升高(未图示)。从而，可确认附加了BODIPY的胆甾醇被HDL负载。再者，在正常受试体中的HDL的胆甾醇负载量与异常受试体比高2倍以上。

[0185] 上述(1.4)的夹心ELISA法的结果示于图2。图2的坐标图表示从正常受试体或异常受试体来源的含有HDL级分的稀释液的发光量的平均值减去对照受试体的发光量的平均值(背景)的值。如图2所示，测定的发光量随捕获的复合物的量而升高。另外，在正常受试体中的HDL的胆甾醇负载量与异常受试体比高约2倍。结果是与从被HDL负载的附加了BODIPY的胆甾醇发生的荧光的测定结果同样。从而示，HDL的胆甾醇负载能力也可通过使HDL负载附加了标签的胆甾醇，检测露出到该HDL的外表面的标签来测定。

[0186] 【实施例2】

[0187] 在实施例2中，经作为接头的PEG调制附加生物素的胆甾醇。再者，接下来示附加了生物素的胆甾醇的合成方案。

[0188] 【化12】(第1步骤)

[0189]

[0190] (第2步骤)

[0191]

[0192] (第3步骤)

[0193]

[0194] 将0.05mmol的3β-羟基-Δ5-胆烯酸(东京化成工业株式会社)和0.075mmol的水溶性碳二亚胺(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、同仁化学研究所)溶解于0.5ml的N,N-二甲基甲酰胺(以下，也称为“DMF”，和光纯药株式会社)，在室温、氩气氛下搅拌50分钟(第1步骤)。向得到的反应液添加将0.075mmol的N-羟基琥珀酰亚胺(Sigma公司)溶解于100μl的DMF的溶液，在室温、氩气氛下搅拌24小时(第2步骤)。将出发物质(3β-羟基-Δ5-胆烯酸)的溶液、在第1步骤中得到的反应液、及在第2步骤中得到的反应液各自点斑于硅胶板，用展开溶剂(己烷：四氢呋喃(THF)＝5:5)展开。出发物质的Rf值是0.6，第1步骤的生成物的Rf值是0.55，第2步骤的生成物的Rf值是0.5。

[0195] 向在第2步骤中得到的反应液添加将0.075mmol的生物素-PEG4-胺(Biovision公司)溶解于100μl的DMF的溶液，在室温、氩气氛下搅拌72小时以上(第3步骤)。将在第2步骤中得到的反应液、在第3步骤中得到的反应液、及它们的混合液各自点斑于硅胶板，用展开溶剂(氯仿:甲醇:THF＝9:1:1)展开。第3步骤的生成物(附加了生物素的胆甾醇)的Rf值是0.3。由薄层层析分取法回收附加了生物素的胆甾醇。

[0196] 【实施例3】

[0197] 使用实施例1的附加了BODIPY的胆甾醇和实施例2的附加了生物素的胆甾醇而测定由HDL的胆甾醇负载能力，探讨在附加了标签的胆甾醇中的接头的效果。

[0198] (3.1)试样

[0199] 作为含HDL级分的试样在，使用实施例1中调制的异常受试体。

[0200] (3.2)在固相上的HDL和抗ApoAI抗体的复合物的形成

[0201] (i)测定用板的准备

[0202] 与实施例1同样地，向96孔微平板固定化抗ApoAI抗体，准备测定用板。

[0203] (ii)测定用试样的调制

[0204] 将异常受试体用反应缓冲液(PBS)稀释，调制ApoAI浓度是0.1μg/ml的含有HDL级分的稀释液。另外，作为不含HDL级分的对照受试体(ApoAI浓度0μg/ml)，使用反应缓冲液。再者，使磷酸缓冲盐片(Sigma-Aldrich公司)溶解于水而调制PBS。向反应缓冲液添加0.5mM附加了生物素的胆甾醇至成为终浓度5μM之后，再者以整体量的1/100的量添加上述的含有HDL级分的稀释液。将得到的混合物于37℃以800rpm振荡2小时，得到含使负载附加了生物素的胆甾醇的HDL的测定用试样。

[0205] (iii)负载胆甾醇的HDL和抗ApoAI抗体的复合物的形成

[0206] 从固定化了抗ApoAI抗体的板除去BSA溶液，添加各200μl的PBS而进行清洗。合计进行3次此清洗操作。向各100μl孔添加各测定用试样，将板于25℃以600rpm振荡1小时，使HDL和抗ApoAI抗体的复合物形成。再者，在实施例3中，调制1个捕获这样复合物的板。

[0207] (3.3)利用化学发光的被HDL负载的胆甾醇量的测定

[0208] 将在上述(3.2)中调制的板用PBS清洗5次。将HRP标记链霉亲和素(N100,Life technologies公司)用封闭缓冲液(StartingBlock、Thermo Scientific公司)稀释3000倍，向各孔各添加100μl的得到的稀释液。将板于25℃以600rpm振荡1小时之后，除去稀释液，将各孔用PBS清洗5次。向各孔各添加100μl的化学发光底物溶液(SuperSignal ELISA Pico、37069、Thermo Scientific公司)。将板于25℃以600rpm振荡2分钟之后，将发光量用酶标仪(Infinite(注册商标)F200Pro、TECAN公司制)测定。

[0209] (3.4)捕获的复合物的量的测定

[0210] 上述(3.3)的测定之后，向各孔各添加200μl的PBS而进行清洗。合计进行3次此清洗操作。将ApoAI测定用试剂盒(N-测定TIA ApoAI-H、NITTOBO MEDICAL株式会社)的山羊抗ApoAI血清用封闭缓冲液(StartingBlock、Thermo Scientific公司)稀释1000倍，向各孔各添加100μl的得到的稀释液。将板于25℃以600rpm振荡1小时之后，除去稀释液，将各孔用PBS清洗3次。将HRP标记兔抗山羊IgG多克隆抗体(P0449、Dako公司)用封闭缓冲液(StartingBlock、Thermo Scientific公司)稀释1000倍，向各孔各添加100μl的得到的稀释液。将板于25℃以600rpm振荡1小时之后，除去稀释液，将各孔用PBS清洗5次。向各孔各添加100μl的化学发光底物溶液(SuperSignal ELISA Pico、37069、Thermo Scientific公司)。
将板于25℃以600rpm振荡2分钟之后，将发光量用酶标仪(Infinite(注册商标)F200Pro、TECAN公司制)测定。

[0211] (3.5)测定结果

[0212] 可由上述(3.4)的测定结果，确认在板上形成含HDL及抗ApoAI抗体的复合物(未图示)。上述(3.3)的测定结果示于表1及图4。再者，在表1及图4中，为了比较，对比实施例1的异常受试体来源的含有HDL级分的稀释液(ApoAI浓度0.1μg/ml)及在对照受试体中的HDL的附加了BODIPY的胆甾醇负载量的数据。表1示异常受试体来源的含有HDL级分的稀释液及在对照受试体中的发光量的平均值(RLU)及SD的值。图4的坐标图表示从异常受试体来源的含有HDL级分的稀释液的发光量的平均值减去对照受试体的发光量的平均值(背景)的值。表1中，“BODIPY”表示附加了BODIPY的胆甾醇，“PEG4-生物素”表示在实施例2中调制的附加了生物素的胆甾醇，“异常受试体”表示异常受试体来源的含有HDL级分的稀释液(ApoAI浓度0.1μg/ml)。图4中，“无接头”表示附加了BODIPY的胆甾醇，“有接头”表示附加了生物素的胆甾醇。

[0213] 【表1】

[0214]

[0215] 如表1及图4所示，如果使用有接头的附加了生物素的胆甾醇，则可相对于背景，得到更高的发光量。从而示，在本实施方式的测定方法中，与附加了BODIPY的胆甾醇同样地，使用有接头的附加了生物素的胆甾醇，也能测定脂蛋白质的胆甾醇负载能力。

[0216] 【实施例4】

[0217] 调制各种各样的长度的PEG经接头附加生物素的胆甾醇。使用这些附加了生物素的胆甾醇和实施例1的附加了BODIPY的胆甾醇而测定由HDL的胆甾醇负载能力。

[0218] (4.1)附加了生物素的胆甾醇的调制

[0219] 在实施例2的第3步骤中，除了代替生物素-PEG4-胺而使用EZ-Link(商标)胺-PEG2-生物素(Life technologies公司)、生物素-PEG7-胺(BroadPharm公司)、O-(2-氨基乙基)-O'-[2-(生物素基氨基)乙基]八乙二醇(Sigma Ardrich公司)、或者EZ-Link(商标)胺-PEG11-生物素(Life technologies公司)0.075mmol以外，与实施例2同样地，调制PEG接头的长度的不同的附加了生物素的胆甾醇。得到的附加了生物素的胆甾醇各自对应于在上述的式(V)中n是2、7、9及11的附加了标签的胆甾醇。

[0220] 另外，根据下述的合成方案，调制在上述的式(V)中n是3的附加了生物素的胆甾醇。具体而言，使4.2μmol的24-氨基-5-胆烯-3β-醇(委托株式会社NARD研究所合成)和5.0μmol的生物素-PEG3-NHS ester(BPS Bioscience公司)溶解于100μl的DMSO(和光纯药工业株式会社)，在室温、氩气氛下搅拌72小时。将得到的反应液点斑于硅胶板，由薄层层析分取法回收附加了生物素的胆甾醇。

[0221] 【化13】

[0222]

[0223] 在实施例4中，将附加了生物素的胆甾醇，根据PEG接头的长度，各自也称为PEG2-生物素、PEG3-生物素、PEG4-生物素、PEG7-生物素、PEG9-生物素及PEG11-生物素。各附加了生物素的胆甾醇的Rf值及在薄层层析分取法中使用的展开溶剂示于表2。

[0224] 【表2】

[0225]附加了生物素的胆甾醇 展开溶剂 Rf值
PEG2-生物素 氯仿:甲醇＝8:2 0.7
PEG3-生物素 氯仿:甲醇:THF＝9:2:1 0.45
PEG4-生物素 氯仿:甲醇:THF＝9:1:1 0.3
PEG7-生物素 氯仿:甲醇:THF＝9:1:1 0.25
PEG9-生物素 氯仿:甲醇:THF＝6:2:4 0.25
PEG11-生物素 氯仿:甲醇:THF＝9:1:1 0.2

[0226] (4.2)试样

[0227] 作为含HDL级分的试样，使用在实施例1中调制的异常受试体。

[0228] (4.3)在固相上的HDL和抗ApoAI抗体的复合物的形成

[0229] (i)测定用板的准备

[0230] 与实施例1同样地，向96孔微平板固定化抗ApoAI抗体，准备测定用板。

[0231] (ii)测定用试样的调制

[0232] 与实施例1同样地，使用附加了BODIPY的胆甾醇，从异常受试体调制测定用试样。与实施例3同样地，使用PEG2-生物素、PEG3-生物素、PEG4-生物素、PEG7-生物素、PEG9-生物素及PEG11-生物素的各自，从异常受试体调制测定用试样。

[0233] (iii)负载胆甾醇的HDL和抗ApoAI抗体的复合物的形成

[0234] 与实施例3同样地，在板上形成HDL和抗ApoAI抗体的复合物。再者，在实施例4中，调制1个捕获这样复合物的板。

[0235] (4.4)被HDL负载的胆甾醇量及捕获的复合物的量的测定

[0236] 对于附加了BODIPY的胆甾醇与实施例1同样地，使用兔抗BODIPY抗体及HRP标记山羊抗兔IgG多克隆抗体由化学发光测定被HDL负载的胆甾醇量。对于附加了生物素的胆甾醇与实施例3同样地，使用HRP标记链霉亲和素由化学发光测定被HDL负载的胆甾醇量。捕获的复合物的量与实施例3同样地测定。

[0237] (4.5)测定结果

[0238] 由捕获的复合物的量的测定结果，可确认在板上形成含HDL及抗ApoAI抗体的复合物。被HDL负载的胆甾醇量的测定结果示于表3。表3示异常受试体来源的含有HDL级分的稀释液及在对照受试体中的发光量的平均值(RLU)及SD的值。表3中，“BODIPY”表示附加了BODIPY的胆甾醇，“异常受试体”表示异常受试体来源的含有HDL级分的稀释液(ApoAI浓度0.1μg/ml)。

[0239] 【表3】

[0240]

[0241] 如表3所示，使用有任何的长度的PEG接头的附加了生物素的胆甾醇，也可得到相对于背景高的发光量。从而示，在本实施方式的测定方法中，与附加了BODIPY的胆甾醇同样地，使用有各种各样的长度的接头的附加了生物素的胆甾醇，也能测定脂蛋白质的胆甾醇负载能力。

[0242] 【实施例5】

[0243] 在实施例5中，作为标签调制附加DNP的胆甾醇。使用DNP附加胆甾醇和实施例1的附加了BODIPY的胆甾醇而测定由HDL的胆甾醇负载能力。测定由作为固相使用磁性粒子的ELISA法进行。

[0244] (5.1)DNP附加胆甾醇的调制

[0245] 与实施例2的第1步骤同样地，使3β-羟基-Δ5-胆烯酸和水溶性碳二亚胺溶解于DMF，在室温、氩气氛下反应。与实施例2的第2步骤同样地，向在第1步骤中得到的反应液添加溶解于DMF的N-羟基琥珀酰亚胺的溶液，在室温、氩气氛下反应。将在第1步骤中得到的反应液、及在第2步骤中得到的反应液各自点斑于硅胶板，用展开溶剂(己烷:醋酸乙基＝4:6)展开。第1步骤的生成物的Rf值是0.45，第2步骤的生成物的Rf值是0.5。

[0246] 在实施例2的第3步骤中，代替生物素-PEG4-胺而使用N1-(2,4-二硝基苯基)乙烷-1,2-二胺(Combi-Blocks公司)以外，与实施例2同样地，调制DNP附加胆甾醇。再者，在DNP附加胆甾醇的合成方案中的第3步骤如下所述。

[0247] 【化14】(第3步骤)

[0248]

[0249] 将在第2步骤中得到的反应液、在第3步骤中得到的反应液、及它们的混合液各自点斑于硅胶板，用展开溶剂(己烷:THF＝3:7)展开。第3步骤的生成物(DNP附加胆甾醇)的Rf值是0.7。由薄层层析分取法回收DNP附加胆甾醇。

[0250] (5.2)DNP附加胆甾醇的分析

[0251] 将回收的DNP附加胆甾醇用高效液相层析法(HPLC)分取纯化，将得到的纯化物由核磁共振法(NMR)及液相层析质谱分析法(LC-MS)分析。使用JNM-ECX400P(日本电子株式会1 13
社制)，将H-NMR光谱用400MHz测定，将 C-NMR光谱用100MHz测定。HPLC及LC-MS的测定条件如下所述。再者，由HPLC的纯化和由NMR及LC-MS的分析委托株式会社NARD研究所。

[0252] (HPLC)

[0253] 装置：LC-2010(株式会社岛津制作所制)

[0254] 柱：Kinetex(注册商标)5μm EVO C18 100A 4.6×150mm(株式会社岛津GLC制)[0255] 柱温度：40℃

[0256] 流速：1mL/min

[0257] 移动相A：1mM磷酸缓冲液(pH 7.4)

[0258] 移动相B：乙腈(MeCN)

[0259] 【表4】梯度条件

[0260]时间(分) 移动相A(％) 移动相B(％)
0.00 90.0 10.0
7.00 0.00 100
15.0 0.00 100
20.0 90.0 10.0

[0261] (LC-MS)

[0262] 装置

[0263] MS检测器：waters 3100Mass Detector(Waters公司制)

[0264] FAD检测器：waters 2996Photodiode Array Detector(Waters公司制)[0265] ELSD：waters 2424ELS Detector(Waters公司制)

[0266] 泵：waters 2545Binary Gradient Module(Waters公司制)

[0267] SFO：waters SFO System Fluidics Organizer(Waters公司制)

[0268] 柱：Atlantis(注册商标)3.5μm 4.6×50mm(Waters公司制)

[0269] 柱温度：室温

[0270] 流速：2mL/min

[0271] 移动相A：0.1％三氟醋酸(TFA)水溶液

[0272] 移动相B：MeCN

[0273] 【表5】梯度条件

[0274]时间(分) 移动相A(％) 移动相B(％)
0.00 95.0 5.00
0.50 95.0 5.00
3.00 5.00 95.0
5.00 5.00 95.0

[0275] 离子化法：ESI(电子喷雾离子化)法

[0276] Mass电压：30V

[0277] 正模式

[0278] 接下来示NMR及LC-MS的测定结果。从这些结果得知，得到了由式(VI)表示的DNP附加胆甾醇。

[0279] LC-MS m/z 583.7[M+H]+

[0280] 1H-NMR(CDCl3)δ：9.14(1H,d,J＝2.3Hz),8.74(1H,s),8.30(1H,dd,J＝9.4,2.5Hz),7.11(1H,d,J＝9.6Hz),5.83-5.72(1H,br m),5.35(1H,d,J＝5.0Hz),3.66-3.47(5H,m),2.29-2.23(3H,m),2.15-2.07(1H,m),2.00-1.94(2H,m),1.89-1.75(4H,m),1.53-
1.23(10H,m),1.19-0.88(12H,m),0.66(3H,s)。

[0281] 13C-NMR(CDCl3)δ：174.8(C),148.4(C),140.7(C),136.4(C),133.7(C),130.5(CH),124.3(CH),121.6(CH),114.0(CH),71.8(CH),56.7(CH),55.7(CH),50.0(CH),43.0(CH2),42.4(CH2),42.3(C),39.7(CH2),38.5(CH2),37.2(CH2),36.5(C),35.5(CH),33.4(CH2),31.9(CH),31.8(CH2),31.6(CH2),28.2(CH2),24.2(CH2),22.9(CH),21.0(CH),19.4(CH3),18.4(CH3),11.8(CH3)。

[0282] (5.3)在固相上的HDL和抗ApoAI抗体的复合物的形成

[0283] (i)测定用试样的调制

[0284] 将实施例1的异常受试体用反应缓冲液(PBS)稀释，调制ApoAI浓度是0.2μg/ml的含有HDL级分的稀释液。另外，作为不含HDL级分的对照受试体(ApoAI浓度0μg/ml)，使用反应缓冲液。再者，使磷酸缓冲盐片(Sigma-Aldrich公司)溶解于水而调制PBS。向反应缓冲液添加0.5mM DNP附加胆甾醇或0.5mM附加了BODIPY的胆甾醇(TopFluor Cholesterol、AvantiPolar Lipids公司)至成为终浓度5μM之后，再者以整体量的1/100的量添加上述的含有HDL级分的稀释液。将得到的混合物于37℃以800rpm振荡2小时，得到测定用试样。

[0285] (ii)负载胆甾醇的HDL和抗ApoAI抗体的复合物的形成

[0286] 取30μl测定用试样，移到别的管。其中，添加30μl的2.5ng/μl生物素化ApoAI抗体(将抗ApoA1抗体(SANBIO公司)用2-巯基乙基胺盐酸盐(NACALAI TESQUE)还原，用生物素-PEAC5-马来酰亚胺(Dojindo)标记而得到)，于42℃反应12分钟。其中，添加30μl的HISCL磁性粒子(Sysmex株式会社)，于42℃反应10分钟。通过在HISCL磁性粒子的表面固定亲和素，复合物中的生物素化抗ApoAI抗体与磁性粒子的表面结合。对反应液中的磁性粒子进行集磁而除去上清，添加HISCL线清洗液(Sysmex株式会社)，清洗磁性粒子。还进行2次此清洗操作。进而，对磁性粒子进行集磁而除去上清。

[0287] (5.4)由化学发光的，被HDL负载的胆甾醇量的测定

[0288] (i)DNP附加胆甾醇量的测定

[0289] 向有负载了DNP附加胆甾醇的HDL的磁性粒子添加100μl的333ng/μl ALP标记抗DNP抗体(将抗DNP抗体(委托北山LABES株式会社制作)使用ALP Labeling Kit-SH(Dojindo)进行ALP标记而得到)，于42℃反应10分钟。对反应液中的磁性粒子进行集磁而除去上清，添加HISCL线清洗液(Sysmex株式会社)，清洗磁性粒子。还进行2次此清洗操作。向别的管移磁性粒子，对磁性粒子进行集磁而除去上清。进而，添加50μl的HISCL发光底物(Sysmex株式会社)的R4试剂和添加100μl的R5试剂，于42℃反应5分钟。反应后，对磁性粒子进行集磁而向96孔板移上清，将发光量用酶标仪(Infinite(注册商标)F200Pro、TECAN公司制)测定。

[0290] (ii)附加了BODIPY的胆甾醇量的测定

[0291] 与实施例1同样地向有负载了附加了BODIPY的胆甾醇的HDL的磁性粒子添加100μl兔抗BODIPY抗体(Lifetechnologies公司)的稀释液，于25℃反应60分钟。对反应液中的磁性粒子进行集磁而除去上清，添加HISCL线清洗液(Sysmex株式会社)，清洗磁性粒子。还进行2次此清洗操作，对磁性粒子进行集磁而除去上清。向磁性粒子，与实施例1同样地添加100μl的HRP标记山羊抗兔IgG多克隆抗体(Dako公司)的稀释液，于25℃反应60分钟。反应后，进行3次由HISCL系清洗液(Sysmex株式会社)的磁性粒子的清洗。向别的管移磁性粒子，对磁性粒子进行集磁而除去上清。进而，添加100μl化学发光底物溶液(SuperSignal ELISA Pico、37069、Thermo Scientific公司)，于25℃反应2分钟。反应后，对磁性粒子进行集磁而向96孔板移上清，将发光量用酶标仪(Infinite(注册商标)F200Pro、TECAN公司制)测定。

[0292] (5.5)测定结果

[0293] 测定结果示于图5。如图5所示，使用附加了BODIPY的胆甾醇及DNP附加胆甾醇的任何，都可得到相对于背景高的发光量。表示在本实施方式的测定方法中，与附加了BODIPY的胆甾醇同样地，使用DNP附加胆甾醇，也能测定脂蛋白质的胆甾醇负载能力。

[0294] 本申请关于在2015年5月29日申请的日本国专利申请特愿2015-110510号、在2015年9月30日申请的日本国专利申请特愿2015-193648号、在2015年10月20日申请的日本国专利申请特愿2015-206422号及在2016年3月9日申请的日本国专利申请特愿2016-046069号，这些专利权利要求、说明书、附图及摘要的全部作为参照并入本说明书中。

[0295] 【符号的说明】

[0296] 11：第1容器

[0297] 22：第2容器

[0298] 33：第3容器

[0299] 44：第4容器

[0300] 55：第5容器

[0301] 66：固相(96孔微平板)