花生出仁率主效QTL位点的分子标记及其应用

摘要

本发明属于分子遗传育种领域，具体涉及一种花生出仁率主效QTL位点的分子标记及其应用。所述分子标记为Ad09A7577、AGGS1606、AHGA98567和Ad91I24，利用分子标记Ad09A7577的引物对、AGGS1606的引物对、AHGA98567的引物对和Ad91I24的引物对中的一对引物或多对引物，对待鉴定花生材料的DNA进行PCR扩增，扩增产物进行电泳检测，如扩增出对应大小的DNA片段，则标志着出仁率主效QTL位点cqSPA09的存在，荚果具有较高的出仁率。

权利要求

1.与花生出仁率主效QTL位点cqSPA09连锁的分子标记在选育高出仁率花生品种中的应用，所述分子标记为分子标记Ad09A7577、分子标记AGGS1606、分子标记AHGA98567和分子标记Ad91I24；所述分子标记Ad09A7577的引物对为：正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示；所述分子标记AGGS1606的引物对为：正向引物序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物序列如SEQ ID NO.4所示；所述分子标记AHGA98567的引物对为：正向引物序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物序列如SEQ ID NO.6所示；所述分子标记Ad91I24的引物对为：正向引物序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物序列如SEQ ID NO.8所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，具体包括如下步骤：利用所述分子标记Ad09A7577的引物对、分子标记AGGS1606的引物对、分子标记AHGA98567的引物对和分子标记Ad91I24的引物对中的一对引物或多对引物，对待鉴定花生材料的DNA进行PCR扩增，扩增产物进行电泳检测，如电泳检测结果显示待鉴定材料与花生品种远杂9102扩增得到相同大小的DNA片段，则标志着出仁率主效QTL位点cqSPA09的存在，荚果具有较高的出仁率；所述扩增得到相同大小的DNA片段是指：利用分子标记Ad09A7577的引物对扩增得到273bp DNA片段、利用分子标记AGGS1606的引物对扩增得到205bp DNA片段、利用分子标记AHGA98567的引物对扩增得到232bp DNA片段、利用分子标记Ad91I24的引物对扩增得到198bp DNA片段。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为10μL，包括 Trans 2×EcoTaq PCR SuperMix(+dye) 5μL、待鉴定花生材料的DNA模板10 20ng，0.4 μM~正向引物，0.4 μM反向引物。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性3 min；94℃变性30s，65℃复性45s、每个循环降低1℃，72℃延伸45s，共10个循环；94℃变性

30s，55℃复性45s、72℃延伸45s，共30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保温。

说明书

花生出仁率主效QTL位点的分子标记及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于分子遗传育种领域，具体涉及一种花生出仁率主效QTL位点cqSPA09的分子标记及其应用。

背景技术

[0002] 花生(Arachis hypogea L.)是世界四大油料作物之一，在人类膳食营养中具有重要作用。花生生产对于保障我国食用植物油脂和蛋白质的有限供给具有重要作用。在花生生产中，花生以荚果的形式收获和存储。花生荚果由花生果壳和种子两部分构成。花生种子含有丰富的食用油脂、蛋白质、氨基酸和维生素，可以加工为食用油、坚果、花生酱等食品。花生出仁率是指种子重量占荚果重量的百分比；出仁率越高，可用于食品加工的部分越多。
因此，出仁率是花生生产中的重要经济性状之一，如何快速、准确选育高出仁率的花生品种是花生遗传改良研究的重要方向。

[0003] 在中国花生核心种质中，出仁率最低仅为59.9％，少数高出仁率品种可达到81％，具有较大的遗传改良潜力。与大多数重要的产量和农艺性状一样，出仁率表型为数量性状的遗传特点。数量性状易受环境条件的影响，因此对表型直接进行选择的效果不好。随着分子标记的发展，可以用QTL分析将复杂的数量性状进行分解，像研究质量性状一样对控制数量性状的多个基因进行研究。QTL是通过对分子标记基因型和表型结果的统计分析，在高密度遗传连锁图谱上确定的控制某一性状的基因在染色体上的位置。与QTL连锁的分子标记可以用于辅助选择，提高育种效率。

[0004] 目前对花生出仁率的QTL定位研究还较少，检测到的QTL数目较少，效应值低，在不同环境表达的稳定性未知，难以在花生育种中应用。本发明通过遗传分析和QTL定位，筛选了稳定表达的花生出仁率主效QTL及其连锁标记，用于高出仁率的花生品种的标记辅助选择。

发明内容

[0005] 本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种花生出仁率主效QTL位点的分子标记、分子标记引物对、分子标记方法及其应用。

[0006] 为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

[0007] 与花生出仁率主效QTL位点cqSPA09连锁的分子标记，包括分子标记Ad09A7577、分子标记AGGS1606、分子标记AHGA98567和分子标记Ad91I24，所述分子标记Ad09A7577的正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示；所述分子标记AGGS1606的正向引物序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物序列如SEQ ID NO.4所示；所述分子标记AHGA98567的正向引物序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物序列如SEQ ID NO.6所示；所述分子标记Ad91I24的正向引物序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物序列如SEQ ID NO.8所示。

[0008] 与花生出仁率主效QTL位点cqSPA09连锁的分子标记Ad09A7577的引物对：

[0009] 正向引物序列5’-CATCATGGAGGGCTTCCTTA-3’(如SEQ ID NO.1所示)，[0010] 反向引物序列5’-TTCAATCCCTTTTCAGGTCG-3’(如SEQ ID NO.2所示)。

[0011] 与花生出仁率主效QTL位点cqSPA09连锁的分子标记AGGS1606的引物对：

[0012] 正向引物序列5’-CTCACACATACACAACCTGCTG-3’(如SEQ ID NO.3所示)，[0013] 反向引物序列5’-CATCGAGTAGTATGGATGCTTGA-3’(如SEQ ID NO.4所示)。

[0014] 与花生出仁率主效QTL位点cqSPA09连锁的分子标记AHGA98567的引物对：

[0015] 正向引物序列5’-TTCAGAAGGCAGTGTCGATG-3’(如SEQ ID NO.5所示)，[0016] 反向引物序列5’-GATATAAGACCCCCGGGATG-3’(如SEQ ID NO.6所示)。

[0017] 与花生出仁率主效QTL位点cqSPA09连锁的分子标记Ad91I24的引物对：

[0018] 正向引物序列5’-TGTCCGCCAAGTTTTACAGATA-3’(如SEQ ID NO.7所示)，[0019] 反向引物序列5’-CAGCTTACACTGGCATGTTCTC-3’(如SEQ ID NO.8所示)。

[0020] 一种花生出仁率主效QTL位点cqSPA09的分子标记方法，包括如下步骤：利用分子标记Ad09A7577的引物对、分子标记AGGS1606的引物对、分子标记AHGA98567的引物对和分子标记Ad91I24的引物对中的一对引物或多对引物，对待鉴定花生材料的DNA进行PCR扩增，扩增产物进行电泳检测，如电泳检测结果显示待鉴定材料与花生品种远杂9102扩增得到相同大小的DNA片段，则标志着出仁率主效QTL位点cqSPA09的存在，荚果具有较高的出仁率；所述扩增得到相同大小的DNA片段是指：利用分子标记Ad09A7577的引物对扩增得到273bp DNA片段、利用分子标记AGGS1606的引物对扩增得到205bp DNA片段、利用分子标记AHGA98567的引物对扩增得到232bp DNA片段、利用分子标记Ad91I24的引物对扩增得到
198bp DNA片段。

[0021] 上述方案中，所述PCR扩增的反应体系为10μL，包括Trans 2×EcoTaq  PCR SuperMix(+dye)5μL、待鉴定花生材料的DNA模板10～20ng，0.4μM正向引物，0.4μM反向引物。

[0022] 上述方案中，所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，65℃复性45s、每个循环降低1℃，72℃延伸45s，共10个循环；94℃变性30s，55℃复性45s、72℃延伸45s，共30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保温。

[0023] 上述与花生出仁率主效QTL位点cqSPA09连锁的分子标记的筛选方法，包括如下步骤：

[0024] (1)以高出仁率的栽培花生品种远杂9102为母本，低出仁率的品种徐州68-4为父本，杂交并通过单粒传法获得重组自交系(RIL)群体；

[0025] (2)在武汉考察了亲本和RIL群体在4年(2013～2016)间的出仁率；

[0026] (3)用CTAB法提取亲本和RIL群体195个单株叶片DNA；

[0027] (4)选用不同来源的9440对SSR引物对亲本进行多态性筛选，并用862对多态性引物对195个RIL群体单株进行扩增，用JoinMap 4.0软件构建分子连锁图谱；

[0028] (5)利用Windows QTL Cartographer 2.5软件的复合区间作图法开展出仁率QTL分析，位于A09染色体上的主效QTL位点cqSPA09能在4年中稳定检测，其加性等位基因来源于远杂9102，与它连锁的标记为分子标记Ad09A7577、分子标记AGGS1606、分子标记AHGA98567和分子标记Ad91I24。

[0029] 上述与花生出仁率主效QTL位点cqSPA09连锁的分子标记在选育高出仁率花生品种中的应用。

[0030] 上述花生出仁率主效QTL位点cqSPA09的分子标记方法在选育高出仁率花生品种中的应用。

[0031] 本发明的有益效果：本发明筛选得到与花生出仁率主效QTL位点cqSPA09连锁的4个分子标记，利用4个分子标记引物对，采用花生出仁率主效QTL位点cqSPA09的分子标记方法，可以辅助选择花生出仁率，有利于推动高出仁率花生品种的选育，提高育种效率。

附图说明

[0032] 图1为本发明中花生出仁率主效QTL位点cqSPA09在染色体A09的定位，其中垂直线表示花生染色体A09，右边的水平短线表示染色体上的分子标记，左边的水平短线表示标记间的遗传距离(cM)；出仁率主效QTL位点cqSPA09定位于标记Ad09A7577和Ad91I24之间0.41cM的黑色突出显示区域，左侧列出了该QTL在2013～2016四年间检测到的置信区间。

具体实施方式

[0033] 为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

[0034] 实施例1

[0035] 供试材料：以高出仁率的栽培花生品种远杂9102为母本、低出仁率的品种徐州68-4为父本进行杂交，通过单粒传法获得包含195个株系的重组自交系(RIL)群体F5(2013年)、F6(2014年)、F7(2015年)和F8(2016年)代。

[0036] 表现型鉴定：2013～2016年在中国农业科学院油料作物研究所阳逻实验基地种植远杂9102、徐州68-4及F5(2013年)、F6(2014年)、F7(2015年)、F8(2016年)代RIL群体195个株系。采用完全随机区组实验设计，3次重复。每次重复每份材料种植1行12株，行距30厘米，株距20厘米。采取标准的田间管理方式。成熟后收获8株典型植株的荚果，统计出仁率(种子重量÷荚果重量×100％)。

[0037] 遗传连锁图谱的构建：选取在花生20条染色体上均匀分布，覆盖全基因组的9440对SSR引物对亲本进行多态性筛选，并用862个多态性引物对195个RIL群体单株进行扩增，用JoinMap 4.0软件构建了全基因组20条染色体的分子连锁图谱。该连锁图包含830个位点，总长度为1386.19cM，标记间平均距离为1.67cM。

[0038] 出仁率QTL的定位：利用Windows QTL Cartographer 2.5软件的复合区间作图法开展出仁率QTL分析，利用四年的出仁率表型数据均在染色体A09上Ad09A7577～Ad91I24区间检测到主效QTL位点cqSPA09，在2013～2016四年间的LOD值分别为11.1、7.6、8.9和10.8，表型解释率分别为17.01％、10.47％、12.20％和14.39％。2013～2016年的置信区间相互重叠，进一步利用BioMercator软件进行Meta-analysis，将4年的置信区间整合于一个0.41cM的区间(27.04～27.45cM)，其位置的示意图见图1。因此，出仁率主效QTL位点cqSPA09能在4年田间实验中稳定表达，其加性等位基因来源于远杂9102，与它连锁的分子标记Ad09A7577、分子标记AGGS1606、分子标记AHGA98567和分子标记Ad91I24可对该主效QTL进行分子标记辅助选择。

[0039] 本实施例PCR的反应体系为10μL，包括Trans 2×EcoTaq PCR SuperMix(+dye)5μL、基因组DNA模板10～20ng，0.4μM上游引物,0.4μM下游引物。

[0040] 本实施例PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s、65℃复性45s(每个循环降低1℃)、72℃延伸45s，共10个循环；94℃变性30s、55℃复性45s、72℃延伸45s，共30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保温。

[0041] 表1花生出仁率主效QTL位点cqSPA09的分子标记

[0042]

[0043] 实施例2

[0044] 利用与花生出仁率主效QTL位点cqSPA09相连锁的四个分子标记对远杂9102和徐州68-4的195个F7(2015年)株系进行检测，检测四个标记都为杂合的单株。在这些单株中出仁率主效QTL位点cqSPA09处于杂合状态，而其它遗传背景较为接近。这些杂合单株称为剩余杂合体，它们的自交后代构成了剩余杂合系(RHL)群体。在RHL群体中，利用与花生出仁率主效QTL位点cqSPA09相连锁的四个分子标记中的一个或多个标记进行检测，如果存在与远杂9102相同的扩增片段，说明该植株的出仁率高，不存在说明出仁率低。同时用实际测得的出仁率结果与分子标记检测结果进行验证。

[0045] 结果显示，在195个F7(2015年)株系检测到一个四个标记基因型都为杂合的单株，这个单株2015年自交获得了一个包含31个单株的RHL群体。其中，17个单株的四个标记基因型都为杂合，说明主效QTL位点cqSPA09处于杂合状态，出仁率平均值为75.62％；5个单株的四个标记基因型与远杂9102相同，说明存在纯合的主效QTL位点cqSPA09，出仁率平均值为78.45％，最低值为75.86％，最高值为80.97％；9个单株的四个标记基因型与徐州68-4相同，说明不存在主效QTL位点cqSPA09，出仁率平均值为72.82％，最低值为69.23％，最高值为76.90％。因此，用与主效QTL位点cqSPA09连锁的分子标记Ad09A7577、AGGS1606、AHGA98567和Ad91I24预测花生出仁率有较好的预测效果。

[0046] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。