一种毛颚类现场食谱检测的分子方法

摘要

本发明公开了一种毛颚类现场食谱检测的分子方法。本发明用于现场食谱检测的毛颚类样品要在短时间内完成采集，并用中性鲁哥氏液固定，用本发明的检测引物扩增毛颚类肠道内含物总基因组DNA，扩增序列包含了V2、V3、V4三个18S rDNA可变区，进而构建克隆文库及系统进化树，获得待测毛颚类现场食谱。本发明能全面、高效率地扩增毛颚类肠道内含物序列且有效回避毛颚类自身序列，成本低廉，操作简便，检测灵敏度、分辨率高，最大限度地还原了毛颚类现场食谱，可为准确构建现场浮游食物网提供基础数据，进而为合理利用海洋生物资源和高效监控近岸海洋生态系统过程提供科学依据。

权利要求

1.一种毛颚类现场食谱的检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：

上游引物：5’-GAGCTAATACATGCNAARAVDCTC-3’；

下游引物：5’-GCAAATGCTTTCGCWGTAGTYHGT-3’；

其中，N代表碱基A、T、C或G；R代表碱基A或G；V代表碱基G、A或C；D代表碱基G、A或T；W代表碱基A或T；Y代表碱基C或T；H代表碱基A、T或C。

2.一种毛颚类现场食谱检测的分子方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待测毛颚类肠道内含物的总基因组DNA作为模板，以权利要求1所述的检测引物进行PCR扩增，PCR产物经纯化后构建克隆文库，随机挑取阳性克隆测序，将测序结果在GenBank中进行比对，确定相似度最高的同源序列，构建系统进化树并确定分类地位，获得待测毛颚类现场食谱。

3.根据权利要求2所述的毛颚类现场食谱检测的分子方法，其特征在于，所述的PCR扩增，其反应体系为25μL：包括模板DNA1μL、10×Taq buffer 2.5μL、dNTP Mix 2μL、25μM上游引物1μL、25μM下游引物1μL、5U/μL ExTaq酶0.125μL和ddH2O 17.375μL。

4.根据权利要求2或3所述的毛颚类现场食谱检测的分子方法，其特征在于，所述的PCR扩增，其反应参数为：95℃预变性1min；95℃变性20s，55℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环。

说明书

一种毛颚类现场食谱检测的分子方法

技术领域：

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种毛颚类现场食谱检测的分子方法。背景技术：

[0002] 毛颚类在海洋中数量多、分布广，是重要的肉食性浮游动物。毛颚类主要的食物来源是桡足类等小型浮游动物，同时自身又是较大鱼类的优质饵料，是次级生产力向上传递不可或缺的环节，因此研究其现场食物组成，对于全面认识海洋浮游食物网的结构具有重要的意义。

[0003] 目前毛颚类摄食研究方法主要有肠含物显微镜检分析法、脂肪酸标记法和稳定同位素法。肠道内含物显微镜检分析法是目前应用于毛颚类摄食研究最传统、最普遍、最直接的方法，其可根据肠道食物数量大体估算食物组成甚至摄食率。但该法要求技术人员具有较高的专业知识，且耗时耗力结果又过分依赖人为判断，同时食物形态(如食糜、碎屑等)也不可避免的存在难以识别的情况，因此，该法并不能全面地反映毛颚类的现场摄食情况。脂肪酸标记法通过检测特征脂肪酸来确定食物来源，可反映摄食者在一段时间内的摄食情况，但由于肉食性毛颚类有较高的代谢率，有些食物中的脂肪酸成分可能还没有被吸收就被排出，因此误差较大，且脂肪酸标记无法确定到具体食物种类。稳定同位素法能反映毛颚类食物的来源和营养级，但也是无法精确鉴定具体的食物种类。以物种DNA信息作为标记的分子生物学检测方法，是一种灵敏度高且快速的食谱鉴定方法，目前已被广泛应用于海洋浮游动物的摄食研究，如桡足类、南极磷虾等。但在毛颚类摄食研究中，目前仅有针对特定食物应用特异性引物进行检测的研究，还没有应用到现场食谱检测的方法。发明内容：

[0004] 本发明的目的是提供一种毛颚类现场食谱检测的分子方法。

[0005] 本发明基于18S rDNA序列，设计一对能全面、高效率地扩增毛颚类肠道内含物序列且有效回避毛颚类自身序列的引物，18S rDNA能反映物种间的亲缘关系和体现物种间的差异，在GenBank中序列信息丰富，具有良好的信息平台，是鉴定真核生物物种的理想研究区域。本发明的特异性引物可以扩增出毛颚类肠道内含物微量DNA，灵敏度高；通过构建克隆文库，与GenBank中真核生物18S rDNA序列库进行比对，精确鉴定食物种类，准确度与精度高；并且方法快速、易操作。

[0006] 本发明的第一个目的是提供一种毛颚类现场食谱的检测引物，所述的检测引物如下所示：

[0007] 上游引物：5’-GAGCTAATACATGCNAARAVDCTC-3’(如SEQ ID NO.1所示)；

[0008] 下游引物：5’-GCAAATGCTTTCGCWGTAGTYHGT-3’(如SEQ ID NO.2所示)；

[0009] 其中，N代表碱基A、T、C或G；R代表碱基A或G；V代表碱基G、A或C；D代表碱基G、A或T；W代表碱基A或T；Y代表碱基C或T；H代表碱基A、T或C。

[0010] 本发明的第二个目的是提供一种毛颚类现场食谱检测的分子方法，包括以下步骤：提取待测毛颚类肠道内含物的总基因组DNA作为模板，以上述的检测引物进行PCR扩增，PCR产物经纯化后构建克隆文库，随机挑取阳性克隆测序，将测序结果在GenBank中进行比对，确定相似度最高的同源序列，构建系统进化树并确定分类地位，获得待测毛颚类现场食谱。

[0011] 所述的PCR扩增，其反应体系优选为25μL：包括模板DNA1μL、10×Taq buffer 2.5μL、dNTP Mix 2μL、25μM上游引物1μL、25μM下游引物1μL、5U/μLExTaq酶0.125μL和ddH2O 17.375μL。

[0012] 所述的PCR扩增，其反应参数优选为：95℃预变性1min；95℃变性20s，55℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环。

[0013] 本发明能全面、高效率地扩增毛颚类肠道内含物序列且有效回避毛颚类自身序列，成本低廉，操作简便，检测灵敏度、分辨率高，最大限度地还原了毛颚类现场食谱，可为准确构建现场浮游食物网提供基础数据，进而为合理利用海洋生物资源和高效监控近岸海洋生态系统过程提供科学依据。附图说明：

[0014] 图1是通用引物18SCOMF/R与毛颚类现场食谱特异性引物18S chaetognatha diet primer set扩增南海毛颚类优势种自身肌肉组织DNA的凝胶电泳图；其中，左侧5个样品(左侧泳道1、2、3、+、-)为通用引物18SCOMF/R扩增；右侧5个样品(右侧泳道1、2、3、+、-)为毛颚类现场食谱特异性引物18S chaetognatha diet primer set扩增；1为肥胖软箭虫；2为凶形箭虫；3为小形箭虫；+为阳性对照；–为阴性对照。

[0015] 图2是用毛颚类现场食谱特异性引物18S chaetognatha diet primer set扩增毛颚类肠道内含物DNA序列凝胶电泳图；其中，1为2014年7月三亚湾肥胖软箭虫样品；2为2016年5月南海南部肥胖软箭虫样品；3为2016年5月南海南部凶形箭虫样品；+为阳性对照；–为阴性对照。

[0016] 图3是2016年5月南海南部肥胖软箭虫现场食谱18S rDNA序列构建的进化树(NJ树)；其中，NHZ-S-F-1～NHZ-S-F-16为肥胖软箭虫食物种类。

[0017] 图4是2016年5月南海南部凶形箭虫现场食谱18S rDNA序列构建的进化树(NJ树)；其中，NHZ-S-X-1～NHZ-S-X-10为凶形箭虫食物种类。

[0018] 图5是2014年7月三亚湾肥胖软箭虫现场食谱18S rDNA序列构建的进化树(NJ树)；其中，SYB-S-F-1～SYB-S-F-10为肥胖软箭虫食物种类。
具体实施方式：

[0019] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

[0020] 如图1所示，用本发明的毛颚类现场食谱特异性引物18S chaetognatha diet primer set(上游引物：5’-GAGCTAATACATGCNAARAVDCTC-3’，下游引物：5’-GCAAATGCTTTCG CWGTAGTYHGT-3’；其中，N代表碱基A、T、C或G；R代表碱基A或G；V代表碱基G、A或C；D代表碱基G、A或T；W代表碱基A或T；Y代表碱基C或T；H代表碱基A、T或C；扩增序列包含了V2、V3、V4三个18S  rDNA可变区，长度为780bp)扩增南海区域常见毛颚类优势种肥胖软箭虫(Flaccisagitta enflata)、凶形箭虫(Ferosagitta ferox)和小形箭虫(Aidanosagitta neglecta)肌肉组织DNA，均未见扩增出条带，另用18S通用引物18SCOMF/R(18SCOMF：5’-TGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGCCACCAACTAAGAACGG CCATGCA-3’，18SCOMR：5’-CACCTACGGAAACCTTGTTACGACGTCGTAACAAGGTTT CCGTAGGTG-3’，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示)扩增，均可得到一条约1800bp的清晰条带，经检测均为毛颚类序列，说明本发明的毛颚类现场食谱特异性引物18S chaetognatha diet primer set可以有效避免扩增毛颚类序列。

[0021] 实施例1：

[0022] 于2016年5月，用浅水I型网(网衣145cm，网口面积0.2m2，网目孔径为505μm)(也可以用II型浮游生物网)在南海南部垂直拖网采集浮游动物，为尽可能避免采样和保存时毛颚类的排便行为，保持拖网速度为70cm/s，采集样品后1min内用中性鲁戈氏液固定样品，使中性鲁戈氏液终浓度为体积分数2％。使用体式显微镜(Leica S8AP0)鉴定浮游动物，并挑选毛颚类优势种肥胖软箭虫(Flaccisagitta enflata)IV期30只、凶形箭虫(Ferosagitta ferox)IV期30只，用0.22μm过滤的无菌海水反复冲洗≥3次，确保其体表无附着物，用吸水纸吸干水分，转移至1.5mL离心管中，分别用CTAB法提取肥胖软箭虫和凶形箭虫肠道内含物总基因组DNA，用Nanodrop 2000分光光度计检测DNA浓度分别为240.6ng/μL、151.7ng/μL。使用生工生物工程公司合成的毛颚类现场食谱特异性引物18S chaetognatha diet primer  set(上游引物：5’-GAGCTAATACATGCNAARAVDCTC-3’，下游引物：5’-GCAAATGCTTTCGCWGTAGTYHGT-3’；其中，N代表碱基A、T、C或G；R代表碱基A或G；V代表碱基G、A或C；D代表碱基G、A或T；W代表碱基A或T；Y代表碱基C或T；H代表碱基A、T或C，该引物可回避毛颚类自身序列，但可尽可能地扩增其他真核生物18S rDNA序列，扩增序列包含了V2、V3、V4三个18S rDNA可变区，长度为780bp)按表1的PCR扩增反应体系和表2的反应程序扩增DNA(肠道内含物总基因组DNA)，1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果如图2所示，产生一条约
780bp的特异性电泳条带。将获得的特异性条带使用Zymo Gel Recovery Kit进行胶回收和纯化，纯化产物先进行加Poly A处理，反应体系为：PCR纯化产物8μL，10×Exbuffer 1.5μL，dNTPMix 1.5μL，5U/μLExTaq酶0.1μL，ddH2O 3.9μL；反应参数为72℃维持20min，用Zymo DNAclean and Concentration Kit进行纯化，用12μLddH2O溶解纯化产物。纯化产物再与载体Pmd 18-T vector连接，连接体系为：纯化产物4μL，Pmd 18-T vector(50ng/μL)1μL，Solution I 5μL，16℃过夜(12-16h)后按常规操作转化到TaKaRa生物公司的感受态细胞E.coli Competent Cells DH5α，用加X-Gal、IPTG、氨苄青霉素的LB平板进行蓝白斑筛选。
在超净工作台上随机挑取阳性克隆摇菌，并送至立菲生物技术有限公司测序。将测序得到的序列进行判读，去掉两端的引物，使用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)与GenBank数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行比对，下载相似度最高的前几条有种名的同源序列(相似度99％及以上，覆盖度90％及以上)，去掉引物序列后与测得的序列进行排列(CLUSTALW1.8)，使用MEGA7.0构建系统进化树，算法选择邻接法(Neighbour-Joining NJ)。

[0023] 表1.毛颚类肠道内含物的18S rDNA序列PCR扩增反应体系

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[0025] 表2.PCR扩增毛颚类肠道内含物的18S rDNA序列的反应参数

[0026]

[0027] 其中引物初始浓度为25μM、退火温度为55℃时，扩增效果最好。

[0028] 结果如图3、4所示，检测到丰富的食物种类，南海南部肥胖软箭虫食物类群涵盖栉水母、腔肠动物、真菌、桡足类、软体动物和棘皮动物6大类群，这些种类均为南海南部常见种，桡足类种类多样性最丰富，包括6个属，角水蚤属Pontella、唇角水蚤属Labidocera、哲水蚤属Calanus、筛哲水蚤属Cosmocalanus、拟真哲水蚤属Pareucalanus和次真哲水蚤属Subeucalanus。其次为腔肠动物，有3种，包括钵水母纲的Nausithoe、小舌水母属Liriope和双生水母属Diphyes。据以往肠道内含物分析法，本次检测到的少量棘皮动物和软体动物种类很有可能是以卵的形式被摄食，另检测到少量海洋真菌。从图4中可以看出，南海南部凶形箭虫食物种类丰富，食物类型涵盖了腔肠动物、真菌、硅藻、桡足类、软体动物以及棘皮动物6大类群，这些种类均为南海南部常见种，包含三个属的桡足类，纺锤水蚤属Acartia、角水蚤属Pontella和宽水蚤Temora；钵水母纲的Nausithoe以及小舌水母属Liriope；另检测到硅藻角毛藻属Chaetoceros、软体动物和棘皮动物，检测结果中未包含毛颚类序列，表明该引物可以有效回避毛颚类自身序列并高效扩增食物DNA，可以很好地应用于毛颚类现场食谱的特异性检测。

[0029] 实施例2：

[0030] 于2014年7月，用浅水I型网(网衣145cm，网口面积0.2m2，网目孔径为505μm)(也可以用II型浮游生物网)在三亚湾垂直拖网采集浮游动物，为尽可能避免采样和保存时毛颚类的排便行为，保持拖网速度为70cm/s，采集样品后1min内用中性鲁戈氏液固定样品，使中性鲁戈氏液终浓度为体积分数2％。使用体式显微镜(Leica S8AP0)鉴定浮游动物并挑选毛颚类优势种肥胖软箭虫(Flaccisagitta enflata)II期30只，用0.22μm过滤的无菌海水反复冲洗≥3次，确保其体表无附着物，用吸水纸吸干水分，转移至1.5mL离心管中，用CTAB法提取肥胖软箭虫肠道内含物总基因组DNA，用Nanodrop 2000分光光度计检测DNA浓度为180.1ng/μL。用在生工生物工程公司合成的毛颚类现场食谱特异性引物18S chaetognatha diet primer set(上游引物：5’-GAGCTAATACATGCNAARAVDCTC-3’，下游引物：5’-GCAAATGCTTTCGCWGTAGTYHGT-3’；其中，N代表碱基A、T、C或G；R代表碱基A或G；V代表碱基G、A或C；D代表碱基G、A或T；W代表碱基A或T；Y代表碱基C或T；H代表碱基A、T或C，该引物可回避毛颚类自身序列，但可尽可能地扩增其他真核生物18S rDNA序列，扩增序列包含了V2、V3、V4三个18S rDNA可变区，长度为780bp)按表1的PCR扩增反应体系和表2的反应程序扩增肠道内含物总基因组DNA8管(每管25μL)，以1％琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图2所示，产生一条约780bp的特异性电泳条带。将所获得的电泳特异性条带用Zymo Gel Recovery Kit进行胶回收并纯化后，纯化产物先进行加Poly A处理，反应体系为：PCR纯化产物8μL，10×Exbuffer 1.5μL，dNTPMix1.5μL，5U/μLExTaq酶0.1μL，ddH2O 3.9μL；反应参数为72℃维持
20min，用Zymo DNA clean and Concentration Kit进行纯化，用12μL ddH2O溶解纯化产物。纯化产物再与载体Pmd18-T vector连接，连接体系为：纯化产物4μL，Pmd 18-T vector(50ng/μL)1μL，Solution I 5μL，16℃过夜(12-16h)后，按常规操作转化到TaKaRa生物公司的感受态细胞E.coli Competent Cells DH5α，用加X-Gal、IPTG、氨苄青霉素的LB平板进行蓝白斑筛选。在超净工作台上挑取阳性克隆摇菌送至立菲生物技术有限公司测序。将测序得到的序列进行判读，去掉两端的引物，使用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)与GenBank数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行比对，下载相似度最高的前几条有种名的同源序列(相似度92％及以上，覆盖度95％及以上)，去掉引物序列后与测得的序列进行排列(CLUSTALW1.8)，使用MEGA7.0构建系统进化树，算法选择邻接法(NJ)。

[0031] 结果如图5所示，检测出丰富的食物种类。食物类型涵盖了桡足类、硅藻、栉水母、棘皮类4大类群，这些种类均为三亚湾常见种，包含5个属的桡足类，歪水蚤属Tortanus、平头水蚤属Candacia、宽水蚤属Temora、Sulcanus和Canthocalanus；硅藻中的角毛藻属Chaetoceros、栉水母中的侧腕水母Pleurobrachchia和带水母Cestum；另检测到一些棘皮动物。未检测到毛颚类序列，表明该引物可以有效回避毛颚类自身序列，并高效扩增食物DNA，可以很好地应用于毛颚类现场食谱的特异性检测。

[0032] 以上内容是结合优选技术方案对本发明所做的进一步详细说明，不能认定发明的具体实施仅限于这些说明。对本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出简单的推演及替换，都应当视为本发明的保护范围。