一种脆江蓠磷酸葡萄糖变位酶的蛋白及其编码基因和用途转让专利
申请号 : CN201810142310.5
文献号 : CN108374002B
文献日 : 2020-05-12
发明人 : 池姗 , 刘涛 , 刘翠
申请人 : 中国海洋大学
摘要 :
本发明公开了一种脆江蓠磷酸葡萄糖变位酶的蛋白及其编码基因和用途，所述脆江蓠磷酸葡萄糖变位酶的蛋白包括蛋白GchPGM1和蛋白GchPGM2，所述蛋白GchPGM的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，所述GchPGM2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示。本发明所述的脆江蓠磷酸葡萄糖变位酶的蛋白GchPGM1的编码基因GchPGM1，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。本发明有助于进一步深入了解和掌握海藻糖代谢途径、功能以及其在系统发育、环境适应等方面的作用；并以该基因为标记，筛选或选育海藻糖含量高的海藻，或过表达所述的基因，构建海藻糖含量高的基因工程海藻。
权利要求 :
1.一种脆江蓠磷酸葡萄糖变位酶的蛋白，其特征在于：所述脆江蓠磷酸葡萄糖变位酶的蛋白为蛋白GchPGM2，所述GchPGM2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示。
2.权利要求1所述的脆江蓠磷酸葡萄糖变位酶的蛋白GchPGM2的编码基因GchPGM2，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。
3.权利要求1所述的脆江蓠磷酸葡萄糖变位酶的蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)通过同源扩增的方法获得序列表SEQ ID NO.3所示的基因；
(2)构建能高效表达和纯化脆江蓠磷酸葡萄糖变位酶的蛋白的表达载体；
(3)根据引物设计时连入的酶切位点同时进行双酶切反应，连接获得含有目的片段的表达质粒；用所述表达载体转化宿主菌构建基因工程菌；
(4)利用所述工程菌表达纯化出目的蛋白；
(5)将提取到的蛋白样品进行Western杂交实验以确认纯化得到的蛋白是所需要的带His标签的目的蛋白；
(6)采用5U磷酸葡萄糖变位酶、1U 6-磷酸葡萄糖脱氢酶GDH酶解，质检制得脆江蓠磷酸葡萄糖变位酶的蛋白。
4.根据权利要求3所述的脆江蓠磷酸葡萄糖变位酶的蛋白的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，脆江蓠磷酸葡萄糖变位酶的蛋白的编码基因SEQ ID NO.3所示的基因的克隆：根据GenBank数据库已公布藻类基因序列结合1KP数据库调取序列用Primier Primer 5软件设计带酶切位点的特异性引物，设计引物3/引物4；引物3的5′端和引物4的3′端分别引入限制性酶切位点BamHI、NotI，是用于扩增单独GchPGM2基因的引物。
5.根据权利要求4所述的脆江蓠磷酸葡萄糖变位酶的蛋白的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，采用Touch-down的反应体系和反应程序进行目的片段扩增，反应程序为94℃预变性3分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸2分钟，以后每个循环依次降低1度，直到45℃，共15个循环，94℃变性30秒，45℃退火30秒，72℃延伸2分钟，20个循环，最后72℃延伸10分钟。
6.根据权利要求3所述的脆江蓠磷酸葡萄糖变位酶的蛋白的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，将PCR克隆获得脆江蓠磷酸葡萄糖变位酶的蛋白的编码基因GchPGM2克隆入原核表达载体pET32a；宿主菌为大肠杆菌E.coli Top 10。
7.根据权利要求6所述的脆江蓠磷酸葡萄糖变位酶的蛋白的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，采用DNA重组技术，将序列表SEQ ID NO：3所示的基因插入pET32a的BamHI、NotI位点中，获得重组表达载体GchPGM2-pET32a。
8.根据权利要求6所述的脆江蓠磷酸葡萄糖变位酶的蛋白的制备方法，其特征在于：在步骤(3)中，含有目的片段的表达质粒转化到E.coil BL21DE3感受态细胞中，经过PCR检测和测序获得带有目的基因的表达菌株，即为基因工程菌。
9.权利要求1至8任一项所述的脆江蓠磷酸葡萄糖变位酶为标记，筛选或选育海藻糖含量高的海藻，或过表达所述的基因，构建海藻糖含量高的基因工程海藻中的应用。
说明书 :
一种脆江蓠磷酸葡萄糖变位酶的蛋白及其编码基因和用途
技术领域
[0001] 本领域涉及藻类细胞工程学技术领域，尤其是涉及一种脆江蓠磷 酸葡萄糖变位酶的蛋白及其编码基因和用途。
背景技术
[0002] 海藻糖(Trehalose)普遍存在于细菌、真菌、昆虫、无脊椎动物、 植物等生物界中，在生物体中除了作为能源和碳源储藏外，还是一种 重要的抗逆保护物质，能够在多种包括干燥、脱水、高温或低温等胁 迫环境中保护蛋白和细胞膜免受损害(Elbein et al.,2003)。大型海藻 由于特殊、多样的潮间带生存环境，普遍具有高盐耐受性。在潮水涨 落间，其频繁地受高温、干晒、渗透冲击等极端条件胁迫下仍能保持 良好的生活力，其含有的海藻糖被认为是主要的抗逆物质(Kosmas SA et al,2006)。同时，在酵母和植物中，已有研究表明海藻糖可以 作为一种信号分子直接参于或调控某些重要的代谢通路，甚至能影响 生物生长。
[0003] PGM基因在自然界中广泛存在，且在不同物种中存在多个基因 拷贝。例如，人体中含有三种PGM基因(Whitehouse DB et al.,1998； Shackelford GS et al.,2004)；酿酒酵母中发现两种PGM，而其中PGM1 还包括两个等位基因(Bevan Pet al.,1969)；高等植物中PGM基因主 要有两种类型，质体型PGM(Cytosol PGM，Caspar Tet al.,1985；Gottlieb LD et al.,1982)和胞质型PGM(Plastid PGM，Gottlieb LD et al.,1982；Joshi JG et al.,1964；SangwanRS et al.,1987)。研究发现，不 同形式的PGM酶之间可能在分子大小、热稳定性、底物特异性等多 方面表现出差异(Whitehouse DB et al.,1992)。
[0004] PGM基因编码酶的分子特性及反应机制在许多物种中已经有非 常详细的研究。目前已经克隆并进行探讨PGM功能的包括拟南芥 (Periappuram C et al.,2000)、人肌肉(Joshi JG et al.,1969)、兔肌肉 (Liu Y et al.,1997)、牛肌肉(Anderson MJ et al.,2011)、酵母菌 (Daugherty JP et al.,1975)和细菌(Hanabusa K et al.,1966；Joshi JG et al.,1964；Wang Y et al.,2009)等。并且在拟南芥(Egli B et al.,2010) 和人类(Stojkovic T et al.,2009)中进行了PGM基因敲除实验证实该 基因在生物体生命活动糖代谢过程中的重要性。目前普遍认为植物中 胞质型PGM基因与蔗糖的合成和转化有关，在植物蔗糖分解途径中 占有关键作用；而质体型PGM在淀粉合成反应中具有重要作用 (Caspar Tet al.,1985；Hanson KR et al.,1988)。PGM基因所参与的反 应是连接光合作用和碳水化合物代谢的重要桥梁之一。研究PGM基 因在大型海藻中的分布以及编码酶特征，将有助于进一步深入了解和 掌握海藻糖代谢途径、功能以及其在系统发育、环境适应等方面的作 用。
[0005] 目前，缺乏一种具有高活力的脆江蓠磷酸葡萄糖变位酶的蛋白及 其编码基因和用途。
发明内容
[0006] 为解决上述问题，本发明的目的是提供一种具有高活力的脆江蓠 磷酸葡萄糖变位酶的蛋白及其编码基因和用途。
[0007] 为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：本发明的一 种脆江蓠磷酸葡萄糖变位酶的蛋白，所述脆江蓠磷酸葡萄糖变位酶的 蛋白包括蛋白GchPGM1和蛋白GchPGM2，所述蛋白GchPGM1的 氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，所述GchPGM2的氨基酸序 列如序列表SEQ ID NO.4所示。
[0008] 本发明所述的脆江蓠磷酸葡萄糖变位酶的蛋白GchPGM1的编码 基因GchPGM1，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
[0009] 本发明所述的脆江蓠磷酸葡萄糖变位酶的蛋白GchPGM2的编码 基因GchPGM2，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。
[0010] 本发明所述的脆江蓠磷酸葡萄糖变位酶的蛋白的制备方法，包括 如下步骤：
[0011] (1)通过同源扩增的方法获得序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示的基因；
[0012] (2)构建能高效表达和纯化脆江蓠磷酸葡萄糖变位酶的蛋白的 表达载体；
[0013] (3)根据引物设计时连入的酶切位点同时进行双酶切反应，连接 获得含有目的片段的表达质粒；用所述表达载体转化宿主菌构建基因 工程菌；
[0014] (4)利用所述工程菌表达纯化出目的蛋白；
[0015] (5)将提取到的蛋白样品进行Western杂交实验以确认纯化得 到的蛋白是所需要的带His标签的目的蛋白；
[0016] (6)采用5U磷酸葡萄糖变位酶、1U 6-磷酸葡萄糖脱氢酶GDH (Sigma)酶解，质检制得脆江蓠磷酸葡萄糖变位酶的蛋白。
[0017] 进一步地，在步骤(1)中，脆江蓠磷酸葡萄糖变位酶的蛋白的 编码基因SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示的基因的克隆：
[0018] 根据GenBank数据库已公布藻类基因序列结合1KP数据库调 取序列用Primier Primer 5软件设计带酶切位点的特异性引物，设计 两对引物，引物1/引物2和引物3/引物4。
[0019] 其中引物1的5′端和引物2的3′端分别引入限制性酶切位点 EcoRI、NotI，是用于扩增单独GchPGM1基因的引物；而引物3的5′ 端和引物4的3′端分别引入限制性酶切位点BamHI、NotI，是用于扩 增单独GchPGM2基因的引物。
[0020] 进一步地，在步骤(1)中，采用Touch-down的反应体系和反 应程序进行目的片段扩增，反应程序为94℃预变性3分钟，94℃变 性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸2分钟，以后每个循环依次 降低1度，直到45℃，共15个循环，94℃变性30秒，45℃退火 30秒，72℃延伸2分钟，20个循环，最后72℃延伸10分钟。
[0021] 进一步地，在步骤(2)中，将PCR克隆获得脆江蓠磷酸葡萄糖 变位酶的蛋白的编码基因GchPGM1和编码基因GchPGM2克隆入原 核表达载体pET32a；宿主菌为大肠杆菌E.coli Top10。
[0022] 更进一步地，在步骤(2)中，采用DNA重组技术，将序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示的基因分别插入pET32a的EcoRI、 NotI以及BamHI、NotI位点中，获得重组表达载体GchPGM1-pET32a 和GchPGM2-pET32a。
[0023] 进一步地，在步骤(3)中，含有目的片段的表达质粒转化到E.coil BL21(DE3)感受态细胞中，经过PCR检测和测序获得带有目的基 因的表达菌株，即为基因工程菌。
[0024] 本发明所述的脆江蓠磷酸葡萄糖变位酶为标记，筛选或选育海藻 糖含量高的海藻，或过表达所述的基因，构建海藻糖含量高的基因工 程海藻中的应用。
[0025] 有益效果：本发明有助于进一步深入了解和掌握海藻糖代谢途 径、功能以及其在系统发育、环境适应等方面的作用；并以该基因为 标记，筛选或选育海藻糖含量高的海藻，或过表达所述的基因，构建 海藻糖含量高的基因工程海藻。
[0026] 目前海藻中并未有该类酶发现，该类编码基因在大型海藻中的分 布以及编码酶特征有待研究，本发明有助于进一步深入了解和掌握海 藻糖代谢途径、功能以及其在系统发育、环境适应等方面的作用；并 以该基因为标记，筛选或选育海藻糖含量高的海藻，或过表达所述的 基因，构建海藻糖含量高的基因工程海藻。
附图说明
[0027] 图1为本发明的SDS聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳图；图1(A) GcPGM1蛋白，(B)GcPGM2蛋白；
[0028] 图2为本发明的带His标签的目的蛋白的图；图2(1)GcPGM1 蛋白，(2)GcPGM2蛋白；
[0029] 图3A为本发明的仅GcPGM2随着温度的上升酶活力呈现先升 后降的现象的图；
[0030] 图3B为本发明的结果显示GcPGM2酶活力随着pH的上升呈 现先升后降的现象的图；
[0031] 图3C为本发明的结果显示0.5mM Mg2+能最大程度的提高 GcPGM2的活性的图；
[0032] 图4为本发明的脆江蓠GcPGM2酶活力双倒数曲线用以计算Km和Vmax的图。
具体实施方式
[0033] 以下通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，这些实施例 是本发明的阐释和举例，并不以任何形式限制本发明的范围。
[0034] 实施例1
[0035] 海藻糖是由两个葡萄糖分子通过α,α-1,1-糖苷键结合而成的非还 原性二糖。在生物体内中最广泛存在的合成途径是以尿苷二磷酸葡萄 糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase，UGP)催化1-磷酸 葡萄糖(Glucose-1-P，G-1-P)产生尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-glucose， UDPG)。UDPG和由磷酸葡糖糖变位酶(Phosphoglucomutase，PGM) 催化G-1-P产生的6-磷酸葡萄糖(Glucose-6-P，G-6-P)一起作为底 物，通过海藻糖合成酶(Trehalose-6-P-synthase，TPS)催化反应合成 海藻糖。该途径已在细菌、真菌和植物中得到了发现和验证。G-6-P 在生物体内可转化成各种形式的糖，包括游离葡萄糖、其它单糖、双 糖、细胞壁多糖、淀粉等，其化学修饰和变构在整个生物糖代谢中起 着重要的作用。
UDPG作为葡萄糖基供体参与蔗糖、纤维素、半纤维 素、果胶质以及糖脂、糖蛋白的合成代谢(Eimert Ket al.,1996)。目 前，G-6-P和UDPG的合成在植物、动物和微生物中都有广泛的研 究，在大型海藻中这两类单糖的关键酶基因研究还鲜有报道。对大型 海藻中这两类单糖合成(变构)酶基因以及海藻糖合成酶基因的研究 对于了解大型海藻生态适应、揭示藻类系统发育的过程以及不同海藻 门类进化地位具有重要的意义。
UDPG作为葡萄糖基供体参与蔗糖、纤维素、半纤维 素、果胶质以及糖脂、糖蛋白的合成代谢(Eimert Ket al.,1996)。目 前，G-6-P和UDPG的合成在植物、动物和微生物中都有广泛的研 究，在大型海藻中这两类单糖的关键酶基因研究还鲜有报道。对大型 海藻中这两类单糖合成(变构)酶基因以及海藻糖合成酶基因的研究 对于了解大型海藻生态适应、揭示藻类系统发育的过程以及不同海藻 门类进化地位具有重要的意义。
[0036] PGM基因是6-磷酸葡萄糖变构转化的关键基因：磷酸葡萄糖变位 酶(PGM)可逆催化G-6-P和G-1-P的相互转换，是糖合成代谢途径 中的一个关键酶(Caspar Tet al.,1985),普遍存在于微生物、植物、 动物等各类生物体内(Caspar Tet al.,1985；BarmanTE,
1969；Gottlieb LD et al.,1982；Joshi JG et al.,1964；Kahl G&Stegemann H 1973； Muhlbach H et al.,1978；SangwanRS et al.,1987；WhitehouseDB et al., 1992；
Salvucci MC et al.,1990)。其反应机制包括了两个磷酸基转移反 应(Grant SS et al.,
2004；Shackelford GS et al.,2004)：首先，PGM 酶活性部位提供一个磷酸基团到底物中，生成葡萄糖-1,6-二磷酸 (Glucose-1,6-P)中间体；然后中间体将磷酸基团转移回PGM酶， 同时完成产物的合成和酶再生过程。
1969；Gottlieb LD et al.,1982；Joshi JG et al.,1964；Kahl G&Stegemann H 1973； Muhlbach H et al.,1978；SangwanRS et al.,1987；WhitehouseDB et al., 1992；
Salvucci MC et al.,1990)。其反应机制包括了两个磷酸基转移反 应(Grant SS et al.,
2004；Shackelford GS et al.,2004)：首先，PGM 酶活性部位提供一个磷酸基团到底物中，生成葡萄糖-1,6-二磷酸 (Glucose-1,6-P)中间体；然后中间体将磷酸基团转移回PGM酶， 同时完成产物的合成和酶再生过程。
[0037] 本发明的一种脆江蓠磷酸葡萄糖变位酶的蛋白，所述脆江蓠磷酸 葡萄糖变位酶的蛋白包括蛋白GchPGM1和蛋白GchPGM2，所述蛋 白GchPGM1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，所述 GchPGM2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示。
[0038] 通过同源扩增的方法获得PGM序列2条，来源于脆江蓠。
[0039] 本发明所述的脆江蓠磷酸葡萄糖变位酶的蛋白GchPGM1的编码 基因GchPGM1，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
[0040] 本发明所述的脆江蓠磷酸葡萄糖变位酶的蛋白GchPGM2的编码 基因GchPGM2，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。
[0041] 本发明所述的脆江蓠磷酸葡萄糖变位酶的蛋白的制备方法，包括 如下步骤：
[0042] (1)通过同源扩增的方法获得序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示的基因；
[0043] 从GenBank数据库中下载已报导的PGM基因序列，通过序列 同源比对的方法在19种已测序藻类基因组(表1)和1KP项目中 40种藻类转录组中筛选候选序列(E值<10-5)。将获得的候选序列 采用BLAST X和BLAST P在线软件在公共数据库中进一步验证。 将获得序列和NCBI下载的已知植物、微生物、藻类、细菌、古菌同 源基因编码序列采用ClustalX 1.83进行相似性比较，找出该序列中 存在的保守结构域。
[0044] 选择NCBI数据库中的结构域在线预测软件 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)对获得的核酸 编码蛋白质进行结构域预测。利用MrBayes 3.1.2软件对编码氨基酸 序列进行系统发育树的构建(建树序列信息见附表A2)，使用马可 夫链-蒙特卡罗(mcmc)数据模拟技术来估算后验概率，首次运算进 行5 000 000代，取样频率100。用FigTree软件生成可视化的系统 发育树。
[0045] 采用改良Trizol法提取脆江蓠(Gracilaria chouae)的总RNA(李 天勇等，2012)。脆江蓠样品由中国海洋大学大型海藻种质库 (Laboratory of Genetics and Breeding of Marine Organism)提供。采 用cDNA反转录试剂盒(SuperScript II Reverse
Transcriptase，美国 Invitrogen公司)合成cDNA。
Transcriptase，美国 Invitrogen公司)合成cDNA。
[0046] 根据GenBank数据库已公布藻类基因序列结合1KP数据库调 取序列用Primier Primer 5软件设计带酶切位点的特异性引物(表1)， 扩增脆江蓠的PGM基因序列。设计两对引物，引物1/引物2和引物 3/引物4。PGM基因带酶切位点引物信息如表1所示：
[0047] 表1
[0048]
[0049] PGM1为引物1，PGM2为引物2，PGM3为引物3，PGM4为 引物4，其中引物1的5′端和引物2的3′端分别引入限制性酶切位点 EcoRI、NotI，是用于扩增单独GchPGM1基因的引物；而引物3的5′ 端和引物4的3′端分别引入限制性酶切位点BamHI、NotI，是用于扩 增单独GchPGM2基因的引物。
[0050] 采用Touch-down的反应体系和反应程序进行目的片段扩增 (Don RH et al.,1991)。反应程序为94℃预变性3分钟，94℃变性 30秒，60℃退火30秒，72℃延伸2分钟。以后每个循环依次降 低1度，直到45℃，共15个循环。94℃变性30秒，45℃退火 30秒，72℃延伸2分钟，20个循环。最后72℃延伸10分钟。 扩增目的片段用琼脂糖凝胶回收试剂盒(北京天根生物科技有限公 司)进行切胶回收，连接入克隆载体pMD19-T(宝生物工程有限公 司)，转化入大肠杆菌感受态细胞E.coli Top10中筛选阳性克隆并测 序。将测序正确的质粒与pET32a表达载体(宝生物工程有限公司) 根据引物设计时连入的酶切位点同时进行双酶切反应，连接获得含有 目的片段的表达质粒。
[0051] 采用Touch-down的反应体系和反应程序进行目的片段扩增，反 应程序为94℃预变性3分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒， 72℃延伸2分钟，以后每个循环依次降低1度，直到45℃，共15 个循环，94℃变性30秒，45℃退火30秒，72℃延伸2分钟，20 个循环，最后72℃延伸10分钟。
[0052] (2)构建能高效表达和纯化脆江蓠磷酸葡萄糖变位酶的蛋白的 表达载体；
[0053] 将PCR克隆获得脆江蓠磷酸葡萄糖变位酶的蛋白的编码基因 GchPGM1和编码基因GchPGM2克隆入原核表达载体pET32a；宿主 菌为大肠杆菌E.coli Top10。PGM序列2条，来源于脆江蓠。
[0054] 在步骤(2)中，采用DNA重组技术，将序列表SEQ ID NO：1 和SEQ ID NO：3所示的基因分别插入pET32a的EcoRI、NotI以及 BamHI、NotI位点中，获得重组表达载体GchPGM1-pET32a和 GchPGM2-pET32a。
[0055] 原核蛋白表达
[0056] 含有目的片段的表达质粒转化到E.coil BL21(DE3)(北京天根 生物科技有限公司)感受态细胞中，经过PCR检测和测序获得带有 目的基因的表达菌株。
[0057] (3)根据引物设计时连入的酶切位点同时进行双酶切反应，连接 获得含有目的片段的表达质粒；用所述表达载体转化宿主菌构建基因 工程菌；
[0058] 含有目的片段的表达质粒转化到E.coil BL21(DE3)感受态细胞 中，经过PCR检测和测序获得带有目的基因的表达菌株，即为基因 工程菌。
[0059] (4)利用所述工程菌表达纯化出目的蛋白；
[0060] 将表达菌株接种至LB液体培养基，至菌液生长至OD600为0.6 时，以0.1mM终浓度的IPTG诱导，在16℃、160rpm的诱导条 件过夜诱导目的蛋白的表达。因目标蛋白携带His标签，以Ni柱亲 和纯化。
[0061] (5)将提取到的蛋白样品进行Western杂交实验以确认纯化得 到的蛋白是所需要的带His标签的目的蛋白；
[0062] 对纯化蛋白进行SDS聚丙烯酰胺胶电泳，用考马斯亮蓝染色观 察纯化蛋白大小、纯度。
[0063] (6)采用5U磷酸葡萄糖变位酶、1U 6-磷酸葡萄糖脱氢酶GDH (Sigma)酶解，质检制得脆江蓠磷酸葡萄糖变位酶的蛋白。
[0064] Western Blot蛋白质印迹法选用抗His标签单克隆抗体 Anti-His Tag Mouse Monoclonal Antibody(天根生化科技有限公司) 对纯化蛋白标记，检测目的蛋白的特异性。
[0065] 本发明所述的脆江蓠磷酸葡萄糖变位酶为标记，筛选或选育海藻 糖含量高的海藻，或过表达所述的基因，构建海藻糖含量高的基因工 程海藻中的应用。
[0066] 试验1
[0067] 酶动力学检测
[0068] PGM酶活检测：在1ml的反应体系中包含终浓度179mM的 glycyl-glycine(pH 7.4)，0.67mM的NADP(Roche)，0.02mM葡 萄糖-1,6-二磷酸(Sigma)，43mM L-cysteine，1U
6-磷酸葡萄糖脱氢 酶GDH(Sigma)，30mM MgCl2及提取到的目的蛋白，最后加入5.0 mM Glc-1-P(Sigma)起始反应。测定OD340时的光度值计算NADPH 的生成量。检测不同温度(5、
10、20、30、40、50、60℃)，不同 pH(6、7、7.4、8、9)，不同金属离子(Mg2+,Mn2+,Ca2+)条件下酶 活力变化，每实验组设置4组平行试验以检测实验结果的稳定性。 进行不同底物浓度(Glc-
1-P浓度分别为0.25mM、0.5mM、1mM、 2.5mM、5mM、10mM)的酶活力检测，每实验组设置4组平行实 验，进行km值和Vmax值的测定。
6-磷酸葡萄糖脱氢 酶GDH(Sigma)，30mM MgCl2及提取到的目的蛋白，最后加入5.0 mM Glc-1-P(Sigma)起始反应。测定OD340时的光度值计算NADPH 的生成量。检测不同温度(5、
10、20、30、40、50、60℃)，不同 pH(6、7、7.4、8、9)，不同金属离子(Mg2+,Mn2+,Ca2+)条件下酶 活力变化，每实验组设置4组平行试验以检测实验结果的稳定性。 进行不同底物浓度(Glc-
1-P浓度分别为0.25mM、0.5mM、1mM、 2.5mM、5mM、10mM)的酶活力检测，每实验组设置4组平行实 验，进行km值和Vmax值的测定。
[0069] 试验2
[0070] 原核表达及蛋白质鉴定
[0071] 将PCR克隆获得脆江蓠2条PGM序列(GcPGM1、GcPGM2) 克隆入原核表达载体pET32a。采用大肠杆菌原核表达体系表达纯化 出目的蛋白。SDS聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳图如图1，各蛋白分子 量均符合预期大小。图1本发明的藻类PGM蛋白表达结果。(A) GcPGM1蛋白，(B)GcPGM2蛋白。M：双色预染Marker。
[0072] 将提取到的蛋白样品进行Western杂交实验以确认纯化得到的 蛋白是所需要的带His标签的目的蛋白(图2)。纯化获得脆江蓠PGM 蛋白均能杂交获得清晰条带，证实为目标蛋白。如图2所示，本发 明的藻类PGM蛋白Western杂交结果。一抗采用抗his标签单克 隆抗体，二抗为HRP标记的抗小鼠二抗。(1)GcPGM1蛋白，(2) GcPGM2蛋白。
[0073] 试验3
[0074] 酶活检测
[0075] 首先在不同反应温度(5、10、20、30、40、50、60℃)下，检 测GcPGM1、GcPGM2蛋白的PGM活性。仅GcPGM2随着温度的 上升酶活力呈现先升后降的现象(图3A)，而GcPGM1无明显酶活 性。差异显著度分析表明，GcPGM2在50℃时的酶活力与其他组别 温度下的活性均差异极显著，在50℃时最高的酶活力为1411.93 U/g。
[0076] 在GcPGM2酶活反应的最适温度下，检测其在不同pH值(6、 7、7.4、8、9)下的变化。结果显示GcPGM2酶活力随着pH的上 升呈现先升后降的现象(图3B)，而脆江蓠GcPGM1蛋白在不同pH 条件下均未显示明显活性。GcPGM2最适pH为8.0。差异显著度分 析表明，GcPGM2在pH为8.0时的酶活力除了与pH为7.4时活 性差异不显著外，与其他组别pH下的活性均差异极显著，说明该 蛋白存在一个最适反应pH的平台期(7.4-8.0)。实验结果显示无论 是pH较低的酸性环境还是pH较高的碱性环境，均不利于酶活性的 发挥。
[0077] 在GcPGM2酶活反应的最适温度和pH条件下，检测其在金属 离子(Mg2+、Mn2+、Ca2+)存在下的酶活变化。结果显示0.5mM Mg2+能最大程度的提高GcPGM2的活性(图3C)。差异显著度分析结果 表明，加入Mg2+实验组与其他二价金属离子实验组相比差异极显 著，是加入Mn2+离子时酶活力的7倍，是加入Ca2+离子时酶活力 的16倍。如图3所示，本发明的温度、pH及金属离子对脆江蓠 GcPGM1和GcPGM2蛋白酶活反应的影响。(图3A)不同温度下 GcPGM1和GcPGM2酶活力比较图，(图3B)不同pH下GcPGM1 和GcPGM2酶活力比较图，(图3C)不同金属离子下GcPGM1和 GcPGM2酶活力比较图。
[0078] 根据实验方法中设定的不同底物浓度，测定GcPGM2的km值 及酶的最大反应速度(图4)。得出脆江蓠GcPGM2对底物葡萄糖-1- 磷酸的km为602.6μM，Vmax为1.443μM/min。如图4所示，本发明 的脆江蓠GcPGM2酶活力双倒数曲线用以计算Km和Vmax的图。
[0079] 以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优 点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上 述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明 精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保 护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。