一种以新城疫病毒热稳定毒株制备的灭活疫苗及其制备方法

摘要

本发明公开了一种以新城疫病毒热稳定毒株制备的灭活疫苗及其制备方法。该疫苗以新城疫病毒热稳定毒株为疫苗毒种，其制备方法包括新城疫病毒热稳定毒株病毒尿囊液的制备、优化的稀释缓冲液对病毒尿囊液进行稀释、β‑丙内酯灭活病毒及油乳剂灭活疫苗的制备与检验。该疫苗的热稳定性显著高于其他常规灭活疫苗，同时仍具有良好的免疫原性，克服了目前常用新城疫疫苗热稳定相对较差、冷链系统依赖程度高等问题，具有广阔的应用前景。

权利要求

1.一种灭活疫苗的制备方法，制备该灭活疫苗所使用的毒株为新城疫病毒热稳定毒株，所述新城疫病毒热稳定毒株为TS09-C株，其特征在于，包括以下步骤：（1）病毒尿囊液的制备

将新城疫病毒热稳定毒株接种9-11日龄SPF鸡胚，孵育，收获尿囊液于无菌容器中；

（2）病毒尿囊的稀释

测定尿囊液中的病毒含量，以病毒稀释缓冲液进行稀释，将病毒含量稀释至108.0 EID50/ml，所述病毒稀释缓冲液由100mmol/L Tris-HCl、5mmol/L氯化钠、5mmol/L氯化钾、

1.0mmol/L氯化镁、2.0mmol/L氯化钙和1.0mmol/L磷酸氢二钠组成；

（3）β-丙内酯灭活病毒尿囊液

将稀释后的病毒尿囊液以病毒灭活剂进行灭活处理，期间振摇多次，所述灭活剂的使用浓度为占稀释后的病毒尿囊液体积的0.025%；

（4）油乳灭活疫苗的制备

将白油、硬脂酸铝和司本-80混匀制成油相，加入步骤（ 3）得到的病毒液乳化，病毒液与油相体积比为2:1-4:1，即得到新城疫病毒热稳定毒株的灭活疫苗。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述孵育是在37℃孵育4-6天。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述灭活处理是在37℃条件下处理1-2小时。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，白油、硬脂酸铝和司本-80的体积比为

92:2:6。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述灭活疫苗在42℃稳定保存至少60天。

说明书

一种以新城疫病毒热稳定毒株制备的灭活疫苗及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及的是一种疫苗的制备方法，具体的说是一种新型的以新城疫病毒热稳定毒株制备的灭活疫苗及其制备方法。属于生物制品制造领域。

背景技术

[0002] 新城疫是由新城疫病毒引起的禽类高度接触性和急性败血性疾病，有较高的发病死亡率，被国际兽疫局规定为仅有的两种A类禽病之一，一直在除大洋洲以外的全世界范围内发生流行，给全球造成了巨大的经济损失。我国自1946年首次分离新城疫病毒(NDV)，现在全国范围内普遍存在，并且是我国养禽业危害最大、经济损失最严重的禽病之一，目前我国一直采用以疫苗接种为主的手段来控制新城疫的发生。

[0003] 目前，国际上生产和使用的新城疫疫苗有两大类，即活疫苗和灭活疫苗。活疫苗包括低毒力活疫苗和中等毒力活疫苗，低毒力活疫苗包括II系苗(B1)、III系苗(LaSota株)、Clone-30、V4等；中等毒力活疫苗包括I系苗、Roskin株、Komorov株、Hert33株和Mukteswar株等。活疫苗可在禽类体内复制、增殖，可以刺激机体产生体液免疫、细胞免疫和局部的粘膜免疫，而且可以从免疫禽传播给未免疫禽。但是也存在不足之处，低毒力活疫苗不能抵抗母源抗体的干扰，中等毒力活疫苗虽然可以打破母源抗体的影响，但是可能引起禽类发病，并且散毒和有毒力返强的可能。目前国内外企业生产的新城疫灭活疫苗的毒株一般是LaSota和Ulster，灭活疫苗产生抗体水平较高，持续时间较长，受母源抗体影响小，免疫不良反应小。对灭活疫苗而言，灭活试剂和灭活条件很重要。国内普遍利用甲醛作为灭活剂制备病毒灭活疫苗，但是甲醛灭活存在一定的问题，它属于强刺激性致癌性物质，必须保证残留的甲醛被清除完全。其次甲醛灭活时间较长，灭活效果受温度、pH等多因素的影响，因此需要寻找新型灭活剂。

[0004] 研究发现，有些低毒力新城疫毒株具有独特的耐热特性，代表株有V4、HB92和TS09-C株等。利用热稳定毒株制备的疫苗具有耐热、低毒、免疫效果好等优点，与其他利用非耐热毒株制备的疫苗相比，该疫苗在气温普遍较高的南方地区和冷链条件较差的农村推广应用更有优势，在新城疫的防控中发挥了重要作用。目前应用最为广泛的低毒力疫苗株LaSota株以及中等毒力株均为非耐热型新城疫病毒株，因此，研制开发新型新城疫病毒热稳定毒株制备的疫苗具有重大的意义。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种以新城疫病毒热稳定毒株制备的灭活疫苗及其制备方法。该新城疫灭活疫苗热稳定性好、易保存、免疫力强。

[0006] 为实现上述目的，本发明公开的技术方案是：

[0007] 一种以新城疫病毒热稳定毒株制备的灭活疫苗，制备该灭活疫苗所使用的毒种为新城疫病毒热稳定毒株。

[0008] 上述方案中，所述新城疫病毒热稳定毒株为V4株、HB92或TS09-C株。

[0009] 上述方案中，所述灭活疫苗在42℃稳定保存至少60天。

[0010] 所述的灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

[0011] (1)病毒尿囊液的制备

[0012] 将新城疫病毒热稳定毒株接种9-11日龄SPF鸡胚，孵育，收获尿囊液于无菌容器中；

[0013] (2)病毒尿囊的稀释

[0014] 测定尿囊液中的病毒含量，以病毒稀释缓冲液进行稀释，将病毒含量稀释至8.0
10 EID50/ml；

[0015] (3)β-丙内酯灭活病毒尿囊液

[0016] 将稀释后的病毒尿囊液以病毒灭活剂进行灭活处理，期间振摇多次；

[0017] (4)油乳灭活疫苗的制备

[0018] 将白油、硬脂酸铝和司本-80混匀制成油相，加入步骤3)得到的病毒液乳化，病毒液与油相体积比为2:1-4:1，即得到新城疫病毒热稳定毒株的灭活疫苗。

[0019] 上述方案中，所述孵育是在37℃孵育4-6天。

[0020] 上述方案中，所述灭活处理是在37℃条件下处理1-2小时。

[0021] 上述方案中，白油、硬脂酸铝和司本-80的体积比为92:2:6。

[0022] 上述方案中，病毒稀释缓冲液由Tris-HCl、氯化钠、氯化镁、氯化钙和磷酸氢二钠组成。

[0023] 上述方案中，采用的灭活剂为β-丙内酯。

[0024] 上述方案中，灭活剂的使用浓度为占稀释后的病毒尿囊液体积的0.025％-0.05％。

[0025] 本发明具有以下有益效果：本发明制备得到的疫苗的热稳定性显著高于其他常规灭活疫苗，同时仍具有良好的免疫原性，克服了目前常用新城疫疫苗热稳定相对较差、冷链系统依赖程度高等问题，具有广阔的应用前景。

附图说明

[0026] 图1为β-丙内酯的处理浓度对TS09-C的耐热血凝活性影响。

[0027] 图2新城疫灭活疫苗(TS09-C株)的保存期试验。

具体实施方式

[0028] 下面结合实施例和附图对本发明作进一步阐明，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例，实施例不应视作对本发明的限定。

[0029] 实施例一：新城疫病毒热稳定毒株的灭活疫苗的制备

[0030] 1、病毒尿囊液的制备

[0031] 将新城疫热病毒稳定毒株尿囊液稀释10倍后，摇匀，经尿囊腔接种9-11日龄SPF鸡胚，每枚胚接种0.1mL，置37℃孵化器继续孵育5天，收获尿囊液于无菌容器中，取样后置于-20℃冻存。

[0032] 2、病毒尿囊液的稀释

[0033] 在病毒灭活之前，需要对收集的尿囊液进行病毒定量，以优化的稀释缓冲液稀释至108.0EID50/ml。在本实施例中，优化的稀释缓冲液是指由100mmol/L Tris-HCl(pH 7.8)、5mmol/L氯化钠、5mmol/L氯化钾、2.0mmol/L氯化钙、1.0mmol/L氯化镁和1mmol/L磷酸氢二钠组成的稀释液。为了说明本实施例所选用的稀释缓冲液的突出效果，还分别以磷酸盐缓冲液(PBS)、去离子水和生理盐水作为病毒稀释缓冲液进行病毒稀释，对稀释后的病毒进行耐热特性测定，以供比较，其比较结果如表1所示。结果表明优化的病毒稀释缓冲液对病毒的保护效果最佳。而其他稀释液对病毒热稳定性影响较大，不能用于后续的疫苗制备。

[0034] 表1不同稀释缓冲液对病毒热稳定性的影响

[0035]

[0036] 3、β-丙内酯灭活病毒尿囊液

[0037] 将稀释的病毒尿囊液，利用β-丙内酯进行灭活处理，同时对灭活的温度、浓度和时间等条件进行了优化。

[0038] 3.1β-丙内酯灭活温度

[0039] 病毒尿囊液经终浓度为0.1％β-丙内酯在37℃和4℃灭活处理2h后，分别取100μL接种5枚9-11日龄SPF鸡胚，收获鸡胚尿囊液，检测HA效价，若HA为阴性可视为灭活完全。灭活检验表明，病毒尿囊液经终浓度为0.1％的β-丙内酯37℃处理2h可灭活完全，保证灭活彻底的情况下，病毒尿囊液的HA血凝效价不变。在4℃条件下处理2h后，不能将病毒完全灭活。本发明所指的β-丙内酯的浓度均为β-丙内酯占稀释后的病毒尿囊液的体积浓度。

[0040] 表2不同温度灭活时间和灭活前后HA

[0041]

[0042] 3.2β-丙内酯灭活浓度

[0043] 利用不同终浓度的β-丙内酯在37℃条件下处理病毒尿囊液2h。分别取100μL接种5枚9-11日龄SPF鸡胚，收获鸡胚尿囊液，检测HA效价，若HA为阴性可视为灭活完全。灭活检验表明，终浓度为0.025％、0.05％的β-丙内酯处理2h均可以使病毒完全灭活，失去血凝活性(如表3所示)。

[0044] 表3不同浓度β-丙内酯对病毒尿囊液的灭活效果

[0045]

[0046] 3.3β-丙内酯灭活时间

[0047] 病毒尿囊液经终浓度为0.025％的β-丙内酯在37℃条件下处理不同时间后，分别取100μL接种5枚9-11日龄SPF鸡胚，收获鸡胚尿囊液，检测HA效价，若HA为阴性可视为灭活完全。灭活检验表明，病毒尿囊液经终浓度为0.025％的BPL 37℃处理1h和2h均可将病毒灭活完全。由于文献报道β-丙内酯有致癌性，37℃处理两小时可以完全水解为无毒成分，因此本实验选择0.025％，37℃灭活两小时作为新城疫病毒液灭活的条件(如表4所示)。

[0048] 表4病毒尿囊液灭活效果检测

[0049]

[0050] 3.4灭活后病毒的耐热活性测定

[0051] 如图1所示，TS09-C经不同浓度的β-丙内酯37℃灭活2h后，耐热特性发生变化，随着β-丙内酯浓度的升高，耐热时间缩短。未灭活的TS09-C 56℃处理60min后仍有血凝活性。β-丙内酯浓度为0.025％实验组的TS09-C经56℃处理40min后仍有血凝活性，利用终浓度为
0.05％的β-丙内酯灭活处理后的TS09-C经56℃处理10min已经没有血凝活性，而用终浓度
0.1％的β-丙内酯灭活处理后的TS09-C经56℃处理5min后就失去血凝活性。因此用终浓度为0.025％的β-丙内酯37℃处理病毒尿囊液2h，就可以达到彻底灭活病毒的目的，并且对病毒的耐热稳定性影响最小。

[0052] 4灭活疫苗的乳化及质检

[0053] 在10号白油中加入硬脂酸铝和司本-80，混匀，其中白油、硬脂酸铝和司本-80的体积比为92:2:6，121℃30min高压灭菌，获得油相。将油相和灭活后的病毒尿囊液按体积比3:1混匀，乳化，即得到新城疫病毒热稳定毒株的灭活疫苗。进行疫苗的质量检验，结果如下：

[0054] 1疫苗的剂型、稳定性和粘度检测均证明制备的疫苗合格。

[0055]

[0056] 2安全检验：

[0057] 用21-35日龄SPF鸡10只，每只肌肉注射或颈部皮下注射疫苗1mL，观察2周，应不出现因疫苗引起的局部或者全身不良反应。

[0058] 检验结果：所有实验的鸡未出现因疫苗引起的局部或者全身不良反应。

[0059] 3效力检验：

[0060] 实验分3组进行，A组采用本发明制备疫苗免疫，B组采用LaSota标准株制备疫苗免疫，C组阴性对照组。

[0061] 血清学方法：将2周龄SPF鸡随机分为3组，每组10只，A和B组的小鸡经肌肉注射疫苗(0.5mL/只)，C组肌肉注射PBS。接种后21天，每只鸡采血、分离血清，进行HI抗体效价测定。阴性对照组HI抗体效价应不高于1:22，免疫鸡HI抗体效价的平均值不低于1:24。

[0062] 检测结果：C组HI抗体效价均低于1:22，A组免疫鸡HI抗体效价平均值为27.3，B组免6.7
疫鸡HI抗体效价平均值为2 。

[0063] 实施例二：疫苗的保存期试验

[0064] 将制备的灭活疫苗置于42℃培养箱中，每隔10天取样检测HA效价，同时设置利用同样方法灭活处理的LaSota标准株为对照组，每个样品设置三个重复。如图2所示，结果显示制备的灭活疫苗在42℃时仍然保持良好的热稳定性，放置60天后病毒的血凝效价没有发生明显的改变，而对照组LaSota的血凝效价已经由初始的28下降至20。表明制备的灭活疫苗热稳定性良好。

[0065] 上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。