一种对柑橘砂皮病菌有抑制作用的细菌及其筛选方法转让专利
申请号 : CN201810230078.0
文献号 : CN108384736B
文献日 : 2019-12-31
发明人 : 易图永 , 龙兆雨 , 洪艳云 , 何可佳 , 谢深喜 , 戴良英
申请人 : 湖南农业大学
摘要 :
本发明公开了一株能安全、无毒、有效的防治柑橘砂皮病（Diaporthe medusaea）的拮抗细菌短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）Y2菌株及其应用与筛选方法。短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）Y2菌株为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.14420。同时，该菌对柑橘炭疽菌、辣椒疫霉菌、草莓灰霉菌、水稻纹枯菌也有一定的抑制作用。目前国内还很少有柑橘砂皮病拮抗菌的报道，尤其是没有报道短小芽孢杆菌对柑橘砂皮病菌的抑制作用。因此，该拮抗菌株具有很好的应用前景。
权利要求 :
1.一种对柑橘砂皮病菌有抑制作用的细菌，其是保藏号为CGMCC No. 14420的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）Y2菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.一种权利要求1所述的对柑橘砂皮病菌有抑制作用的细菌在防治柑橘砂皮病中的应用。
3.一种权利要求1所述的对柑橘砂皮病菌有抑制作用的细菌在防治水稻纹枯菌、辣椒疫霉菌、草莓灰霉菌、柑橘炭疽菌所致植物病害中的应用。
4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于：其利用所述细菌的发酵液、或发酵液提取物进行应用。
5.一种农用杀菌剂，其特征在于：其包含如权利要求1所述的细菌。
6.如权利要求5所述的农用杀菌剂，其特征在于：其包含如权利要求1所述的细菌的发酵液，或其发酵液提取物。
说明书 :
一种对柑橘砂皮病菌有抑制作用的细菌及其筛选方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种对柑橘砂皮病菌有抑制作用的新菌株及其筛选方法。
背景技术
[0002] 柑橘砂皮病（Diaporthe medusaea）是一种真菌性病害，也被称为黑点病，属于柑橘树脂病的一种。柑橘砂皮病的病原菌的有性态为柑橘座间菌(Diaporthe citri)，孢子形态为椭圆形或纺锤形，无色，双胞。无性态为柑橘拟茎点霉菌(Phomopsis citri)，其孢子分为α与β两种。α型孢子为纺锤形，无色，正直，常具2个油球（一端一个），有时油球更多，单胞。β型孢子为线形，无色，正直或者钩状，无油球，单胞。柑橘砂皮病虽然不会直接导致产量损失，但它严重影响了柑橘的外观品质，从而降低了柑橘的经济效益。
[0003] 柑橘砂皮病的病原菌是一种弱寄生菌，病原菌容易侵入生长衰弱或受伤的柑橘树为害。因此，柑橘树遭受冻害造成的冻伤和其他伤口，是本病发生流行的首要条件。如上年低温使树干冻伤，往往次年温湿度适合时病害就可能大量发生。此外，多雨季节也常常造成砂皮病（树脂病）大量发生，主要为害果实、叶片和茎。柑橘砂皮病通常表现为柑橘的叶片和果实上出现红褐至黑色的硬质小黑点，密度疏密不一，就像粘了砂子一样，故称“柑橘砂皮病”。正因为如此，使得柑橘外观受到严重影响，柑橘的价格大打折扣，从而让广大果农遭受重大的经济损失。柑橘砂皮病的病原菌通过菌丝、分生孢子器和分生孢子在病树组织内越冬，来年春季的时候产生大量的分生孢子在枯枝上，可以通过昆虫和雨水进行传播，病原菌可以从伤口处侵入。分生孢子器全年产生分生孢子，在降雨充沛、低温潮湿的情况下， 产生的孢子数量最多，因此在第二年的春季环境的条件十分适宜该病原菌的传播与生长。有人指出，这些黑点的出现，是柑橘作为寄主本身做出防卫反应的产物。也有研究指出，柑橘砂皮的发病条件也与柑橘属的种质有一定关系。
[0004] 目前来看，化学药剂是防治柑橘砂皮病的主要方法。但是长期单一使用某一化学药剂，容易产生抗药性，影响防治效果。同时，化学药剂对环境影响大以及对人体健康的潜在危害。因此，筛选对柑橘砂皮病菌有抑制作用的微生物是防治柑橘砂皮病的最佳途径。
发明内容
[0005] 针对上述问题，本发明人从湖南省长沙市芙蓉区的浏阳河边采集土壤样品，利用NB培养基通过稀释平板法获得细菌的单菌落，再采用平板对峙法筛选对柑橘砂皮病菌有抑制作用的细菌。筛选到的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）对人畜无致病性，能安全地用于柑橘砂皮病的生物防治。同时，该菌对柑橘炭疽菌、辣椒疫霉菌、草莓灰霉菌、水稻纹枯菌也有一定的抑制作用。
[0006] 本发明提供的技术方案是：一种对柑橘砂皮病菌有抑制作用的细菌，其是保藏号为CGMCC No. 14420的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）Y2菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
[0007] 该细菌（短小芽孢杆菌，Bacillus pumilus） Y2菌株已于2017年 7月 13 日为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC所保藏（保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），其保藏号为CGMCC No. 14420，经检测存活。
[0008] 同时，本发明还提供所述的细菌在防治柑橘砂皮病中的应用。
[0009] 本发明所述的细菌对柑橘炭疽菌、辣椒疫霉菌、草莓灰霉菌、水稻纹枯菌也有一定的抑制作用。
[0010] 所述的应用，其利用所述细菌的发酵液、或发酵液提取物进行应用。
[0011] 本发明还提供一种农用杀菌剂，其包含所述的细菌，优选的是其包含所述菌株的发酵液
[0012] 同时，本发明还提供所述对柑橘砂皮病菌有抑制作用的细菌的筛选方法，其步骤如下：
[0013] （1）从土壤中采集细菌样品，采集土样时，先去除表土，取5-20 cm深处的土样；
[0014] （2）利用稀释法进行分离，将土样放入装有小玻璃珠和无菌水的瓶中，震荡，静置后，稀释，制备10-4、10-5、10-6 稀释液，吸取稀释液1ml滴加到NB培养基平板上，涂布均匀，将培养皿放在温箱倒置培养；
[0015] （3）筛选对柑橘砂皮病菌有抑制作用的细菌
[0016] 采用平板对峙法筛选对柑橘砂皮病菌有抑制作用的细菌：将纯化的细菌菌株，用NB培养基培养，柑橘砂皮病菌在PDA培养基上培养7d后，裁成直径7 mm的菌丝块，移入含PDA培养基的培养皿中央，四周对称放置4个不同细菌菌株，培养7至14天后观察测量抑菌圈直径，选择拮抗作用明显的细菌，保存。
[0017] 本发明具有以下有益效果：
[0018] 本发明细菌是发明人从湖南省长沙市芙蓉区的浏阳河边采集土壤样品中分离而得，经鉴定为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus ）Y2菌株，该菌对人畜无致病性，能安全地用于柑橘砂皮病的生物防治。同时，该菌对水稻纹枯菌、辣椒疫霉菌、草莓灰霉菌、柑橘炭疽菌也有一定的抑制作用。目前国内还很少有柑橘砂皮病菌拮抗菌的报道，尤其是没有短小芽孢杆菌对柑橘砂皮病菌的抑制作用。本发明细菌的发酵液稀释50-100倍，对柑橘砂皮病有60%以上的防治效果，因此，该拮抗菌株具有很好的应用前景。
附图说明
[0019] 图1为土壤中细菌的分离结果。
[0020] 图2为细菌Y2与柑橘砂皮病菌的对峙培养（右边为对照）。
[0021] 图3为稀释10倍的菌株Y2发酵滤液对柑橘砂皮菌的抑制作用。
[0022] 图4为细菌Y2的Y2菌株的菌落形态。
[0023] 图5为细菌Y2的16S rDNA扩增结果。
[0024] 图6为细菌Y2的6S rDNA测序结果。
[0025] 图7为菌株Y2的16S rDNA序列BLAST比对结果。
[0026] 图8为菌株Y2对柑橘炭疽菌、辣椒疫霉菌、草莓灰霉菌、水稻纹枯菌的抑制作用。
具体实施方式
[0027] 下面提供实施例以进一步说明本发明。
[0028] 实施例1： 菌株的筛选和鉴定
[0029] 本发明对柑橘砂皮病菌有抑制作用的细菌的筛选方法如下：
[0030] 1、土壤样品的采集
[0031] 从湖南省长沙市芙蓉区的浏阳河附近随机采集土样4份。采集土样时，先去除表土，取5-20 cm深处的土样约200 g，分装标记后带回实验室。
[0032] 2、细菌的分离
[0033] 利用稀释法进行分离。称取土样10 g，放入装有小玻璃珠和无菌水90 ml的三角瓶-4 -5 -6中，震荡20 min稀释液。静置30 s后，依次稀释10倍，制备10 、10 、10 稀释液，分别吸取稀释液0.1 ml滴加到牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏3 g、琼脂 20 g、氯化钠5 g、蛋白胨10 g、蒸馏水 1000 ml，pH 7.0～7.2）平板上，涂布均匀，将培养皿放在28℃的温箱倒置培养。
分离结果请见图1。
分离结果请见图1。
[0034] 3、拮抗细菌的筛选
[0035] 采用平板对峙法筛选拮抗柑橘砂皮病的细菌，筛选结果请见图2。将纯化的细菌菌株，用牛肉膏蛋白胨培养基培养，柑橘砂皮病菌PDA培养基上培养5 d后，用直径7 mm打孔器裁成菌丝块，移入直径7.5 cm的培养皿中央（含PDA培养基），四周对称放置4个菌株。28℃下培养7 d后观察测量抑菌圈直径，选择拮抗作用明显的细菌，保存。
[0036] 4、细菌发酵液对柑橘砂皮病菌的抑制作用
[0037] 将筛选到拮抗效果好的细菌接种于NB液体培养基中，28℃摇床培养7 d过滤，再用细菌过滤器过滤。取发酵滤液3 ml与27 ml PDA混合均匀，倒3个平板，用打孔器分别裁出直径7 mm的菌丝块接种于直径7.5 cm培养皿中央，28℃培养，以无菌水处理为对照，重复3次。15d后测得稀释10倍发酵滤液对柑橘砂皮病的抑制率为73.65%，见图3。
[0038] 5、拮抗菌的种类鉴定
[0039] （1）形态特征
[0040] 在NB平板上28 ℃培养3 d后，在显微镜下观察为杆状，呈单个或链状排列，革兰氏反应为阳性，能运动。菌落形态有不透明、呈乳白色，有粘性，湿润，光滑。
[0041] （2）培养特征
[0042] 细菌在NB培养基上的菌落不透明，表面光滑，呈乳白色（图4）。
[0043] （3）生理生化实验
[0044] 参照《伯杰氏细菌鉴定手册》分别对Y2菌株进行明胶液化、牛奶凝固与胨化、淀粉水解、纤维素上生长及碳源利用等各项试验。发现细菌Y2能够使明胶液化、牛奶凝固、胨化慢。在纤维素上不生长。MR-VP呈阳性结果。产生过氧化氢酶。利用L-阿拉伯糖、D-木糖、蔗糖、乳糖、山梨糖、葡萄糖、甘露醇。不利用鼠李唐、山梨醇。
[0045] （4 ）16S rDNA测序及序列分析
[0046] 请参见图5-7，用CATB方法提取Y2菌株的基因组DNA。用16S rDNA的通用引物（正向引物5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’、反向引物5’-GGYTACCTTGTTACGACTT-3’）对基因组DNA进行PCR扩增。PCR反应体系为20 µl，其中10× PCR缓冲液2µl、10 mmol/L dNTP 0.8 µl、引物0.5 µl、模板DNA 1 µl、Taq酶0.5 µl、ddH2O 14.7 µl。PCR扩增条件：94℃预变性5min，94℃ 变性40s，51℃退火30s，72℃ 延伸80s ，32个循环，最后72℃ 延伸10min。得到1500 bp左右的片段（图5）。经试剂盒纯化后，与T载体进行连接，再转化到大肠杆菌，挑克隆子，菌液PCR验证，送到生工生物工程（上海）股份有限公司测序，序列为1577bp（图6）。将所得序列于GenBank数据库中序列进行BLAST比对，发现与短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）的16S rDNA有非常高的一致性（99%）（图7），表明该菌为短小芽孢杆菌。
[0047] 实施例2：对柑橘炭疽菌、辣椒疫霉菌、草莓灰霉菌、水稻纹枯菌的抑制作用[0048] 通过平板划线对峙法检测菌株Y2对柑橘炭疽菌、辣椒疫霉菌、草莓灰霉菌、水稻纹枯菌的抑制作用。用直径7 mm打孔器将这几种生长在PDA培养基上的病原菌裁成菌丝块，将这几种病原菌的菌丝块接种在PDA培养基的中央，两侧3cm左右处划线接种菌株Y2。发现菌株Y2对这几种病原菌的生长有一定的抑制作用，原本应该生长成圆形的病原菌的菌落成了椭圆形（图8）。实验发现，菌株Y2对草莓灰霉病菌、柑橘炭疽病菌、辣椒疫霉病菌有较强的抑制作用，其抑制带均在7mm以上，对水稻纹枯病菌的抑制作用较差，但抑制带也有2mm。
[0049] 实施例3：应用实施例
[0050] 2017年在麻阳苗族自治县兰村乡园艺场的脐橙园进行了短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus ）Y2菌株的发酵液防治柑橘砂皮病的田间试验，按稀释50倍（15 kg清水中加入300 ml菌液）和100倍（15 kg清水中加入150 ml菌液）2个不同浓度。以当地常用施药方式为对照，第一次：大生300倍+极润3000倍+怀农特1000倍+沃生1000倍；第二次：大生300倍+极润3000倍+怀农特1000倍+沃生1000倍；第三次：大生300倍+极润3000倍+怀农特1000倍+沃生
1000倍；第四次：大生500倍+极润3000倍+怀农特1000倍+沃生1000倍。施药时间为：第一次：
4月29日，第二次：5月25日，第三次：6月18日，第四次：7月24日。以喷等量清水作空白对照。
为加强菌液附着性，用 0.1% 吐温20，既每桶药水加15ml吐温20。调查时为2017年9月12日。
病情调查方法为五点取样法：取每株树东、西、南、北、中5个方位，每个方位取6片叶，记录每片叶片上的病斑数。调查分级标准如下：
1000倍；第四次：大生500倍+极润3000倍+怀农特1000倍+沃生1000倍。施药时间为：第一次：
4月29日，第二次：5月25日，第三次：6月18日，第四次：7月24日。以喷等量清水作空白对照。
为加强菌液附着性，用 0.1% 吐温20，既每桶药水加15ml吐温20。调查时为2017年9月12日。
病情调查方法为五点取样法：取每株树东、西、南、北、中5个方位，每个方位取6片叶，记录每片叶片上的病斑数。调查分级标准如下：
[0051] 病情分级标准（以叶为单位）
[0052] 0级：叶片上无病斑；
[0053] 1级：叶片上病斑数为1－20；
[0054] 3级：叶片上病斑数为21－40；
[0055] 5级：叶片上病斑数为41－60；
[0056] 7级：叶片上病斑数为61－100；
[0057] 9级：叶片上病斑数为100个以上。
[0058] 按下列公式计算病情指数
[0059] ∑(各级病叶数×相对级数值)
[0060] 病情指数＝ ×100
[0061] 调查总叶数× 9
[0062] 对照区病情指数－处理区病情指数
[0063] 防治效果（%）= ×100
[0064] （药后）对照区病情指数
[0065] 表1 不同处理对柑橘砂皮病的防治作用（2017.9.12）
[0066]处理 总叶数 病叶数 病叶率（%） 病情指数 防治效果（%）
稀释50倍 265 101 38.1 16.27 66.9
稀释100倍 241 127 52.7 19.43 60.5
当地常用配方 212 84 39.6 8.59 82.5
对照区（CK） 199 187 94.0 49.19
稀释50倍 265 101 38.1 16.27 66.9
稀释100倍 241 127 52.7 19.43 60.5
当地常用配方 212 84 39.6 8.59 82.5
对照区（CK） 199 187 94.0 49.19
[0067] 2017年9月12日调查，发现稀释50倍的发酵液、稀释100倍的发酵菌液对柑橘砂皮病在叶片上的病斑防治效果分别是66.9%、60.5%。短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus ）Y2菌株发酵液对柑橘砂皮病叶片病斑的防治作用，虽然没有当地常用的化学农药效果好，但也有60%以上，有良好的应用前景。