本发明提供了基于白三叶转录组序列开发的EST‑SSR引物组及其应用，属于SSR分子标记技术领域。本发明提供了基于白三叶转录组序列开发的EST‑SSR引物组，所述的48对EST‑SSR引物来自白三叶转录组序列，具有数量大、多态性丰富、扩增稳定、重复性好、便于统计等优点，可丰富白三叶可利用SSR引物数量，有效用于白三叶种质遗传多样性分析。
1.基于白三叶转录组序列开发的EST-SSR引物组，其特征在于，所述EST-SSR引物组包括以下48对引物：如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的引物ZHS04-F，如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的引物ZHS04-R；
如序列表中SEQ ID No.3所示的核苷酸序列的引物ZHS06-F，如序列表中SEQ ID No.4所示的核苷酸序列的引物ZHS06-R；
如序列表中SEQ ID No.5所示的核苷酸序列的引物ZHS07-F，如序列表中SEQ ID No.6所示的核苷酸序列的引物ZHS07-R；
如序列表中SEQ ID No.7所示的核苷酸序列的引物ZHS08-F，如序列表中SEQ ID No.8所示的核苷酸序列的引物ZHS08-R；
如序列表中SEQ ID No.9所示的核苷酸序列的引物ZHS09-F，如序列表中SEQ ID No.10所示的核苷酸序列的引物ZHS09-R；
如序列表中SEQ ID No.11所示的核苷酸序列的引物ZHS10-F，如序列表中SEQ ID No.12所示的核苷酸序列的引物ZHS10-R；
如序列表中SEQ ID No.13所示的核苷酸序列的引物ZHS11-F，如序列表中SEQ ID No.14所示的核苷酸序列的引物ZHS11-R；
如序列表中SEQ ID No.15所示的核苷酸序列的引物ZHS14-F，如序列表中SEQ ID No.16所示的核苷酸序列的引物ZHS14-R；
如序列表中SEQ ID No.17所示的核苷酸序列的引物ZHS19-F，如序列表中SEQ ID No.18所示的核苷酸序列的引物ZHS19-R；
如序列表中SEQ ID No.19所示的核苷酸序列的引物ZHS26-F，如序列表中SEQ ID No.20所示的核苷酸序列的引物ZHS26-R；
如序列表中SEQ ID No.21所示的核苷酸序列的引物ZHS34-F，如序列表中SEQ ID No.22所示的核苷酸序列的引物ZHS34-R；
如序列表中SEQ ID No.23所示的核苷酸序列的引物ZHS35-F，如序列表中SEQ ID No.24所示的核苷酸序列的引物ZHS35-R；
如序列表中SEQ ID No.25所示的核苷酸序列的引物ZHS38-F，如序列表中SEQ ID No.26所示的核苷酸序列的引物ZHS38-R；
如序列表中SEQ ID No.27所示的核苷酸序列的引物ZHS39-F，如序列表中SEQ ID No.28所示的核苷酸序列的引物ZHS39-R；
如序列表中SEQ ID No.29所示的核苷酸序列的引物ZHS40-F，如序列表中SEQ ID No.30所示的核苷酸序列的引物ZHS40-R；
如序列表中SEQ ID No.31所示的核苷酸序列的引物ZHS41-F，如序列表中SEQ ID No.32所示的核苷酸序列的引物ZHS41-R；
如序列表中SEQ ID No.33所示的核苷酸序列的引物ZHS50-F，如序列表中SEQ ID No.34所示的核苷酸序列的引物ZHS50-R；
如序列表中SEQ ID No.35所示的核苷酸序列的引物ZHS51-F，如序列表中SEQ ID No.36所示的核苷酸序列的引物ZHS51-R；
如序列表中SEQ ID No.37所示的核苷酸序列的引物ZHS52-F，如序列表中SEQ ID No.38所示的核苷酸序列的引物ZHS52-R；
如序列表中SEQ ID No.39所示的核苷酸序列的引物ZHS56-F，如序列表中SEQ ID No.40所示的核苷酸序列的引物ZHS56-R；
如序列表中SEQ ID No.41所示的核苷酸序列的引物ZHS57-F，如序列表中SEQ ID No.42所示的核苷酸序列的引物ZHS57-R；
如序列表中SEQ ID No.43所示的核苷酸序列的引物ZHS59-F，如序列表中SEQ ID No.44所示的核苷酸序列的引物ZHS59-R；
如序列表中SEQ ID No.45所示的核苷酸序列的引物ZHS60-F，如序列表中SEQ ID No.46所示的核苷酸序列的引物ZHS60-R；
如序列表中SEQ ID No.47所示的核苷酸序列的引物ZHS61-F，如序列表中SEQ ID No.48所示的核苷酸序列的引物ZHS61-R；
如序列表中SEQ ID No.49所示的核苷酸序列的引物ZHS64-F，如序列表中SEQ ID No.50所示的核苷酸序列的引物ZHS64-R；
如序列表中SEQ ID No.51所示的核苷酸序列的引物ZHS72-F，如序列表中SEQ ID No.52所示的核苷酸序列的引物ZHS72-R；
如序列表中SEQ ID No.53所示的核苷酸序列的引物ZHS73-F，如序列表中SEQ ID No.54所示的核苷酸序列的引物ZHS73-R；
如序列表中SEQ ID No.55所示的核苷酸序列的引物ZHS75-F，如序列表中SEQ ID No.56所示的核苷酸序列的引物ZHS75-R；
如序列表中SEQ ID No.57所示的核苷酸序列的引物ZHS76-F，如序列表中SEQ ID No.58所示的核苷酸序列的引物ZHS76-R；
如序列表中SEQ ID No.59所示的核苷酸序列的引物ZHS77-F，如序列表中SEQ ID No.60所示的核苷酸序列的引物ZHS77-R；
如序列表中SEQ ID No.61所示的核苷酸序列的引物ZHS78-F，如序列表中SEQ ID No.62所示的核苷酸序列的引物ZHS78-R；
如序列表中SEQ ID No.63所示的核苷酸序列的引物ZHS80-F，如序列表中SEQ ID No.64所示的核苷酸序列的引物ZHS80-R；
如序列表中SEQ ID No.65所示的核苷酸序列的引物ZHS81-F，如序列表中SEQ ID No.66所示的核苷酸序列的引物ZHS81-R；
如序列表中SEQ ID No.67所示的核苷酸序列的引物ZHS84-F，如序列表中SEQ ID No.68所示的核苷酸序列的引物ZHS84-R；
如序列表中SEQ ID No.69所示的核苷酸序列的引物ZHS89-F，如序列表中SEQ ID No.70所示的核苷酸序列的引物ZHS89-R；
如序列表中SEQ ID No.71所示的核苷酸序列的引物ZHS92-F，如序列表中SEQ ID No.72所示的核苷酸序列的引物ZHS92-R；
如序列表中SEQ ID No.73所示的核苷酸序列的引物ZHS93-F，如序列表中SEQ ID No.74所示的核苷酸序列的引物ZHS93-R；
如序列表中SEQ ID No.75所示的核苷酸序列的引物ZHS94-F，如序列表中SEQ ID No.76所示的核苷酸序列的引物ZHS94-R；
如序列表中SEQ ID No.77所示的核苷酸序列的引物ZHS95-F，如序列表中SEQ ID No.78所示的核苷酸序列的引物ZHS95-R；
如序列表中SEQ ID No.79所示的核苷酸序列的引物ZHS96-F，如序列表中SEQ ID No.80所示的核苷酸序列的引物ZHS96-R；
如序列表中SEQ ID No.81所示的核苷酸序列的引物ZHS97-F，如序列表中SEQ ID No.82所示的核苷酸序列的引物ZHS97-R；
如序列表中SEQ ID No.83所示的核苷酸序列的引物ZHS100-F，如序列表中SEQ ID No.84所示的核苷酸序列的引物ZHS100-R；
如序列表中SEQ ID No.85所示的核苷酸序列的引物ZHS103-F，如序列表中SEQ ID No.86所示的核苷酸序列的引物ZHS103-R；
如序列表中SEQ ID No.87所示的核苷酸序列的引物ZHS104-F，如序列表中SEQ ID No.88所示的核苷酸序列的引物ZHS104-R；
如序列表中SEQ ID No.89所示的核苷酸序列的引物ZHS105-F，如序列表中SEQ ID No.90所示的核苷酸序列的引物ZHS105-R；
如序列表中SEQ ID No.91所示的核苷酸序列的引物ZHS106-F，如序列表中SEQ ID No.92所示的核苷酸序列的引物ZHS106-R；
如序列表中SEQ ID No.93所示的核苷酸序列的引物ZHS108-F，如序列表中SEQ ID No.94所示的核苷酸序列的引物ZHS108-R；
如序列表中SEQ ID No.95所示的核苷酸序列的引物ZHS109-F，如序列表中SEQ ID No.96所示的核苷酸序列的引物ZHS109-R。
2.权利要求1所述引物组在白三叶遗传多样性分析及种质资源遗传系谱分析中的应用；
所述白三叶遗传多样性分析及种质资源遗传系谱分析的方法，包括以下步骤：
2)每对引物的正向引物分别加上通用M13接头序列，得到M13接头正向引物，在所述M13接头正向引物标记上荧光基团，得到荧光标记的M13接头正向引物和M13接头正向引物；
3)以所述步骤1)中提取的待测样品DNA为模板，以反向引物、所述步骤2)获得的M13接头正向引物和荧光标记的M13荧光接头正向引物使用三引物法进行PCR扩增，得到荧光PCR扩增产物；
所述PCR扩增的程序为：95℃预变性5min；然后95℃变性30s，57.5-60℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；接着95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共8个循环；最后72℃末端延伸10min；
4)将所述步骤3)得到的荧光PCR扩增产物进行毛细管荧光电泳检测，读取毛细管电泳数据，统计条带检测结果；
5)利用所述步骤4)中的统计条带检测结果进行白三叶遗传多样性分析和种质遗传系谱分析；所述步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序的限制；
所述白三叶遗传多样性分析和种质遗传系谱分析的方法包括以下步骤：
A.根据所述步骤4)中条带检测结果，建立原始矩阵；
B.根据所述步骤A中的原始矩阵，统计EST-SSR标记扩增产物的条带总数和多态性条带数；根据每对引物原始矩阵，利用POPGEN v1.32软件计算各引物对的Shannon信息多样性指数、Nei’s遗传多样性指数；
C.根据所述步骤A中的原始矩阵利用软件NTSYSpc2.0计算遗传相似系数并利用UPGMA方法构建聚类树状图。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述建立原始矩阵的方法如下：将所述步骤4中的条带检测结果进行比对、校正，按照扩增条带的分子量从大到小编号和读取，有扩增条带出现记为“1”，无条带出现记为“0”。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤3)中PCR扩增体系总体积为10μL：
1μL模板DNA，5μL的2×TaqPCRMasterMix，0.1μL浓度为10pmol/μL的正向引物，0.4μL浓度为
10pmol/μL的反向引物，0.4μL浓度为10pmol/μL的带荧光M13正向引物，余量为ddH2O。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤2)中荧光基团为HEX荧光基团。
6.根据权利要求2或5所述的应用，其特征在于，所述步骤2)通用M13接头序列如序列表中SEQ ID No.97所示的核苷酸序列。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤1)中白三叶样品为白三叶叶片。
基于白三叶转录组序列开发的EST-SSR引物组及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于SSR分子标记技术领域，具体涉及基于白三叶转录组序列开发的EST-SSR引物组及其应用。
背景技术
[0002] 白三叶(Trifolium repens L.)是豆科(Leguminosae)三叶草属(Trifolium L.)多年生草本植物，原产于欧洲，现广泛分布于世界温带和亚热带地区，我国西南、华中、华北、东北等地区均有种植，在新疆、云南、四川、贵州、广西、江苏、浙江、湖南、湖北、江西和陕西等省区有野生分布。白三叶草质优良，适口性好，加之匍匐生长和从空气中固氮的特性，被世界各地广泛栽培，已成为水土保持、环境绿化、生态建设和家畜生产等方面的主要利用草种之一，在草食畜牧业发展、生态环境建设和草地农业系统中占有着重要的地位。
[0003] 白三叶生态价值和经济价值很高，然而，其种质资源研究工作仍然不足，虽然分子标记技术如AFLP、ISSR、SRAP、SSR已经用于白三叶研究，但特异性引物较少，它们多为其他物种上的通用引物，已经限制了白三叶分子育种技术的发展。
发明内容
[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供基于白三叶转录组序列开发的EST-SSR引物组及其应用，不仅能够明显扩增多态性条带还具有稳定扩增的特点。
[0005] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0006] 本发明提供了基于白三叶转录组序列开发的EST-SSR引物组，所述EST-SSR引物组包括以下48对引物中至少两对：所述48对引物具有如序列表中SEQ ID No.1～96所示的核苷酸序列。
[0007] 本发明提供了引物组在白三叶遗传多样性分析及种质资源遗传系谱分析中的应用。
[0008] 优选的，所述白三叶遗传多样性分析及种质资源遗传系谱分析的方法，包括以下步骤：
[0009] 1)提取待测白三叶样品基因组DNA；
[0010] 2)每组引物的正向引物加上通用M13接头序列，得到的含有M13接头的正向引物标记上荧光基团，得到M13接头引物和荧光基团标记的M13荧光接头引物；
[0011] 3)以所述步骤1)中提取的待测样品DNA为模板，以反向引物、所述步骤2)得到的M13荧光接头引物和荧光基团标记的M13荧光接头引物使用三引物法进行PCR扩增，得到荧光PCR扩增产物；
[0012] 4)将所述步骤3)得到的荧光PCR扩增产物进行毛细管荧光电泳检测，读取毛细管电泳数据，统计条带检测结果；
[0013] 5)利用所述步骤4)中的统计条带检测结果进行白三叶遗传多样性分析和种质遗传系谱分析；
[0014] 所述步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序的限制。
[0015] 优选的，所述白三叶遗传多样性分析和种质遗传系谱分析的方法包括以下步骤：
[0016] A.根据所述步骤4)中条带检测结果，建立原始矩阵；
[0017] B.根据所述步骤A中的原始矩阵，统计EST-SSR标记扩增产物的条带总数和多态性条带数；根据每对引物原始矩阵，利用POPGEN v1.32软件计算各引物对的Shannon信息多样性指数、Nei’s遗传多样性指数；
[0018] C.根据所述步骤A中的原始矩阵利用软件NTSYSpc2.0计算遗传相似系数并利用UPGMA方法构建聚类树状图。
[0019] 优选的，所述建立原始矩阵的方法如下：将所述步骤4中的条带检测结果进行人工比对、校正，按照扩增条带的分子量从大到小编号和读取，有扩增条带出现记为“1”，无条带出现记为“0”。
[0020] 优选的，所述步骤3)中PCR扩增体系为：1μL模板DNA，5μL的2×Taq PCR Master Mix，0.1μL浓度为10pmol/μL的正向引物，0.4μL浓度为10pmol/μL的反向引物，0.4μL浓度为10pmol/μL的带荧光M13正向引物，余量为ddH2O。
[0021] 优选的，所述步骤3)中所述PCR扩增程序为：95℃预变性5min；然后95℃变性30s，57.5～60℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；接着95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸
30s，共8个循环；最后72℃末端延伸10min。
[0022] 优选的，所述步骤2)中荧光基团为HEX荧光基团。
[0023] 优选的，所述步骤2)通用M13接头序列具有如序列表中SEQ ID No.97所示的核苷酸序列。
[0024] 优选的，所述步骤1)中白三叶样品为白三叶叶片。
[0025] 本发明提供了基于白三叶转录组序列开发的EST-SSR引物组，本发明所述的48对EST-SSR引物来自白三叶转录组序列，具有数量大、多态性丰富、扩增稳定、重复性好、便于统计等优点，可丰富白三叶可利用SSR引物数量，有效用于白三叶种质遗传多样性分析。
附图说明
[0026] 图1为实施例2中49份白三叶材料的UPGMA聚类图(48对引物)；
[0027] 图2为实施例3中49份白三叶材料的UPGMA聚类图(2对引物)；
[0028] 图3为实施例4中49份白三叶材料的UPGMA聚类图(3对引物)；
[0029] 图4为实施例5中49份白三叶材料的UPGMA聚类图(6对引物)；
[0030] 图5为白三叶材料的毛细管荧光电泳检测峰图(部分)。
具体实施方式
[0031] 本发明提供了基于白三叶转录组序列开发的EST-SSR引物组，所述EST-SSR引物组包括以下48对引物中的至少两对：
[0032] 引物ZHS04-F，引物ZHS04-R；引物ZHS06-F，引物ZHS06-R；
[0033] 引物ZHS07-F，引物ZHS07-R；引物ZHS08-F，引物ZHS08-R；
[0034] 引物ZHS09-F，引物ZHS09-R；引物ZHS10-F，引物ZHS10-R；
[0035] 引物ZHS11-F，引物ZHS11-R；引物ZHS14-F，引物ZHS14-R；
[0036] 引物ZHS19-F，引物ZHS19-R；引物ZHS26-F，引物ZHS26-R；
[0037] 引物ZHS34-F，引物ZHS34-R；引物ZHS35-F，引物ZHS35-R；
[0038] 引物ZHS38-F，引物ZHS38-R；引物ZHS39-F，引物ZHS39-R；
[0039] 引物ZHS40-F，引物ZHS40-R；引物ZHS41-F，引物ZHS41-R；
[0040] 引物ZHS50-F，引物ZHS50-R；引物ZHS51-F，引物ZHS51-R；
[0041] 引物ZHS52-F，引物ZHS52-R；引物ZHS56-F，引物ZHS56-R；
[0042] 引物ZHS57-F，引物ZHS57-R；引物ZHS59-F，引物ZHS59-R；
[0043] 引物ZHS60-F，引物ZHS60-R；引物ZHS61-F，引物ZHS61-R；
[0044] 引物ZHS64-F，引物ZHS64-R；引物ZHS72-F，引物ZHS72-R；
[0045] 引物ZHS73-F，引物ZHS73-R；引物ZHS75-F，引物ZHS75-R；
[0046] 引物ZHS76-F，引物ZHS76-R；引物ZHS77-F，引物ZHS77-R；
[0047] 引物ZHS78-F，引物ZHS78-R；引物ZHS80-F，引物ZHS80-R；
[0048] 引物ZHS81-F，引物ZHS81-R；引物ZHS84-F，引物ZHS84-R；
[0049] 引物ZHS89-F，引物ZHS89-R；引物ZHS92-F，引物ZHS92-R；
[0050] 引物ZHS93-F，引物ZHS93-R；引物ZHS94-F，引物ZHS94-R；
[0051] 引物ZHS95-F，引物ZHS95-R；引物ZHS96-F，引物ZHS96-R；
[0052] 引物ZHS97-F，引物ZHS97-R；引物ZHS100-F，引物ZHS100-R；
[0053] 引物ZHS103-F，引物ZHS103-R；引物ZHS104-F，引物ZHS104-R；
[0054] 引物ZHS105-F，引物ZHS105-R；引物ZHS106-F，引物ZHS106-R；
[0055] 引物ZHS108-F，引物ZHS108-R；引物ZHS109-F，引物ZHS109-R。
[0056] 在本发明中，所述EST-SSR引物组包括两对时，48对引物中的任意两对均可，具体优选为引物ZHS72-F和引物ZHS72-R；引物ZHS78-F和引物ZHS78-R。
[0057] 在本发明中，所述EST-SSR引物组包括三对时，48对引物中的任意三对均可，具体优选为引物ZHS19-F，引物ZHS19-R；引物ZHS72-F，引物ZHS72-R；引物ZHS78-F，引物ZHS78-R。
[0058] 在本发明中，所述EST-SSR引物组包括四对时，48对引物中的任意四对均可，具体优选为引物ZHS08-F，引物ZHS08-R；引物ZHS09-F，引物ZHS09-R；引物ZHS10-F，引物ZHS10-R；引物ZHS11-F，引物ZHS11-R。
[0059] 在本发明中，所述EST-SSR引物组包括五对时，48对引物中的任意五对均可，具体优选为引物ZHS14-F，引物ZHS14-R；引物ZHS19-F，引物ZHS19-R；引物ZHS26-F，引物ZHS26-R；引物ZHS34-F，引物ZHS34-R；引物ZHS35-F，引物ZHS35-R。
[0060] 在本发明中，所述EST-SSR引物组包括六对时，48对引物中的任意六对均可，具体优选为引物ZHS19-F，引物ZHS19-R；引物ZHS40-F，引物ZHS40-R；引物ZHS72-F，引物ZHS72-R；引物ZHS76-F，引物ZHS76-R；引物ZHS78-F，引物ZHS78-R；引物ZHS94-F，引物ZHS94-R。
[0061] 在本发明中，所述EST-SSR引物组包括七对时，48对引物中的任意七对均可，具体优选为引物ZHS52-F，引物ZHS52-R；引物ZHS56-F，引物ZHS56-R；引物ZHS57-F，引物ZHS57-R；引物ZHS59-F，引物ZHS59-R；引物ZHS60-F，引物ZHS60-R；引物ZHS61-F，引物ZHS61-R；引物ZHS64-F，引物ZHS64-R。
[0062] 在本发明中，所述EST-SSR引物组包括九对时，具体优选为引物ZHS72-F，引物ZHS72-R；引物ZHS73-F，引物ZHS73-R；引物ZHS75-F，引物ZHS75-R；引物ZHS76-F，引物ZHS76-R；引物ZHS77-F，引物ZHS77-R；引物ZHS78-F，引物ZHS78-R；引物ZHS80-F，引物ZHS80-R；引物ZHS81-F，引物ZHS81-R；引物ZHS84-F，引物ZHS84-R。
[0063] 在本发明中，所述EST-SSR引物组包括十对时，具体优选为引物ZHS89-F，引物ZHS89-R；引物ZHS92-F，引物ZHS92-R；引物ZHS93-F，引物ZHS93-R；引物ZHS94-F，引物ZHS94-R；引物ZHS95-F，引物ZHS95-R；引物ZHS96-F，引物ZHS96-R；引物ZHS97-F，引物ZHS97-R；引物ZHS100-F，引物ZHS100-R；引物ZHS103-F，引物ZHS103-R；引物ZHS104-F，引物ZHS104-R。
[0064] 在本发明中，所述EST-SSR引物组最优选为包括上述四十八对引物。
[0065] 在本发明中，所述EST-SSR引物组的设计方法，优选包括以下步骤：
[0066] 对白三叶幼叶进行转录组测序，以组装出来的Unigene作为参考序列，利用软件MicroSatellite(MISA)(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)进行EST-SSR位点扫描筛选，获得多个SSR位点；利用Primer 5.0软件对所述位点进行引物设计。
[0067] 在本发明中，所述筛选的标准为：单碱基至少重复10次，2个碱基至少重复6次，3-6个碱基至少重复5次才被识别为SSR位点。最后获得了21602个EST-SSR位点。本发明利用Primer 5.0软件对这些位点进行引物设计，参数设定为：引物长度18-25nt，最适长度为21nt；引物退火温度为55～65℃，最优退火温度为60℃；PCR产物长度范围在80bp至500bp之间；GC含量在40％至60％之间，最优GC含量为50％。
[0068] 从21602个EST-SSR位点中随机挑选109对引物对利用8个不同地区的样本研究引物的扩增效率及多态性。本发明对所述扩增效率及多态性的方法没有任何限制，采用本领域所熟知扩增效率及多态性的方案即可。所述筛选的标准为：扩增效率高于80％，且等位基因≥3个。按该标准最终从109对引物对中筛选出48对扩增效果及多态性良好的引物对。
[0069] 本发明对上述48对引物对的合成方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的合成方法即可。在本发明实施例中，所述引物对委托武汉天一辉远生物科技有限公司合成。
[0070] 本发明提供了上述技术方案所述引物组在白三叶遗传多样性分析及种质资源遗传系谱分析中的应用。
[0071] 在本发明中，所述白三叶遗传多样性分析及种质资源遗传系谱分析的方法，优选包括以下步骤：
[0072] 1)提取待测白三叶样品基因组DNA；
[0073] 2)每组引物的正向引物加上通用M13接头序列，合成的带有M13接头序列标记上荧光基团，得到荧光基团标记的M13荧光接头引物和M13接头正向引物，反向引物直接合成；
[0074] 3)以所述步骤1)中提取的待测样品DNA为模板，以反向引物、所述步骤2)获得荧光基团标记的M13接头正向引物和M13接头正向引物使用三引物法进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
[0075] 4)将所述步骤3)得到的荧光PCR扩增产物使用DNA测序仪ABI3730x1进行毛细管荧光电泳检测，读取毛细管电泳数据，统计条带检测结果；
[0076] 5)利用所述步骤4)中的统计条带检测结果进行白三叶遗传多样性分析和种质遗传系谱分析；
[0077] 所述步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序的限制。
[0078] 本发明提取待测白三叶样品基因组DNA。白三叶样品为白三叶叶片。所述白三叶叶片优选为白三叶顶端幼嫩叶片。提取待测白三叶样品基因组DNA的方法具体见文献(oyle JJ,Doyle JL(1987)A rapid DNA isolation procedure for small quantities offresh leaftissue.Phytochemical Bulletin,19,11–15.)。
[0079] 本发明对上述方案合成的每对引物的正向引物分别加上通用M13接头序列，得到的M13接头的正向引物标记上荧光基团，得到光基团标记的M13接头引物和M13接头正向引物，反向引物直接合成。
[0080] 在本发明中，所述通用M13接头序列具有如序列表中SEQ ID No.97所示的核苷酸序列。本发明对加通用M13接头序列的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的加接头的方法即可。
[0081] 在本发明中，所述荧光基团优选为HEX荧光基团。
[0082] 得到样品基因组DNA后，本发明以所述提取的待测样品DNA为模板，以反向引物、M13接头序列的正向引物和荧光标记的M13接头序列的正向引物使用三引物法进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0083] 在本发明中，所述PCR扩增体系为：1μL模板DNA，5μL的2×Taq PCR Master Mix，0.1μL浓度为10pmol/μL的M13接头正向引物，0.4μL浓度为10pmol/μL的反向引物，0.4μL浓度为10pmol/μL的荧光基团标记的M13接头正向引物，余量为ddH2O。所述PCR扩增程序为：95℃预变性5min；然后95℃变性30s，57.5～60℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；接着95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共8个循环；最后72℃末端延伸10min。
[0084] 得到荧光PCR扩增产物后，本发明将所述荧光PCR扩增产物进行毛细管荧光电泳检测，读取毛细管电泳数据，统计条带检测结果。
[0085] 在本发明中，所述毛细管荧光电泳检测的方法具体见文献(Lingli Xu,Liyan Zeng,Baowen Liao(2014),Yang Zhong.Microsatellite markers for a mangrove species,Cerbera manghas,from South China.Conservation Genet Resour 6:45–48)，所述毛细管荧光电泳检测部分结果见图5。
[0086] 在本发明中，所述读取毛细管电泳数据优选利用GeneMarker v2.2.0读取样本片段大小及等位基因数目。
[0087] 得到统计条带检测结果后，本发明利用所述统计条带检测结果进行白三叶遗传多样性分析和种质遗传系谱分析。
[0088] 在本发明中，所述白三叶遗传多样性分析和种质遗传系谱分析的方法优选包括以下步骤：
[0089] A.根据所述步骤4)中条带检测结果，根据条带的有无，赋以“1”或“0”，缺失数据记为“-9”，建立“0,1”分子数据矩阵；
[0090] B.根据所述步骤A中的分子数据矩阵，统计EST-SSR标记扩增产物的条带总数和多态性条带数；根据每对引物分子数据矩阵，利用POPGEN v1.32软件计算各引物对的Shannon信息多样性指数(I)、Nei’s遗传多样性指数(He)；
[0091] C.利用软件NTSYSpc2.0计算遗传相似系数并利用UPGMA方法构建聚类树状图；在本发明中，所述建立原始矩阵的方法优选如下：将所述条带检测结果进行人工比对、校正，按照扩增条带的分子量从大到小编号和读取，有扩增条带出现记为“1”，无条带出现记为“0”。
[0092] 在本发明中，优选用NTSYS-PC 2.10软件基于UPGMA法计算个体间的遗传距离。
[0093] 在本发明中，优选用POPGEN v1.32软件计算各引物对的Shannon信息多样性指数(I)、Nei’s遗传多样性指数(He)，利用软件NTSYSpc2.0计算遗传相似系数并利用UPGMA方法构建聚类树状图。
[0094] 下面结合实施例对本发明提供的基于白三叶转录组序列开发的EST-SSR引物组及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0095] 实施例1
[0096] 对白三叶幼叶进行转录组测序，以组装出来的Unigene作为参考序列，利用软件MicroSatellite(MISA)(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)进行EST-SSR位点扫描。筛选标准为：单碱基至少重复10次，2个碱基至少重复6次，3-6个碱基至少重复5次才被识别为SSR位点。最后获得了21602个EST-SSR位点，然后利用Primer 5.0软件对这些位点进行引物设计，参数设定为：引物长度18-25nt，最适长度为21nt；引物退火温度为55-65℃，最优退火温度为60℃；PCR产物长度范围在80bp至500bp之间；GC含量在40％至60％之间，最优GC含量为50％。最后成果设计出18549对EST-SSR引物，本发明初步使用109对EST-SSR引物，利用8个不同地区的样本研究引物的扩增效率及多态性，最终筛选出48对能在8个实验样本中稳定扩增出清晰并有明显多态性条带的引物，其引物序列如表1所示。
[0097] 表1基于白三叶转录组序列开发的48对EST-SSR引物信息
[0098]
[0099]
[0100]
[0101]
[0102] 实施例2
[0103] 基于实施例1合成的白三叶转录组序列开发的EST-SSR引物组可应用于白三叶遗传多样性分析及白三叶种质遗传系谱分析，其分析方法包括如下步骤：
[0104] A、提取待测白三叶样品基因组DNA：
[0105] 以49份白三叶材料验证开发的SSR标记有效性，其中供试白三叶材料信息见表2。样品为白三叶幼叶，每份材料只选取1个单株采集样品。
[0106] 表2白三叶材料信息
[0107]
[0108]
[0109]
[0110] 选取上述49份材料的健康嫩叶，采用改良的CTAB法提取基因组DNA，并用分光光度计及1％的琼脂糖凝胶电泳检测供试材料DNA浓度与纯度，将合格DNA样品置于-20℃条件下保存备用。
[0111] B、将序列表1所示每个引物的正向引物(F引物)加上通用M13接头序列“TGTAAAACGACGGCCAGT(SEQ ID No.97)”，得到M13接头引物，另外再合成加HEX荧光基团的M13荧光接头引物；
[0112] C、以步骤A提取的待测样品DNA为模板，以反向引物、步骤B获得的M13接头引物和荧光基团的M13荧光接头引物使用三引物PCR法进行扩增，得到PCR扩增产物；所述PCR反应优化体系总体积为10μL，其中包括1μL模板DNA，5μL的2×Taq PCR Master Mix，0.1μL浓度为10pmol/μL的正向引物，0.4μL浓度为10pmol/μL的反向引物，0.4μL浓度为10pmol/μL的带荧光M13引物，余量为ddH2O。所述PCR扩增程序为：95℃预变性5min；然后95℃变性30s，57.5～60℃退火30s(没对引物的退火温度见表3)，72℃延伸30s，共30个循环；接着95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共8个循环；最后72℃末端延伸10min，于4℃保存。
[0113] D、将步骤C得到的荧光PCR扩增产物使用DNA测序仪ABI3730x1进行毛细管荧光电泳检测，利用GeneMarker V2.2.0读取毛细管电泳数据，统计检测结果；
[0114] E、将步骤D得到的条带检测结果进行人工比对、校正，根据条带的有无，赋以“1”或“0”，缺失数据记为“-9”，建立“0,1”分子数据矩阵；根据分子数据矩阵，统计EST-SSR标记扩增产物的条带总数和多态性条带数；利用POPGEN v1.32软件计算各引物对的Shannon信息多样性指数(I)、Nei’s遗传多样性指数(He)；利用NTSYS-PC 2.10软件计算遗传相似系数并基于UPGMA方法对白三叶样品个体进行聚类分析，构建得到UPGMA聚类树。
[0115] 利用49份白三叶材料对48对EST-SSR引物进行扩增，其引物扩增结果见表3。
[0116] 表3 48对EST-SSR多态性引物对白三叶材料扩增统计
[0117]
[0118]
[0119]
[0120]
[0121] 48对多态性EST-SSR引物，共扩增出442条谱带，其中多态性谱带440条，多态性条带比例为99.55％，平均每个引物扩增出9.16条多态性谱带，平均Nei’s基因多样性指数和平均Shannon信息指数分别为0.2348和0.3742，表明供试白三叶材料遗传多样性十分丰富，以及基于白三叶转录组序列开发的EST-SSR引物组能应用于白三叶遗传多样性分析及种质系谱分析。
[0122] 以49份白三叶材料和442个位点的谱带数据为数据矩阵，据，利用NTSYS-PC 2.10软件基于UPGMA法对白三叶样本进行聚类分析，得到49份白三叶材料的UPGMA聚类图，结果见附图1。材料间的遗传相似系数最大的为0.842(D24和D60)，最小的为0.693(D03和D59)。基于遗传相似系数的聚类分析表明，在遗传相似系数为0.748处可将所有白三叶材料分为4大类。第I大类包括45份材料，涵盖了所有来源国的材料；第II大类包括2份，来自新西兰(D24)和中国(D60)；第III大类包括1份材料，来自丹麦(D03)；第IV大也包括1份材料，来自中国(D59)。在遗传相似系数为0.76处，第I大类可分为6个小组，第1小组包括3份材料，来自中国、美国和新西兰；第2小组包括28份材料，来自美国、新西兰、澳大利亚、丹麦等国；第3小组包括3份材料，来自美国、英国和荷兰；第4小组包括3份材料，来自新西兰、德国和荷兰；第
5小组也包括3份材料，来自中国、美国和新西兰；第6小组包括1份材料，来自新西兰。
[0123] 从图1的聚类分析的结果来看，来自同一国家的材料并没有聚类在一类，这是由于供试白三叶材料多为育成品种，其育种材料的原始采集地所属国不一定是培育国，不同国家育成的不同品种可能其原始植株采集地相近。比如D50材料Siral，其培育国是澳大利亚，但其原始植株采集地来自非洲的阿尔及利亚(王跃东，主编，三叶草[M]，p50，云南科技出版社，2000.6)。实际上，中国大部分白三叶品种都是由国外引进，比如云南地区仅在20世纪80年代就引进三叶草品种近200个，在长期驯化过程中出现了丰富的性状变异。但是，对于一些野生材料，基本来源地相同的材料能够聚为同一类，比如来自中国云南的野生材料D37和D38被聚为一类，其遗传相似系数为0.794。可见，49份白三叶材料间遗传变异丰富，48对引物组能够对这些材料进行有效区分和聚类，本引物组可以用于白三叶种质资源间的遗传多样性分析。
[0124] 实施例3
[0125] 从48对引物中取2对(引物ZHS72-F和引物ZHS72-R；引物ZHS78-F和引物ZHS78-R)对49份白三叶材料进行遗传多样性聚类分析，具体方法参见实施例2，结果见附图2。
[0126] 利用2对引物分析的UPGMA聚类结果见图2。白三叶材料间遗传相似系数最大为0.973，包括两组材料，一组为D01和D42，均来自中国，一组为D16和D51，均来自新西兰。遗传相似系数最小为0.588，包括6组材料，分别为D03和D09、D03和D11、D03和D22、D03和D33、D03和D44、D03和D51。基于遗传相似系数的聚类分析表明，在遗传相似系数0.800处可将所有材料分为3大类，第I大类包括44份材料，包含了所有国家的栽培材料和野生材料；第II类包括
1份材料(D47)，来自美国；第III类包括4份材料，来自美国、新西兰、丹麦和中国四个国家。
[0127] 实施例4
[0128] 从48对引物中取3对(引物ZHS19-F和引物ZHS19-R；引物ZHS72-F和引物ZHS72-R；引物ZHS78-F和引物ZHS78-R)对49份白三叶材料进行遗传多样性聚类分析，具体方法参见实施例2，结果见附图3。
[0129] 利用3对引物的UPGMA聚类分析结果见图3。结果表明材料间遗传相似系数最大为0.970(D20和D44)，分别来自新西兰和荷兰；遗传相似系数最小为0.717，包括两组材料，一组为D26和D30，分别来自新西兰和美国，一组为D26和D37，分别来自新西兰和中国。在遗传相似系数0.818处可将49份白三叶材料分为四大类，第I类包括42份材料；第II类包括5份材料；第III类包括1份材料(D02)，来自美国；第IV类也包括1份材料(D37)，来自新西兰。
[0130] 实施例5
[0131] 从48对引物中取6对(引物ZHS19-F和引物ZHS19-R；引物ZHS40-F和引物ZHS40-R；引物ZHS72-F和引物ZHS72-R；引物ZHS76-F和引物ZHS76-R；引物ZHS78-F和引物ZHS78-R；引物ZHS94-F和引物ZHS94-R)引物对49份白三叶材料进行遗传多样性聚类分析，结果见附图
4。
[0132] 利用6对引物的UPGMA聚类分析结果见图4。材料间遗传相似系数最大为0.940(D44和D49)，分别来自荷兰和英国，说明这两个材料遗传关系较近；材料间遗传系数最小的为0.687(D26和D37)，分别来自新西兰和中国。聚类图结果表明，在遗传相似系数为0.812附近，可将白三叶材料分为四大类，第I类包括46份材料，囊括了所有来源地的材料；第II类包括1份材料(D08)，来自丹麦；第III类包括1份材料(D37)，来自中国云南；第IV类也包仅包括
1份材料(D59)，来自中国。进一步的分析发现，在遗传相似系数0.828处，可将第I类细分为5个小组，第1小组包括3份材料，其中2份来自中国，1份来自美国；第2小组包括36份材料；第3小组包括3份材料，其中2份来自美国，1份来自中国；第4小组也包括3份材料，其中2份来自英国，1份来自新西兰。
[0133] 由上述实施例可知，尽管UPGMA聚类分析时所用引物的位点是叠加的，也就是引物数量越多其聚类划分越细，参数标准越详细，因此其最大遗传相似系数越小；反映到聚类结果上可以有所差异，但利用不同的引物组合也可对白三叶材料进行遗传多样性分析。比如利用3对引物和6对引物所形成的UPGMA聚类结果均得到材料D26和D37遗传相似系数最小的结论；利用6对引物和48对引物分析时材料D59均单独聚类，这些材料结果的一致性说明本引物组中任意几个引物对的组合也可对白三叶种质资源的遗传多样性进行分析。
[0134] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
