4-甲氧基苯基取代四氢-β-咔啉哌嗪二酮类衍生物及其应用转让专利
申请号 : CN201710073950.0
文献号 : CN108409737B
文献日 : 2020-07-03
发明人 : 李剑 , 章海燕 , 倪炜 , 王欢 , 毛斐 , 王曼炯 , 郑新羽 , 龚琦
申请人 : 华东理工大学 , 中国科学院上海药物研究所
摘要 :
本发明涉及一种4‑甲氧基苯基取代四氢‑β‑咔啉哌嗪二酮类衍生物及其应用。具体地，本发明公开了式I所示的化合物或其立体异构体，或其药学上可接受的盐，各基团的定义详见说明书。本发明的化合物具有乙酰胆碱酯酶和磷酸二酯酶5的双重抑制活性，具有良好的血脑屏障透过率。因此，本发明化合物可用于制备治疗和/或预防阿尔茨海默病药物。
权利要求 :
1.一种式I所示化合物或其立体异构体或其药学上可接受的盐：式中，
n为2、3或4；
R为取代或未取代的C3-C10环烷基、取代或未取代的C6-C10芳环基、或取代或未取代的C3-C8杂芳环基；其中，所述取代是指各个基团中一个或多个氢原子被选自下组的基团所取代：卤素、氰基、硝基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基。
2.如权利要求1所述的化合物或其立体异构体或其药学上可接受的盐，其特征在于，R为取代或未取代的环己基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的吡啶基、或取代或未取代的噻吩基；其中，所述取代是指各个基团中一个或多个氢原子被选自下组的基团所取代：卤素、氰基、硝基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基。
3.如权利要求1所述的化合物或其立体异构体或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述化合物选自下组：
4.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括：(1)如权利要求1所述的化合物或其立体异构体或其药学上可接受的盐；和(2)药学上可接受的载体。
5.如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括选自下组的药物：乙酰胆碱酯酶抑制剂、抗氧化剂、抗炎剂或神经保护剂。
6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述乙酰胆碱酯酶抑制剂选自下组：多奈哌齐、他克林、石杉碱甲、利斯的明、加兰他敏，或其组合。
7.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述抗氧化剂选自下组：褪黑素、维生素E、维生素C、艾地苯醌、丹参酚酸，或其组合。
8.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述抗炎剂选自下组：阿司匹林、吲哚美辛、布洛芬、罗格列酮，或其组合。
9.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述神经保护剂选自下组：尼莫地平、姜黄素、美金刚、胞磷胆碱，或其组合。
10.如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为注射剂、片剂、胶囊剂、丸剂、悬浮剂或乳剂。
11.如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为口服剂型、经皮剂型、静脉或肌肉注射剂型。
12.如权利要求1所述的化合物或其立体异构体或其药学上可接受的盐、或如权利要求
4所述的药物组合物的用途，其特征在于，用于制备乙酰胆碱酯酶和磷酸二酯酶5双重抑制剂，或用于制备治疗、改善和/或预防阿尔茨海默症的药物。
13.如权利要求1所述的化合物或其立体异构体或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，包括步骤：(i)在惰性溶剂中，将4-甲氧基苯甲醛与D-色氨酸甲酯盐酸盐或L-色氨酸甲酯盐酸盐进行Pictet-Spengler反应，从而形成式II化合物；
(ii)在惰性溶剂中，将式II化合物与氯乙酰氯进行反应，从而形成式III化合物；
(iii)在惰性溶剂中，将式III化合物与 进行反应，从而形成式IA/IB化合物；
(iv)在惰性溶剂中，将式IA/IB化合物进行脱苄反应，从而形成式IV化合物；和(v)在惰性溶剂中，将式IV化合物和RCH2X进行反应，从而形成式Ic化合物；
上述各式中，n、R的定义同权利要求1，但是R不为苯基，X表示离去基团。
14.如权利要求13所述的制备方法，其特征在于，X为卤素。
15.如权利要求13所述的制备方法，其特征在于，式II化合物有4种光学异构体，分别为式II-1化合物、式II-2化合物、式II-3化合物或式II-4化合物，相对构型分别为1R、3R，1S、
3R，1R、3S和1S、3S；
16.如权利要求13所述的制备方法，其特征在于，式III化合物有4种光学异构体，相对构型分别为1R、3R，1S、3R，1R、3S和1S、3S。
17.一种结构如式IV所示的中间体化合物，或其立体异构体：其中，n为2、3或4。
18.如权利要求17所述的中间体化合物，其特征在于，式IV所示的中间体化合物有4种光学异构体，相对构型分别为1R、3R，1S、3R，1R、3S和1S、3S。
说明书 :
4-甲氧基苯基取代四氢-β-咔啉哌嗪二酮类衍生物及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于药物化学和药物治疗学领域，具体地，涉及一种4-甲氧基苯基取代四氢-β-咔啉哌嗪二酮类衍生物及其应用。
背景技术
[0002] 阿尔茨海默病(AD)是一种以老年斑、神经纤维缠结形成、海马神经元丢失为主要病理特征的神经退行性疾病。其临床主要表现为患者逐渐出现记忆力减退、认知功能障碍、失语、行为异常和社交障碍等，通常病情呈进行性加重，直到完全丧失独立生活能力，并伴随有一系列精神病症状(Goedert,M.Science,2006,314,777-781)。由于其发病机制复杂，到目前为止，医药界尚未找出行之有效的预防及治疗方法。
[0003] 据阿尔茨海默病协会最新报道，在美国及其他国家的老龄人群中，AD正成为死亡的一个更常见原因，2000年至2013年期间，由乳腺癌、前列腺癌、心脏病、中风以及艾滋病等引起的死亡率在下降，而由AD引起的死亡率却增加了71％(Alzheimer’s Association.Alzheimer’s Association Report.,2016,11,459-509)。而且该疾病发病周期长，难以治愈，治疗费用昂贵，不仅将给患者自身带来极大的痛苦，也给社会和家庭带来沉重的经济负担。近年来，抗AD新药的研究有了一定的进展，但是总体发展速度与市场需求仍有较大的差距。因此，寻找治疗AD的良药已刻不容缓。
[0004] AD病因复杂，这是其难以治愈的主要原因，单一靶点的药物很难从根本上解决问题。双/多靶点疗法针对疾病发病机制中涉及的双/多个靶点来设计小分子化合物，对于AD这种多病因疾病，通过双/多个靶点的同时作用对该疾病治疗可能会达到更为理想的效果。
[0005] 在AD众多发病机制中，胆碱能损伤假说得到大多数学者普遍认同，目前临床上用于治疗AD的药物也多为胆碱酯酶抑制剂。目前，FDA批准的抗AD药物有五个，其中，四个都是乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)抑制剂，分别是多奈哌齐(Donepezil)、利斯的明(Rivastigmine)、加兰他敏(Galantamine)、他克林(Tacrine)，他克林上市不久后由于肝毒性等副作用而被撤回。此外，石杉碱甲(Huperzine A)也是一种高效可逆的竞争性AChE抑制剂，是国内较为成功的治疗AD的药物。但这些药物作用靶点单一，只能改善患者认知功能症状，并不能从根本上终止疾病进程。因此，研究开发有效的多靶点AD治疗药物是非常迫切的，有着重要的医学和社会学意义。
[0006] 研究表明加强中枢胆碱能活动，提高脑内ACh水平，可以改善患者的学习记忆和认知能力(Baskin,D.S.Arch Neurol.,1999,56,1121-1123)，因此AChE成为治疗AD的重要靶点，设计合成以AChE抑制活性为主的多功能抗AD活性化合物成为近年来国内外研究AD治疗药物的热点(Nepovimova,E.J.Med.Chem.,2014,57,8576-8589)。
[0007] AD临床主要表现为患者记忆力减退、认知功能障碍等，cGMP是大脑中重要的第二信使，直接参与时间依赖性事件的记忆巩固，与学习记忆密切相关(De Vente,J.Neurochem.Int.,2004,45,799-812)，新生儿脑内的cGMP水平高于成年人，随后随着年龄增长而下降；当磷酸二酯酶5(PDE5)被抑制时，可使脑内cGMP增加，从而提高学习记忆认知能力，因此，PDE5抑制剂能够通过提高脑内cGMP水平而起到抗AD作用。此外，PDE5抑制剂能够使糖原合成酶激酶3β(GSK 3β)失活，减少脑内tau蛋白过度磷酸化，兼具有抗炎、抗凋亡、抗氧化等作用(Nunes,A.K.Cytokine,2012,60,540-551.Guazzi,M.Curr.Med.Chem.,2007,14,2181-2191)；动物实验表明，给予AD模型小鼠PDE5抑制剂后均产生很强的抗AD作用，小鼠的记忆认知能力均得到恢复(Sabayan,B.Int.J.Neurosci.,2010,120,746-751)，这些均表明PDE5抑制剂能改善动物的记忆认知功能是重要的AD治疗药物靶点。因此，开发AChE/PDE5双重抑制剂对AD的治疗具有重要意义。
发明内容
[0008] 本发明的目的在于，提供一种具有乙酰胆碱酯酶/磷酸二酯酶5双重抑制活性并能够透过血脑屏障的4-甲氧基苯基取代四氢-β-咔啉哌嗪二酮类衍生物。
[0009] 本发明另一个目的在于，提供了上述化合物在制备治疗、改善和/或预防阿尔茨海默病药物中的应用。
[0010] 本发明第一方面提供了一种式I所示化合物或其立体异构体，或其药学上可接受的盐：
[0011]
[0012] 式中，n为2、3或4；
[0013] R为取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C3-C10环烷基、取代或未取代的C2-C8杂环烷基、取代或未取代的C6-C10芳环基、或取代或未取代的C3-C8杂芳环基；其中，所述取代是指各个基团中一个或多个氢原子被选自下组的基团所取代：卤素、氰基、硝基、羟基、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤代C1-C6烷氧基、COOH(羧基)、COOC1-C6烷基、OCOC1-C6烷基。
[0014] 在另一优选例中，R为取代或未取代的环己基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的吡啶基、或取代或未取代的噻吩基；其中，所述取代是指各个基团中一个或多个氢原子被选自下组的基团所取代：卤素、氰基、硝基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基。
[0015] 在另一优选例中，所述化合物选自下组：
[0016]
[0017]
[0018] 本发明第二方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括：(1)如本发明第一方面所述的化合物或其立体异构体，或其药学上可接受的盐；和(2)药学上可接受的载体。
[0019] 在另一优选例中，所述药物组合物还包括选自下组的药物：乙酰胆碱酯酶抑制剂、抗氧化剂、抗炎剂或神经保护剂。
[0020] 在另一优选例中，所述乙酰胆碱酯酶抑制剂选自下组：多奈哌齐、他克林、石杉碱甲、利斯的明、加兰他敏，或其组合。
[0021] 在另一优选例中，所述抗氧化剂选自下组：褪黑素、维生素E、维生素C、艾地苯醌、丹参酚酸，或其组合。
[0022] 在另一优选例中，所述抗炎剂选自下组：阿司匹林、吲哚美辛、布洛芬、罗格列酮，或其组合。
[0023] 在另一优选例中，所述神经保护剂选自下组：尼莫地平、姜黄素、美金刚、胞磷胆碱，或其组合。
[0024] 在另一优选例中，所述药物组合物为注射剂、片剂、胶囊剂、丸剂、悬浮剂或乳剂。
[0025] 在另一优选例中，所述药物组合物为口服剂型、经皮剂型、静脉或肌肉注射剂型。
[0026] 本发明第三方面提供了第一方面所述的化合物或其立体异构体，或其药学上可接受的盐，或第二方面所述的药物组合物的用途，用作乙酰胆碱酯酶和磷酸二酯酶5双重抑制剂，或用于制备治疗、改善和/或预防阿尔茨海默症的药物。
[0027] 本发明第四方面提供了如第一方面所述的化合物或其立体异构体，或其药学上可接受的盐的制备方法，包括步骤：
[0028]
[0029] (a)在惰性溶剂中，将式III化合物与 进行反应，从而形成式IA/IB化合物；
[0030] (b)在惰性溶剂中，将式IA/IB化合物进行脱苄反应，从而形成式IV化合物；和[0031] (c)在惰性溶剂中，将式IV化合物和RCH2X进行反应，从而形成式Ic化合物；
[0032] 上述各式中，n、R的定义同前，但是R不为苯基，X表示离去基团。
[0033] 在另一优选例中，X为卤素；优选为溴或氯。
[0034] 在另一优选例中，式II化合物有4种光学异构体，分别为式II-1化合物、式II-2化合物、式II-3化合物或式II-4化合物，相对构型分别为1R、3R，1S、3R，1R、3S和1S、3S；
[0035]
[0036] 在另一优选例中，式III化合物有4种光学异构体，相对构型分别为1R、3R，1S、3R，1R、3S和1S、3S。
[0037] 本发明第五方面提供了一种结构如式IV所示的中间体化合物，或其立体异构体：
[0038] 其中，n为2、3或4。
[0039] 在另一优选例中，式IV化合物有4种光学异构体，相对构型分别为1R、3R，1S、3R，1R、3S和1S、3S。
[0040] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
[0041] 本发明人经过广泛而深入的研究，意外发现了一类具有乙酰胆碱酯酶/磷酸二酯酶5双重抑制活性并能够透过血脑屏障的4-甲氧基苯基取代四氢-β-咔啉哌嗪二酮类衍生物。在此基础上，发明人完成了本发明。
[0042] 术语
[0043] 如本文所用，术语“烷基”包括直链或支链烷基。“C1-C6烷基”是指具有1-6个碳原子的烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基等。
[0044] 如本文所用，术语“C3-C10环烷基”是指具有3-10个碳原子的环状烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基等。
[0045] 如本文所用，术语“C2-C8杂环烷基”是指具有2-8个碳原子和1-3个选自氮、氧和硫的杂原子的杂环烷基，例如氮杂环丙基、氮杂环丁基、四氢吡咯基、四噻吩基、吗啉基、哌嗪基、哌啶基、四氢呋喃基等。
[0046] 如本文所用，术语“C6-C10芳环基”是指具有6-10个碳原子的芳基，例如，苯基或萘基等。
[0047] 如本文所用，术语“C3-C8杂芳环基”是指具有3-8个碳原子的且具有1-3个选自氮、氧和硫的杂原子的杂芳基，例如吡啶基、噻吩基、呋喃基、吡嗪基、吡咯基、吲哚基、苯并噻吩基等。
[0048] 本文所述的各个基团可以是取代的或未取代的。所述“取代的”可指各个基团上的一个或多个(如1-5个)氢原子被选自下组的基团所取代：卤素(F、Cl、Br或I)、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、硝基(NO2)、氰基(CN)、羟基(OH)、羧基(COOH)、酯基(COOC1-C6烷基)、氨基、取代的胺基(例如，被C1-C6烷基取代的胺基)。
[0049] 如本文所用，术语“烷氧基”是指直链或支链的烷氧基。“C1-C6烷氧基”是指具有1-6个碳原子的烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异氧丙基、正丁氧基、仲丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基等。
[0050] 活性成分
[0051] 如本文所用，术语“本发明化合物”指式(I)所示的化合物。该术语还包括及式(I)化合物的各种立体异构体，及其各种药学上可接受的盐。
[0052] 如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指能够保留游离碱的生物有效性而无其它副作用的，与无机酸或有机酸所形成的盐。无机酸盐包括但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐等；有机酸盐包括但不限于甲酸盐、乙酸盐、2,2-二氯乙酸盐、三氟乙酸盐、丙酸盐、己酸盐、辛酸盐、癸酸盐、十一碳烯酸盐、乙醇酸盐、葡糖酸盐、乳酸盐、癸二酸盐、己二酸盐、戊二酸盐、丙二酸盐、草酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、油酸盐、肉桂酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、谷氨酸盐、焦谷氨酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、水杨酸盐、4-氨基水杨酸盐、萘二磺酸盐等。这些盐可通过已知的成盐方法由式I的化合物制备。
[0053] 如本文所用，术语“立体异构体”包括顺反异构体、对映异构体(又称旋光异构体)和构象异构体等。
[0054] 制备方法
[0055] 本发明化合物的制备方法不局限于本发明所描述的具体制备方法，可以任选将在本说明书中描述的或本领域已知的各种合成方法组合起来而方便的制得，这样的组合可由本发明所属领域的技术人员容易的进行。
[0056] 通常，在制备流程中，各反应通常在惰性溶剂中，在室温至回流温度(如0℃～80℃，优选0℃～50℃)下进行。反应时间通常为0.1小时-60小时，较佳地为0.5-48小时。
[0057] 本发明化合物的制备方法可包括以下步骤：
[0058]
[0059] (1)在惰性溶剂中，将4-甲氧基苯甲醛与D-色氨酸甲酯盐酸盐或L-色氨酸甲酯盐酸盐进行Pictet-Spengler反应，从而形成式II化合物；
[0060] (2)在惰性溶剂中，将式II化合物与氯乙酰氯进行反应，从而形成式III化合物；
[0061] (3)在惰性溶剂中，将式III化合物与 进行反应，从而形成式IA/IB化合物；
[0062] (4)在惰性溶剂中，将式IA/IB化合物进行脱苄反应，从而形成式IV化合物；和[0063] (5)在惰性溶剂中，将式IV化合物和RCH2X进行反应，从而形成式Ic化合物；
[0064] 上述各式中，n、R的定义同前，但是R不为苯基，X表示离去基团(优选为卤素，或溴或氯)。
[0065] 本发明化合物的制备方法可包括以下步骤：
[0066] 1)将4-甲氧基苯甲醛分别与D-色氨酸甲酯或L-色氨酸甲酯盐酸盐经Pictet-Spengler反应，然后经柱层析分离纯化得中间体II，中间体II具有4种光学异构体，分别为II-1、II-2、II-3和II-4，相对构型分别为1R、3R，1S、3R，1R、3S和1S、3S；
[0067]
[0068] 2)将中间体II与氯乙酰氯反应得中间体III；
[0069]
[0070] 3)将中间体III与4-(2-氨基乙基)-1-苄基哌啶反应得衍生物IA；
[0071]
[0072] 4)将中间体III分别与不同链长的苄基哌啶胺反应得到衍生物IB；
[0073]
[0074] 5)衍生物IC则由衍生物IA经Pd/C脱苄得中间体IV-1，中间体IV-1再与不同的卤代烃反应得到；
[0075]
[0076] 上述各式中，各个基团或符号的定义同前。
[0077] 药物组合物和施用方法
[0078] 由于本发明化合物具有优异的对乙酰胆碱酯酶/磷酸二酯酶5双重抑制活性的抑制活性，因此，本发明化合物及其药学上可接受的无机或有机盐，以及含有本发明化合物为主要活性成分的药物组合物可用于治疗、预防以及缓解由胆碱酯酶/磷酸二酯酶5介导的疾病。根据现有技术，本发明化合物可用于治疗以下疾病：阿尔兹海默病等等。
[0079] 本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明化合物或其药学上可接受的盐及药学上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg本发明化合物/剂，更佳地，含有10-200mg本发明化合物/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。
[0080] “药学上可以接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如 )、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
[0081] 本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)。
[0082] 用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
[0083] 固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
[0084] 用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
[0085] 除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
[0086] 除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
[0087] 用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
[0088] 本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。
[0089] 使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选20～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0090] 本发明的优点主要包括：
[0091] 1.本发明提供的化合物可用作乙酰胆碱酯酶/磷酸二酯酶5的双重抑制剂。
[0092] 2.本发明提供的化合物可用于制备用于治疗、预防阿尔茨海默病的药物。
[0093] 3.本发明提供的化合物对乙酰胆碱酯酶具有高选择性。
[0094] 4.本发明提供的化合物具有良好的血脑屏障透过效果。
[0095] 下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明实施例中所用原料或仪器，若非特别说明，均市售可得。
[0096] 实施例1(1R,3R)-1-(4-甲氧基苯基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯(中间体II-1)的制备
[0097]
[0098] 将817mg(6mmol)4-甲氧基苯甲醛、1.528g(6mmol)D-色氨酸甲酯盐酸盐、20mL异丙醇加入圆底烧瓶中，加热回流反应24h，反应结束后，旋去溶剂，加如适量饱和碳酸氢钠溶液调pH至7-8，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除溶剂，残留物用硅胶柱层析分离纯化，乙酸乙酯/石油醚＝1/3洗脱，得黄色固体876mg，产率43％。
[0099] 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.53(d,J＝7.6Hz,1H),7.47(s,1H),7.29(d,J＝8.5Hz,2H),7.21(d,J＝6.9Hz,1H),7.18–7.08(m,2H),6.89(d,J＝8.6Hz,2H),5.20(s,1H),3.97(dd,J＝11.1,4.1Hz,1H),3.81(d,J＝1.5Hz,6H),3.22(dd,J＝15.1,2.4Hz,1H),3.07–2.92(m,1H).
[0100] 实施例2(1S,3R)-1-(4-甲氧基苯基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯(中间体II-2)的制备
[0101]
[0102] 具体实施步骤同实施例1，溶剂异丙醇换为乙醇，硅胶柱层析分离纯化，洗脱液为乙酸乙酯/石油醚＝1/3-1/1，得白色固体667mg，产率33％。
[0103] 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.55(d,J＝6.6Hz,2H),7.17(ddd,J＝22.0,13.9,6.0Hz,5H),6.86(d,J＝8.5Hz,2H),5.41(s,1H),3.99(t,J＝6.0Hz,1H),3.79(s,3H),3.72(s,3H),
3.28(dd,J＝15.3,5.3Hz,1H),3.15(dd,J＝15.5,6.5Hz,1H).
3.28(dd,J＝15.3,5.3Hz,1H),3.15(dd,J＝15.5,6.5Hz,1H).
[0104] 实施例3(1R,3S)-1-(4-甲氧基苯基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯(中间体II-3)的制备
[0105]
[0106] 将817mg(6mmol)4-甲氧基苯甲醛、1.528g(6mmol)L-色氨酸甲酯盐酸盐、20mL乙醇加入圆底烧瓶中，加热回流反应24h，反应结束后，旋去溶剂，加入适量饱和碳酸氢钠溶液调pH至7-8，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除溶剂，残留物用硅胶柱层析分离纯化，乙酸乙酯/石油醚＝1/3-1/1洗脱，得白色固体611mg，产率30％。
[0107] 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.64(s,1H),7.54(d,J＝7.3Hz,1H),7.32–7.23(m,3H),7.16(ddd,J＝14.8,10.2,5.9Hz,2H),6.87(d,J＝8.3Hz,2H),5.56(s,1H),4.05(t,J＝
5.7Hz,1H),3.79(s,3H),3.74(s,3H),3.40(d,J＝11.6Hz,1H),3.23(dd,J＝15.6,5.5Hz,
1H).
5.7Hz,1H),3.79(s,3H),3.74(s,3H),3.40(d,J＝11.6Hz,1H),3.23(dd,J＝15.6,5.5Hz,
1H).
[0108] 实施例4(1S,3S)-1-(4-甲氧基苯基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯(中间体II-4)的制备
[0109]
[0110] 具体实施步骤同实施例3，硅胶柱层析分离纯化，洗脱液为乙酸乙酯/石油醚＝1/3，得黄色固体675mg，产率33％。
[0111] 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.57–7.51(m,1H),7.47(s,1H),7.33–7.26(m,2H),7.24–7.18(m,1H),7.17–7.07(m,2H),6.92–6.85(m,2H),5.19(s,1H),3.97(dd,J＝11.2,4.3Hz,
1H),3.81(d,J＝1.7Hz,6H),3.22(ddd,J＝15.1,4.2,1.9Hz,1H),3.00(ddd,J＝15.1,11.2,
2.6Hz,1H).
1H),3.81(d,J＝1.7Hz,6H),3.22(ddd,J＝15.1,4.2,1.9Hz,1H),3.00(ddd,J＝15.1,11.2,
2.6Hz,1H).
[0112] 实施例5(1R,3R)-1-(4-甲氧基苯基)-N-(2-氯乙酰基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯(中间体III-1)的制备
[0113]
[0114] 向圆底烧瓶中依次加入将336mg(1mmol)II-1、0.42mL(3mmol)三乙胺、5mL二氯甲烷，-10℃下滴加3mL氯乙酰氯的二氯甲烷溶液(0.5mmol/mL)，滴加完毕后，室温下反应过夜，反应结束后，旋去溶剂，加水淬灭反应，加入30mL二氯甲烷稀释，有机层依次用饱和碳酸氢钠溶液、稀盐酸溶液洗、水、饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除溶剂，得黄色固体367mg，产率89％。
[0115] 实施例6(1S,3R)-1-(4-甲氧基苯基)-N-(2-氯乙酰基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯(中间体III-2)的制备
[0116]
[0117] 具体实施步骤同实施例5，不同之处在于用II-2代替II-1，得黄色固体339mg，产率82％。
[0118] 实施例7(1R,3S)-1-(4-甲氧基苯基)-N-(2-氯乙酰基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯(中间体III-3)的制备
[0119]
[0120] 具体实施步骤同实施例5，不同之处在于用II-3代替II-1，得黄色固体342mg，产率83％。
[0121] 实施例8(1S,3S)-1-(4-甲氧基苯基)-N-(2-氯乙酰基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯(中间体III-4)的制备
[0122]
[0123] 具体实施步骤同实施例5，不同之处在于用II-4代替II-1，得黄色固体372mg，产率90％。
[0124] 实施例9(6R,12aR)-6-(4-甲氧基苯基)-2-(2-(1-苄基哌啶-4-基)乙基)-2,3,6,7,12,12a-六氢吡嗪并[1',2':1,6]吡啶并[3,4-b]吲哚-1,4-二酮(化合物IA-1)的制备[0125]
[0126] 将206mg(0.5mmol)中间体III-1、131mg(0.6mmol)4-(2-氨基乙基)-1-苄基哌啶、0.10mL(0.75mmol)三乙胺、10mL甲醇加入到圆底烧瓶中，回流反应18h，反应完毕后，减压蒸除溶剂，乙酸乙酯萃取，饱和碳酸氢钠溶液洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除溶剂，残留物用硅胶柱层析分离纯化，二氯甲烷/甲醇＝20/1洗脱，得白色固体179mg，产率64％。
[0127] mp 112-115℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.86(s,1H),7.61(s,1H),7.32(s,4H),7.19(d,J＝18.5Hz,6H),6.76(d,J＝7.7Hz,2H),6.22(s,1H),4.29(d,J＝10.7Hz,1H),4.06(d,J＝16.7Hz,1H),3.88(d,J＝17.3Hz,1H),3.77(s,1H),3.72(s,3H),3.55(d,J＝20.6Hz,
3H),3.37(s,1H),3.27–3.18(m,1H),2.89(s,2H),1.95(s,2H),1.68(s,2H),1.50(s,2H),
1.29(d,J＝29.9Hz,3H).HRMS(EI)m/z calcd for C35H38N4O3(M+)562.2944,found
562.2947.
3H),3.37(s,1H),3.27–3.18(m,1H),2.89(s,2H),1.95(s,2H),1.68(s,2H),1.50(s,2H),
1.29(d,J＝29.9Hz,3H).HRMS(EI)m/z calcd for C35H38N4O3(M+)562.2944,found
562.2947.
[0128] 实施例10(6S,12aR)-6-(4-甲氧基苯基)-2-(2-(1-苄基哌啶-4-基)乙基)-2,3,6,7,12,12a-六氢吡嗪并[1',2':1,6]吡啶并[3,4-b]吲哚-1,4-二酮(化合物IA-2)的制备[0129]
[0130] 具体实施步骤同实施例6，不同之处在于将原料中间体III-1替换为中间体III-2，得白色固体153mg，产率54％。
[0131] mp 124-127℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.99(s,1H),7.53(s,1H),7.31(s,5H),7.20(d,J＝5.4Hz,5H),6.99(s,1H),6.82(s,2H),4.32(d,J＝11.0Hz,1H),4.09(d,J＝
17.8Hz,1H),3.94(d,J＝17.4Hz,1H),3.77(s,3H),3.54(d,J＝15.6Hz,4H),3.29(s,1H),
2.92(t,J＝13.6Hz,3H),1.97(s,2H),1.69(s,2H),1.50(s,2H),1.29(s,3H).HRMS(EI)m/z calcd for C35H38N4O3(M+)562.2944,found 562.2943.
17.8Hz,1H),3.94(d,J＝17.4Hz,1H),3.77(s,3H),3.54(d,J＝15.6Hz,4H),3.29(s,1H),
2.92(t,J＝13.6Hz,3H),1.97(s,2H),1.69(s,2H),1.50(s,2H),1.29(s,3H).HRMS(EI)m/z calcd for C35H38N4O3(M+)562.2944,found 562.2943.
[0132] 实施例11(6R,12aS)-6-(4-甲氧基苯基)-2-(2-(1-苄基哌啶-4-基)乙基)-2,3,6,7,12,12a-六氢吡嗪并[1',2':1,6]吡啶并[3,4-b]吲哚-1,4-二酮(化合物IA-3)的制备[0133]
[0134] 具体实施步骤同实施例6，不同之处在于将原料中间体III-1替换为中间体III-3，得白色固体149mg，产率53％。
[0135] mp 116-119℃；1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.09(s,1H),7.52(d,J＝7.8Hz,1H),7.27(ddd,J＝21.0,13.2,6.9Hz,6H),7.11(dd,J＝7.7,4.6Hz,3H),7.03(t,J＝7.4Hz,1H),6.92(d,J＝8.7Hz,2H),6.87(s,1H),4.29(d,J＝17.6Hz,1H),4.06–3.94(m,2H),3.73(s,3H),3.49(dd,J＝13.5,7.9Hz,1H),3.42(s,2H),3.21(ddd,J＝21.2,14.6,5.9Hz,2H),2.96(dd,J＝14.7,12.1Hz,1H),2.75(d,J＝10.3Hz,2H),1.86(t,J＝10.4Hz,2H),1.63(s,2H),1.43(dd,J＝13.5,7.0Hz,2H),1.23–1.04(m,3H).HRMS(EI)m/z calcd for C35H38N4O3(M+)
562.2944,found 562.2945.
562.2944,found 562.2945.
[0136] 实施例12(6S,12aS)-6-(4-甲氧基苯基)-2-(2-(1-苄基哌啶-4-基)乙基)-2,3,6,7,12,12a-六氢吡嗪并[1',2':1,6]吡啶并[3,4-b]吲哚-1,4-二酮(化合物IA-4)的制备[0137]
[0138] 具体实施步骤同实施例6，不同之处在于将原料中间体III-1替换为中间体III-4，得白色固体175mg，产率61％。
[0139] mp 112-115℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.95(s,1H),7.60(dd,J＝6.2,2.4Hz,1H),7.39–7.27(m,5H),7.26–7.11(m,5H),6.76(d,J＝8.7Hz,2H),6.23(s,1H),4.29(dd,J＝
11.4,4.4Hz,1H),4.10–4.01(m,1H),3.87(d,J＝17.3Hz,1H),3.79–3.73(m,1H),3.72(s,
3H),3.60(dd,J＝16.1,9.0Hz,3H),3.41–3.30(m,1H),3.22(dd,J＝15.5,12.0Hz,1H),2.94(d,J＝10.4Hz,2H),2.00(s,2H),1.69(s,2H),1.50(dd,J＝14.3,7.2Hz,2H),1.42–1.27(m,
3H).HRMS(EI)m/z calcd for C35H38N4O3(M+)562.2944,found 562.2946.
11.4,4.4Hz,1H),4.10–4.01(m,1H),3.87(d,J＝17.3Hz,1H),3.79–3.73(m,1H),3.72(s,
3H),3.60(dd,J＝16.1,9.0Hz,3H),3.41–3.30(m,1H),3.22(dd,J＝15.5,12.0Hz,1H),2.94(d,J＝10.4Hz,2H),2.00(s,2H),1.69(s,2H),1.50(dd,J＝14.3,7.2Hz,2H),1.42–1.27(m,
3H).HRMS(EI)m/z calcd for C35H38N4O3(M+)562.2944,found 562.2946.
[0140] 实施例13(6S,12aS)-6-(4-甲氧基苯基)-2-(2-(1-(环己基甲基)哌啶-4-基)乙基)-2,3,6,7,12,12a-六氢吡嗪并[1',2':1,6]吡啶并[3,4-b]吲哚-1,4-二酮(化合物IC-1)的制备
[0141]
[0142] 将563mg(1mmol)化合物IA-1溶于10mL甲醇中，加入10％Pd/C 115mg，充入氢气，室温搅拌反应过夜，反应完毕后，抽滤除去Pd/C，减压蒸除溶剂，得331mg灰白色固体，即中间体IV-1。然后将95mg(0.2mmol)中间体IV-1、42mg(0.3mmol)碳酸钾和4mL乙腈加入圆底烧瓶中，室温搅拌10min，然后将39mg(0.22mmol)环己基溴甲烷加到上述反应体系中，室温搅拌反应16h，反应完毕后，抽滤，减压蒸除溶剂，残留物用硅胶柱层析分离纯化，二氯甲烷/甲醇＝15/1洗脱，得38mg白色固体，产率33％。
[0143] mp 151-153℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.97(s,1H),7.61(d,J＝7.5Hz,1H),7.29(d,J＝7.2Hz,1H),7.23(s,2H),7.18(dt,J＝13.0,6.4Hz,2H),6.77(d,J＝8.5Hz,2H),6.28(s,1H),4.31(dd,J＝11.3,4.7Hz,1H),4.08(d,J＝17.2Hz,1H),3.86(d,J＝17.2Hz,1H),3.72(d,J＝11.4Hz,3H),3.70(d,J＝4.9Hz,1H),3.60–3.37(m,4H),3.23(dd,J＝15.9,
11.7Hz,1H),2.72(s,2H),2.45(s,2H),2.18(s,2H),1.99–1.51(m,16H).HRMS(EI)m/z calcd for C35H44N4O3(M+)568.3413,found 568.3414.
11.7Hz,1H),2.72(s,2H),2.45(s,2H),2.18(s,2H),1.99–1.51(m,16H).HRMS(EI)m/z calcd for C35H44N4O3(M+)568.3413,found 568.3414.
[0144] 实施例14(6S,12aS)-6-(4-甲氧基苯基)-2-(2-(1-(2-氟苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-2,3,6,7,12,12a-六氢吡嗪并[1',2':1,6]吡啶并[3,4-b]吲哚-1,4-二酮(化合物IC-2)的制备
[0145]
[0146] 具体实施步骤同实施例13，不同之处在于将原料环己基溴甲烷替换为2-氟苄溴，硅胶柱层析分离纯化，洗脱液为二氯甲烷/甲醇＝20/1，得白色固体77mg，产率66％。
[0147] mp 93-94℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.90(s,1H),7.60(dd,J＝6.3,2.5Hz,1H),7.31–7.27(m,2H),7.24–6.96(m,8H),6.79–6.72(m,2H),6.23(s,1H),4.29(dd,J＝11.7,
4.1Hz,1H),4.05(dd,J＝17.3,1.2Hz,1H),3.87(d,J＝17.4Hz,1H),3.76(d,J＝4.7Hz,1H),
3.72(s,3H),3.71–3.51(m,3H),3.41–3.30(m,1H),3.22(dd,J＝14.9,11.5Hz,1H),3.00(s,
2H),2.09(s,2H),1.73(s,2H),1.50(dd,J＝14.2,7.2Hz,2H),1.34–1.27(m,3H).HRMS(EI)m/z calcd for C35H37FN4O3(M+)580.2850,found 580.2851.
4.1Hz,1H),4.05(dd,J＝17.3,1.2Hz,1H),3.87(d,J＝17.4Hz,1H),3.76(d,J＝4.7Hz,1H),
3.72(s,3H),3.71–3.51(m,3H),3.41–3.30(m,1H),3.22(dd,J＝14.9,11.5Hz,1H),3.00(s,
2H),2.09(s,2H),1.73(s,2H),1.50(dd,J＝14.2,7.2Hz,2H),1.34–1.27(m,3H).HRMS(EI)m/z calcd for C35H37FN4O3(M+)580.2850,found 580.2851.
[0148] 实施例15(6S,12aS)-6-(4-甲氧基苯基)-2-(2-(1-(3-氟苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-2,3,6,7,12,12a-六氢吡嗪并[1',2':1,6]吡啶并[3,4-b]吲哚-1,4-二酮(化合物IC-3)的制备
[0149]
[0150] 具体实施步骤同实施例13，不同之处在于将原料环己基溴甲烷替换为3-氟苄氯，硅胶柱层析分离纯化，洗脱液为二氯甲烷/甲醇＝20/1，得白色固体42mg，产率36％。
[0151] mp 98-100℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.86(s,1H),7.61(dd,J＝6.4,2.4Hz,1H),7.32–7.06(m,8H),7.03–6.91(m,1H),6.77(d,J＝8.8Hz,2H),6.24(s,1H),4.30(dd,J＝
11.5,4.1Hz,1H),4.07(dd,J＝17.3,1.2Hz,1H),3.88(d,J＝17.4Hz,1H),3.76(d,J＝
4.7Hz,1H),3.73(s,3H),3.72–3.51(m,3H),3.43–3.31(m,1H),3.23(dd,J＝15.5,12.1Hz,
1H),2.94(s,2H),2.04(s,2H),1.73(s,2H),1.52(dd,J＝13.9,7.0Hz,2H),1.34–1.27(m,
3H).HRMS(EI)m/z calcd for C35H37FN4O3(M+)580.2850,found 580.2849.
11.5,4.1Hz,1H),4.07(dd,J＝17.3,1.2Hz,1H),3.88(d,J＝17.4Hz,1H),3.76(d,J＝
4.7Hz,1H),3.73(s,3H),3.72–3.51(m,3H),3.43–3.31(m,1H),3.23(dd,J＝15.5,12.1Hz,
1H),2.94(s,2H),2.04(s,2H),1.73(s,2H),1.52(dd,J＝13.9,7.0Hz,2H),1.34–1.27(m,
3H).HRMS(EI)m/z calcd for C35H37FN4O3(M+)580.2850,found 580.2849.
[0152] 实施例16(6S,12aS)-6-(4-甲氧基苯基)-2-(2-(1-(4-氟苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-2,3,6,7,12,12a-六氢吡嗪并[1',2':1,6]吡啶并[3,4-b]吲哚-1,4-二酮(化合物IC-4)的制备
[0153]
[0154] 具体实施步骤同实施例13，不同之处在于将原料环己基溴甲烷替换为4-氟苄氯，硅胶柱层析分离纯化，洗脱液为二氯甲烷/甲醇＝20/1，得白色固体51mg，产率44％。
[0155] mp 103-104℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.84(s,1H),7.61(d,J＝8.2Hz,1H),7.29(d,J＝7.4Hz,2H),7.26–7.12(m,5H),7.00(t,J＝8.6Hz,2H),6.77(d,J＝8.7Hz,2H),6.23(s,1H),4.30(dd,J＝11.4,4.4Hz,1H),4.07(d,J＝17.2Hz,1H),3.88(d,J＝17.4Hz,1H),3.77(d,J＝4.7Hz,1H),3.73(s,3H),3.65–3.55(m,1H),3.52(s,2H),3.42–3.31(m,1H),
3.23(dd,J＝15.8,11.7Hz,1H),2.90(s,2H),1.99(s,2H),1.70(s,2H),1.51(dd,J＝14.0,
7.2Hz,2H),1.38–1.28(m,3H).HRMS(EI)m/z calcd for C35H37FN4O3(M+)580.2850,found
580.2852.
3.23(dd,J＝15.8,11.7Hz,1H),2.90(s,2H),1.99(s,2H),1.70(s,2H),1.51(dd,J＝14.0,
7.2Hz,2H),1.38–1.28(m,3H).HRMS(EI)m/z calcd for C35H37FN4O3(M+)580.2850,found
580.2852.
[0156] 实施例17(6S,12aS)-6-(4-甲氧基苯基)-2-(2-(1-(3-氯苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-2,3,6,7,12,12a-六氢吡嗪并[1',2':1,6]吡啶并[3,4-b]吲哚-1,4-二酮(化合物IC-5)的制备
[0157]
[0158] 具体实施步骤同实施例13，不同之处在于将原料环己基溴甲烷替换为3-氯苄溴，硅胶柱层析分离纯化，洗脱液为二氯甲烷/甲醇＝20/1，得白色固体37mg，产率31％。
[0159] mp 97-100℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.82(s,1H),7.65–7.58(m,1H),7.40–7.27(m,4H),7.25–7.10(m,5H),6.77(d,J＝8.7Hz,2H),6.24(s,1H),4.30(dd,J＝11.6,4.2Hz,1H),4.07(d,J＝17.3Hz,1H),3.88(d,J＝17.4Hz,1H),3.77(s,1H),3.73(s,3H),3.73–3.51(m,3H),3.38(dt,J＝13.9,7.1Hz,1H),3.23(dd,J＝15.5,12.0Hz,1H),2.87(s,2H),2.01(s,2H),1.72(s,2H),1.52(d,J＝6.0Hz,2H),1.40–1.29(m,3H).HRMS(EI)m/z calcd for C35H37ClN4O3(M+)596.2554,found 596.2548.
[0160] 实施例18(6S,12aS)-6-(4-甲氧基苯基)-2-(2-(1-(3-溴苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-2,3,6,7,12,12a-六氢吡嗪并[1',2':1,6]吡啶并[3,4-b]吲哚-1,4-二酮(化合物IC-6)的制备
[0161]
[0162] 具体实施步骤同实施例13，不同之处在于将原料环己基溴甲烷替换为3-溴苄溴，硅胶柱层析分离纯化，洗脱液为二氯甲烷/甲醇＝20/1，得白色固体41mg，产率32％。
[0163] mp 95-98℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.99(s,1H),7.65–7.56(m,1H),7.47(s,1H),7.38(d,J＝7.8Hz,1H),7.26–7.12(m,7H),6.75(d,J＝8.7Hz,2H),6.22(s,1H),4.29(dd,J＝11.4,4.4Hz,1H),4.06(d,J＝17.3Hz,1H),3.88(d,J＝17.3Hz,1H),3.79–3.73(m,1H),
3.71(s,3H),3.64–3.54(m,1H),3.46(s,2H),3.40–3.30(m,1H),3.23(dd,J＝15.7,11.6Hz,
1H),2.86(d,J＝11.3Hz,2H),1.94(t,J＝10.9Hz,2H),1.68(s,2H),1.50(dd,J＝14.1,
7.1Hz,2H),1.39–1.27(m,3H).HRMS(EI)m/z calcd for C35H37BrN4O3(M+)640.2049,found
640.2047.
3.71(s,3H),3.64–3.54(m,1H),3.46(s,2H),3.40–3.30(m,1H),3.23(dd,J＝15.7,11.6Hz,
1H),2.86(d,J＝11.3Hz,2H),1.94(t,J＝10.9Hz,2H),1.68(s,2H),1.50(dd,J＝14.1,
7.1Hz,2H),1.39–1.27(m,3H).HRMS(EI)m/z calcd for C35H37BrN4O3(M+)640.2049,found
640.2047.
[0164] 实施例19(6S,12aS)-6-(4-甲氧基苯基)-2-(2-(1-(3-碘苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-2,3,6,7,12,12a-六氢吡嗪并[1',2':1,6]吡啶并[3,4-b]吲哚-1,4-二酮(化合物IC-7)的制备
[0165]
[0166] 具体实施步骤同实施例13，不同之处在于将原料环己基溴甲烷替换为3-碘苄溴，硅胶柱层析分离纯化，洗脱液为二氯甲烷/甲醇＝20/1，得白色固体49mg，产率36％。
[0167] mp 95-96℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.82(s,1H),7.68(s,1H),7.60(t,J＝7.5Hz,2H),7.28(s,1H),7.26–7.12(m,5H),7.05(t,J＝7.8Hz,1H),6.77(d,J＝8.7Hz,2H),6.23(s,1H),4.30(dd,J＝11.3,4.5Hz,1H),4.07(d,J＝17.4Hz,1H),3.89(d,J＝17.3Hz,1H),
3.79–3.74(m,1H),3.73(s,3H),3.66–3.53(m,1H),3.51–3.31(m,3H),3.23(dd,J＝16.2,
12.0Hz,1H),2.86(s,2H),1.95(s,2H),1.68(s,2H),1.51(dd,J＝14.1,7.0Hz,2H),1.35(d,J＝15.5Hz,3H).HRMS(EI)m/z calcd for C35H37IN4O3(M+)688.1910,found 688.1912.[0168] 实施例20(6S,12aS)-6-(4-甲氧基苯基)-2-(2-(1-(2-吡啶甲基)哌啶-4-基)乙基)-2,3,6,7,12,12a-六氢吡嗪并[1',2':1,6]吡啶并[3,4-b]吲哚-1,4-二酮(化合物IC-
8)的制备
3.79–3.74(m,1H),3.73(s,3H),3.66–3.53(m,1H),3.51–3.31(m,3H),3.23(dd,J＝16.2,
12.0Hz,1H),2.86(s,2H),1.95(s,2H),1.68(s,2H),1.51(dd,J＝14.1,7.0Hz,2H),1.35(d,J＝15.5Hz,3H).HRMS(EI)m/z calcd for C35H37IN4O3(M+)688.1910,found 688.1912.[0168] 实施例20(6S,12aS)-6-(4-甲氧基苯基)-2-(2-(1-(2-吡啶甲基)哌啶-4-基)乙基)-2,3,6,7,12,12a-六氢吡嗪并[1',2':1,6]吡啶并[3,4-b]吲哚-1,4-二酮(化合物IC-
8)的制备
[0169]
[0170] 具体实施步骤同实施例13，不同之处在于将原料环己基溴甲烷替换为2-氯甲基吡啶盐酸盐，碳酸钾由1.5eq变为3eq，硅胶柱层析分离纯化，洗脱液为二氯甲烷/甲醇＝10/1，得白色固体43mg，产率38％。
[0171] mp 85-86℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.57(d,J＝4.5Hz,1H),7.81(s,1H),7.70(s,1H),7.61(d,J＝6.7Hz,1H),7.28(s,1H),7.26–7.13(m,6H),6.78(d,J＝8.6Hz,2H),6.24(s,1H),4.37–4.24(m,1H),4.07(d,J＝17.9Hz,1H),3.88(d,J＝17.6Hz,1H),3.81–3.75(m,
1H),3.74(s,3H),3.59(dd,J＝13.8,7.1Hz,2H),3.42–3.33(m,1H),3.23(dd,J＝15.7,
11.7Hz,2H),1.77(s,2H),1.62(s,4H),1.38(d,J＝39.9Hz,5H).HRMS(EI)m/z calcd for C34H37N5O3(M+)563.2896,found 563.2902.
1H),3.74(s,3H),3.59(dd,J＝13.8,7.1Hz,2H),3.42–3.33(m,1H),3.23(dd,J＝15.7,
11.7Hz,2H),1.77(s,2H),1.62(s,4H),1.38(d,J＝39.9Hz,5H).HRMS(EI)m/z calcd for C34H37N5O3(M+)563.2896,found 563.2902.
[0172] 实施例21(6S,12aS)-6-(4-甲氧基苯基)-2-(2-(1-(3-吡啶甲基)哌啶-4-基)乙基)-2,3,6,7,12,12a-六氢吡嗪并[1',2':1,6]吡啶并[3,4-b]吲哚-1，4-二酮(化合物IC-9)的制备
[0173]
[0174] 具体实施步骤同实施例13，不同之处在于将原料环己基溴甲烷替换为3-溴甲基吡啶氢溴酸盐，碳酸钾由1.5eq变为3eq，硅胶柱层析分离纯化，洗脱液为二氯甲烷/甲醇＝10/1，得白色固体47mg，产率42％。
[0175] mp 91-92℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.54(d,J＝5.4Hz,2H),8.09(s,1H),7.61(dd,J＝6.2,2.7Hz,1H),7.32–7.27(m,2H),7.25–7.10(m,5H),6.82–6.69(m,2H),6.23(s,1H),4.30(dd,J＝11.5,4.1Hz,1H),4.07(dd,J＝17.3,1.3Hz,1H),3.88(d,J＝17.3Hz,1H),
3.79–3.73(m,1H),3.72(s,3H),3.64–3.46(m,3H),3.43–3.31(m,1H),3.29–3.17(m,1H),
2.86(d,J＝10.3Hz,2H),2.00(s,2H),1.76–1.68(m,2H),1.52(dd,J＝14.2,7.2Hz,2H),
1.39–1.27(m,3H).HRMS(EI)m/z calcd for C34H37N5O3(M+)563.2896,found 563.2897.[0176] 实施例22(6S,12aS)-6-(4-甲氧基苯基)-2-(2-(1-(4-吡啶甲基)哌啶-4-基)乙基)-2,3,6,7,12,12a-六氢吡嗪并[1',2':1,6]吡啶并[3,4-b]吲哚-1,4-二酮(化合物IC-
10)的制备
3.79–3.73(m,1H),3.72(s,3H),3.64–3.46(m,3H),3.43–3.31(m,1H),3.29–3.17(m,1H),
2.86(d,J＝10.3Hz,2H),2.00(s,2H),1.76–1.68(m,2H),1.52(dd,J＝14.2,7.2Hz,2H),
1.39–1.27(m,3H).HRMS(EI)m/z calcd for C34H37N5O3(M+)563.2896,found 563.2897.[0176] 实施例22(6S,12aS)-6-(4-甲氧基苯基)-2-(2-(1-(4-吡啶甲基)哌啶-4-基)乙基)-2,3,6,7,12,12a-六氢吡嗪并[1',2':1,6]吡啶并[3,4-b]吲哚-1,4-二酮(化合物IC-
10)的制备
[0177]
[0178] 具体实施步骤同实施例13，不同之处在于将原料环己基溴甲烷替换为4-溴甲基吡啶氢溴酸盐，碳酸钾由1.5eq变为3eq，硅胶柱层析分离纯化，洗脱液为二氯甲烷/甲醇＝10/1，得白色固体36mg，产率32％。
[0179] mp 123-124℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.53(d,J＝5.4Hz,2H),8.08(s,1H),7.61(dd,J＝6.2,2.7Hz,1H),7.32–7.11(m,7H),6.82–6.69(m,2H),6.23(s,1H),4.30(dd,J＝11.5,4.1Hz,1H),4.07(dd,J＝17.3,1.3Hz,1H),3.88(d,J＝17.3Hz,1H),3.79–3.73(m,
1H),3.72(s,3H),3.64–3.46(m,3H),3.43–3.31(m,1H),3.29–3.17(m,1H),2.86(d,J＝
10.3Hz,2H),2.00(t,J＝10.7Hz,2H),1.76–1.68(m,2H),1.52(dd,J＝14.2,7.2Hz,2H),
1.39–1.27(m,3H).HRMS(EI)m/z calcd for C34H37N5O3(M+)563.2896,found 563.2897.[0180] 实施例23(6S,12aS)-6-(4-甲氧基苯基)-2-(2-(1-(4-氰基苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-2,3,6,7,12,12a-六氢吡嗪并[1',2':1,6]吡啶并[3,4-b]吲哚-1,4-二酮(化合物IC-
11)的制备
1H),3.72(s,3H),3.64–3.46(m,3H),3.43–3.31(m,1H),3.29–3.17(m,1H),2.86(d,J＝
10.3Hz,2H),2.00(t,J＝10.7Hz,2H),1.76–1.68(m,2H),1.52(dd,J＝14.2,7.2Hz,2H),
1.39–1.27(m,3H).HRMS(EI)m/z calcd for C34H37N5O3(M+)563.2896,found 563.2897.[0180] 实施例23(6S,12aS)-6-(4-甲氧基苯基)-2-(2-(1-(4-氰基苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-2,3,6,7,12,12a-六氢吡嗪并[1',2':1,6]吡啶并[3,4-b]吲哚-1,4-二酮(化合物IC-
11)的制备
[0181]
[0182] 具体实施步骤同实施例13，不同之处在于将原料环己基溴甲烷替换为4-氰基苄氯，硅胶柱层析分离纯化，洗脱液为二氯甲烷/甲醇＝30/1，得白色固体73mg，产率62％。
[0183] mp 124-125℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.87(s,1H),7.60(d,J＝8.1Hz,3H),7.44(d,J＝7.5Hz,2H),7.27(s,1H),7.25–7.11(m,4H),6.76(d,J＝8.7Hz,2H),6.23(s,1H),4.30(dd,J＝11.6,4.4Hz,1H),4.07(d,J＝17.0Hz,1H),3.89(d,J＝17.3Hz,1H),3.80–3.73(m,1H),3.73(d,J＝4.6Hz,3H),3.63–3.46(m,3H),3.43–3.33(m,1H),3.23(dd,J＝15.8,
11.8Hz,1H),2.80(s,2H),1.95(s,2H),1.69(s,2H),1.51(d,J＝6.0Hz,2H),1.33(s,3H).HRMS(EI)m/z calcd for C36H37N5O3(M+)587.2896,found 587.2895.
11.8Hz,1H),2.80(s,2H),1.95(s,2H),1.69(s,2H),1.51(d,J＝6.0Hz,2H),1.33(s,3H).HRMS(EI)m/z calcd for C36H37N5O3(M+)587.2896,found 587.2895.
[0184] 实施例24(6S,12aS)-6-(4-甲氧基苯基)-2-(2-(1-(4-甲基苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-2,3,6,7,12,12a-六氢吡嗪并[1',2':1,6]吡啶并[3,4-b]吲哚-1,4-二酮(化合物IC-12)的制备
[0185]
[0186] 具体实施步骤同实施例13，不同之处在于将原料环己基溴甲烷替换为4-甲基苄溴，硅胶柱层析分离纯化，洗脱液为二氯甲烷/甲醇＝30/1，得白色固体41mg，产率36％。
[0187] mp 84-85℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.86(s,1H),7.61(d,J＝6.7Hz,1H),7.27(d,J＝4.0Hz,2H),7.18(ddd,J＝14.4,13.7,8.5Hz,7H),6.77(d,J＝8.7Hz,2H),6.23(s,1H),4.29(dd,J＝11.5,4.8Hz,1H),4.06(d,J＝17.3Hz,1H),3.87(d,J＝17.3Hz,1H),3.79–3.75(m,1H),3.72(d,J＝6.1Hz,3H),3.65–3.52(m,2H),3.43–3.29(m,1H),3.22(dd,J＝15.5,
11.7Hz,2H),2.99(s,2H),2.05(s,2H),1.69(d,J＝27.0Hz,6H),1.51(dd,J＝13.8,6.9Hz,
6H),1.36(dd,J＝32.5,16.9Hz,10H).HRMS(EI)m/z calcd for C36H43N4O3(M+)576.3100,found 576.3102.
11.7Hz,2H),2.99(s,2H),2.05(s,2H),1.69(d,J＝27.0Hz,6H),1.51(dd,J＝13.8,6.9Hz,
6H),1.36(dd,J＝32.5,16.9Hz,10H).HRMS(EI)m/z calcd for C36H43N4O3(M+)576.3100,found 576.3102.
[0188] 实施例25(6S,12aS)-6-(4-甲氧基苯基)-2-(2-(1-(4-甲氧基苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-2,3,6,7,12,12a-六氢吡嗪并[1',2':1,6]吡啶并[3,4-b]吲哚-1,4-二酮(化合物IC-13)的制备
[0189]
[0190] 具体实施步骤同实施例13，不同之处在于将原料环己基溴甲烷替换为4-甲氧基苄氯，硅胶柱层析分离纯化，洗脱液为二氯甲烷/甲醇＝30/1，得白色固体79mg，产率67％。
[0191] mp 91-93℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.88(s,1H),7.61(d,J＝8.1Hz,1H),7.30(d,J＝11.8Hz,2H),7.18(ddd,J＝15.0,14.6,7.9Hz,5H),6.88(d,J＝8.4Hz,2H),6.77(d,J＝8.7Hz,2H),6.24(s,1H),4.29(dd,J＝11.7,4.5Hz,1H),4.06(d,J＝17.0Hz,1H),3.87(d,J＝17.3Hz,1H),3.80(s,3H),3.76(d,J＝4.7Hz,1H),3.72(d,J＝7.3Hz,3H),3.69–3.50(m,
3H),3.36(dt,J＝14.2,7.2Hz,1H),3.23(dd,J＝15.9,11.9Hz,1H),3.03(s,2H),2.09(s,
2H),1.80(s,2H),1.52(dd,J＝14.1,7.3Hz,4H),1.33(s,3H).HRMS(EI)m/z calcd for C36H40N4O4(M+)592.3050,found592.3052.
3H),3.36(dt,J＝14.2,7.2Hz,1H),3.23(dd,J＝15.9,11.9Hz,1H),3.03(s,2H),2.09(s,
2H),1.80(s,2H),1.52(dd,J＝14.1,7.3Hz,4H),1.33(s,3H).HRMS(EI)m/z calcd for C36H40N4O4(M+)592.3050,found592.3052.
[0192] 实施例26(6S,12aS)-6-(4-甲氧基苯基)-2-(2-(1-(4-硝基苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-2,3,6,7,12,12a-六氢吡嗪并[1',2':1,6]吡啶并[3,4-b]吲哚-1,4-二酮(化合物IC-14)的制备
[0193]
[0194] 具体实施步骤同实施例13，不同之处在于将原料环己基溴甲烷替换为4-硝基苄溴，硅胶柱层析分离纯化，洗脱液为二氯甲烷/甲醇＝20/1，得白色固体52mg，产率43％。
[0195] mp 104-105℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.17(d,J＝8.5Hz,2H),7.88(s,1H),7.61(d,J＝6.8Hz,1H),7.51(d,J＝7.8Hz,2H),7.28(s,1H),7.25–7.12(m,4H),6.76(d,J＝8.6Hz,2H),6.23(s,1H),4.30(dd,J＝11.3,4.4Hz,1H),4.07(d,J＝17.1Hz,1H),3.89(d,J＝17.4Hz,1H),3.77(d,J＝4.8Hz,1H),3.72(s,3H),3.65–3.51(m,3H),3.45–3.34(m,1H),
3.23(dd,J＝15.8,11.5Hz,1H),2.82(s,2H),1.98(s,2H),1.52(d,J＝6.3Hz,4H),1.44–+
1.33(m,3H).HRMS(EI)m/z calcd for C35H37N5O5(M)670.2795,found 670.2792.[0196] 实施例27(6S,12aS)-6-(4-甲氧基苯基)-2-(2-(1-(3-噻吩甲基)哌啶-4-基)乙基)-2,3,6,7,12,12a-六氢吡嗪并[1',2':1,6]吡啶并[3,4-b]吲哚-1,4-二酮(化合物IC-
15)的制备
3.23(dd,J＝15.8,11.5Hz,1H),2.82(s,2H),1.98(s,2H),1.52(d,J＝6.3Hz,4H),1.44–+
1.33(m,3H).HRMS(EI)m/z calcd for C35H37N5O5(M)670.2795,found 670.2792.[0196] 实施例27(6S,12aS)-6-(4-甲氧基苯基)-2-(2-(1-(3-噻吩甲基)哌啶-4-基)乙基)-2,3,6,7,12,12a-六氢吡嗪并[1',2':1,6]吡啶并[3,4-b]吲哚-1,4-二酮(化合物IC-
15)的制备
[0197]
[0198] 具体实施步骤同实施例13，不同之处在于将原料环己基溴甲烷替换为3-溴甲基噻吩，硅胶柱层析分离纯化，洗脱液为二氯甲烷/甲醇＝20/1，得白色固体28mg，产率25％。
[0199] mp 106-107℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.83(s,1H),7.61(d,J＝7.0Hz,1H),7.32(d,J＝28.3Hz,2H),7.26–7.11(m,6H),6.77(d,J＝8.7Hz,2H),6.24(s,1H),4.30(dd,J＝11.4,4.3Hz,1H),4.07(d,J＝17.3Hz,1H),3.88(d,J＝17.4Hz,1H),3.76(d,J＝4.8Hz,1H),
3.73(s,3H),3.73–3.48(m,4H),3.44–3.32(m,1H),3.23(dd,J＝15.4,11.5Hz,1H),3.02(s,
2H),2.05(s,2H),1.74(s,2H),1.53(d,J＝7.1Hz,2H),1.35(d,J＝15.6Hz,3H).HRMS(EI)m/z calcd for C35H36N4O3S(M+)568.2508,found 568.2507.
3.73(s,3H),3.73–3.48(m,4H),3.44–3.32(m,1H),3.23(dd,J＝15.4,11.5Hz,1H),3.02(s,
2H),2.05(s,2H),1.74(s,2H),1.53(d,J＝7.1Hz,2H),1.35(d,J＝15.6Hz,3H).HRMS(EI)m/z calcd for C35H36N4O3S(M+)568.2508,found 568.2507.
[0200] 实施例28本发明化合物抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性测试实验方法及活性结果
[0201] 本发明采用改良的Ellman方法评价化合物对乙酰胆碱酯酶的抑制活性，具体操作步骤如下：
[0202] 选取大鼠皮层酶原作为乙酰胆碱酯酶酶原，在96孔板中加入去离子水109μl,0.1M PBS 50μL，大鼠皮层匀浆10μL，2mM S-ACh 30μL，DTNB 0.2％50μL，待测化合物1μL，室温反应20min后加入终止液SDS 3％50μL，读取OD450nm，计算化合物对AChE活力抑制作用。
[0203] 活性数据如表1所示，结果表明，由表1可以看出，本发明具有结构通式I的4-甲氧基苯基取代四氢-β-咔啉哌嗪二酮类衍生物具有较好的乙酰胆碱酯酶抑制活性，其中大部分化合物的乙酰胆碱酯酶抑制活性优于国内上市抗AD药物石杉碱甲，部分化合物的乙酰胆碱酯酶抑制活性和FDA批准的抗AD药物多奈哌齐活性相当，表明本发明的化合物是潜在的乙酰胆碱酯酶抑制剂类抗AD药物。
[0204] 表1 4-甲氧基苯基取代四氢-β-咔啉哌嗪二酮类衍生物对乙酰胆碱酯酶的抑制活性数据
[0205]
[0206]
[0207] 表1中，Hup A为石杉碱甲，Don为多奈哌齐，两者作为阳性对照药物，Tadalafil为他达拉非。“-”表示未测试。
[0208] 实施例29本发明化合物抑制丁酰胆碱酯酶(BuChE)的活性测试实验方法及活性结果
[0209] 本发明对合成的4-甲氧基苯基取代四氢-β-咔啉哌嗪二酮类衍生物，选取14个对AChE抑制活性较好的化合物，评价其对丁酰胆碱酯酶的抑制活性。
[0210] 具体操作步骤如下：以大鼠血清酶原的丁酰胆碱酯酶作为酶原，在96孔板中加入H2O 99μL,0.1M PBS 50μL,大鼠血清20μL,2mM S-Buch 40μL，DTNB 0.2％50μL，待测化合物1μL，室温反应20min后加入终止液SDS 3％50μL，读取OD450nm，计算化合物对BuChE活力抑制作用。
[0211] 活性数据如表2所示，结果表明，本发明的化合物对丁酰胆碱酯酶的抑制活性均弱于乙酰胆碱酯酶，选择指数SI从大于55到2500不等，表明该类化合物对乙酰胆碱酯酶具有较好的选择性，是选择性乙酰胆碱酯酶抑制剂。
[0212] 表2 4-甲氧基苯基取代四氢-β-咔啉哌嗪二酮类衍生物对丁酰胆碱酯酶的抑制活性数据及选择性
[0213]
[0214]
[0215] 表2中，选择指数(SI)＝IC50(BuChE)/IC50(AChE)。“-”表示未测试。
[0216] 实施例30本发明化合物抑制磷酸二酯酶5(PDE5)的活性测试实验方法及活性结果[0217] 本发明对合成的3,4-亚甲二氧基苯基取代四氢-β-咔啉哌嗪二酮类衍生物，选取14个对AChE抑制活性较好的化合物，采用同位素标记底物(3H-cGMP)，根据终产物3H-鸟苷水平的改变绘制PDE5A酶活性曲线，考察衍生物对PDE5A活性的影响。
[0218] 活性数据如表3所示，发现大部分化合物具有较好的PDE5A1抑制活性IC50值从0.050μM到3.231μM不等，说明本发明的化合物是良好的磷酸二酯酶5抑制剂，可以发展成为AChE/PDE5双重抑制剂用于阿尔茨海默病的治疗。
[0219] 表3 4-甲氧基苯基取代四氢-β-咔啉哌嗪二酮类衍生物对PDE5A1的抑制活性数据[0220]
[0221] 表3中，Tadalafil为他达拉非，为阳性对照药物。
[0222] 实施例31本发明化合物透过血脑屏障能力的测定
[0223] 作为潜在的中枢神经系统药物，只有透过血脑屏障(Blood-brain barrier，BBB)才能发挥其药效，本发明采用平行人造膜通透性测定方法(parallel artificial membrane permeability assay,PAMPA)测定化合物透过血脑屏障的能力。该方法通过化合物的透膜常数Pe的值来评价其透过血脑屏障的能力。
[0224] 具体操作步骤如下：取4μL 2％(PBL)溶液加于MAIPN4550的96孔板的疏水膜上，定量吸取200μL待测样品液(100μg/mL)加入到96孔板中的膜上方作为给药池，膜另一侧加入300μL缓冲盐(pH 7.4PBS:乙醇＝70:30)为接受池，注意保持接受液与膜的充分接触；室温静止12h后，小心移除给药池，用酶标仪测试接受池内化合物吸光度值(250-500nm)；吸取
200μL待测样品液与300μL缓冲盐(pH 7.4PBS:乙醇＝70:30)充分混匀，作为理论平衡溶液，测试其吸光度值(250-500nm)，需要用acceptor板测试；
200μL待测样品液与300μL缓冲盐(pH 7.4PBS:乙醇＝70:30)充分混匀，作为理论平衡溶液，测试其吸光度值(250-500nm)，需要用acceptor板测试；
[0225] 根据公式计算Pe值：
[0226]
[0227] Vd：给药池体积，Va：接受池体积，A：疏水膜表面积，t：作用时间，[drug]acceptor：接收池中化合物吸光度，[drug]equilibrium：理论上接收池中化合物吸光度。
[0228] 测试结果如表5所示，结果表明大部分化合物能够透过血脑屏障或处于不确定状态，具有良好的成药性。
[0229] 表4 平行人造膜通透性测定方法透过血脑屏障的临界值划分
[0230]
[0231] 表5 化合物的透膜常数(Pe)及其能否通过血脑屏障的预测
[0232]
[0233] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。