一种基于喜树碱类的异二聚体多功能前药及其制备方法和应用

摘要

本发明提供一种基于喜树碱的异二聚体多功能前药，它同时载有喜树碱和2‑(1‑己氧基乙基)‑2‑去乙稀基‑焦脱缓叶绿酸‑a(HPPH)，是喜树碱类与HPPH通过连接基团形成的喜树碱‑HPPH前药，其结构式如式(I)所示；其中，R为连接基团，为‑SS‑、‑CH2CH2‑或者‑S(CH3)C(CH3)S‑中的一种；R1是喜树碱类基团。本发明的前药可以很容易地被两亲性高分子包裹形成纳米颗粒，形成的纳米颗粒载药效率高、载药量大，在谷胱甘肽存在条件下，可以快速释放出未经修饰的喜树碱和HPPH；同时纳米颗粒可以有效地被肿瘤细胞摄取并杀死肿瘤细胞。本发明还提供所述前药的制备方法、制剂及其在制备癌症治疗药物中的应用。

权利要求

1.一种基于喜树碱的异二聚体多功能前药，它同时载有喜树碱和2-(1-己氧基乙基)-

2-去乙稀基-焦脱缓叶绿酸-a(HPPH)，是喜树碱与HPPH通过连接基团形成的喜树碱-HPPH前药，其结构式如式(I)所示：其中，

R为-SS-或者 中的一种；R1是喜树碱基团。

2.权利要求1所述的多功能前药，其结构如下式(II)所示

3.制备权利要求1所述的多功能前药的方法，具体包括以下步骤：

1)在有机溶剂中，在酰化催化剂存在下使用三光气活化喜树碱内酯环上的羟基，再加入过量的2,2'-二硫代二乙醇或者2,2'-(丙烷-2,2-二基双(硫))二乙醇，得到中间体1；

2)将步骤1)得到的中间体1和HPPH在有机溶剂中混合，通过偶联试剂反应生成的酯键，得到所述的喜树碱-HPPH前药。

4.权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤1)所述的有机溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、1,4-二氧六环或二甲基甲酰胺中的任意一种；步骤1)所述的酰化催化剂选自N-乙基-N′-[(3-二甲氨基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)，N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)的任意一种；步骤2)所述的有机溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、1,4-二氧六环或二甲基甲酰胺中的任意一种；步骤2)所述的偶联试剂选自N-乙基-N′-[(3-二甲氨基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)，N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)或1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐(PyBOP)中的任意一种。

5.一种药学上可接受的制剂，其包含权利要求1所述的多功能前药。

6.权利要求5所述的制剂，其特征在于：所述的制剂是纳米颗粒制剂，所述的纳米颗粒外部为赋形剂和/或药用载体，所述的赋形剂和/或药用载体内部包裹权利要求1所述的喜树碱-HPPH前药。

7.权利要求6所述的制剂，其特征在于：所述的赋形剂和/或药用载体为两亲性高分子。

8.权利要求6所述的制剂，其特征在于：所述的赋形剂和/或药用载体为聚乙二醇-b-聚乳酸、聚乙二醇-b-聚己内酯或聚乙二醇-b-聚磷酯中的任意一种。

9.权利要求1所述的多功能前药在制备癌症治疗药物中的应用。

10.权利要求9所述的应用，其特征在于：使用两亲性高分子对权利要求1所述的多功能前药进行物理包裹，制备得到纳米颗粒。

11.权利要求10所述的应用，其特征在于：将权利要求1所述的喜树碱-HPPH前药和两亲性高分子一起溶于有机溶剂，然后滴入正在搅动或者超声的水溶液中，然后挥发掉有机溶剂，制得纳米颗粒；所述的两亲性高分子选自PEG-b-PLA、PEG-b-PCL或PEG-b-PPE中的任意一种。

说明书

一种基于喜树碱类的异二聚体多功能前药及其制备方法和

应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医药技术、纳米医药及药物控制释放技术领域，具体地说是一种还原降解释药的基于喜树碱类的异二聚体多功能前药、及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 癌症是全球第二大死亡原因。根据世界卫生组织统计，2015年癌症造成880万人死亡。全球接近六分之一的人死亡是由于癌症，其中约70％的癌症死亡发生在低收入和中等收入国家。目前，化疗是癌症的主要治疗方法之一。然而，大多数化疗药物，比如喜树碱(camptothecin),紫杉醇(paclitaxel)等，在水中溶解度有限，而且有着不良副作用。因此，对化疗药物的改性以及设计有效的药物投递系统一直是药物控制释放领域的研究焦点。纳米药物已被广泛研究用于癌症治疗。纳米颗粒的使用不仅可以改善这些药物的水分散性，而且还可以增强它们的药代动力学和生物体内分布，改善治疗效果和减少副作用。

[0003] 聚合物胶束(polymeric micelles)纳米粒子是纳米药物治疗癌症领域中最重要的药物载体之一。大多聚合物胶束包括两部分，一是用于药物负载的疏水核心，二是用于改善胶体稳定性的聚乙二醇(PEG)。目前，数种胶束制剂，例如Genexol-PM，NK012和NK105已进入临床试验阶段，但在美国尚未获得批准。这些胶束制剂面临的部分挑战是低载药量，过早药物释放，体内药物代谢快和积累少等。为了解决这些局限性，除了开发新型药物载体，还可以对小分子药物进行修饰。与药物载体优化相比，小分子药物的改性相对简单，可以促进药物开发过程。

[0004] 喜树碱(camptothecin，CPT)最早是从喜树中提取出来的生物碱，它是DNA拓扑异构酶I(TOPO I)抑制剂，在临床前研究中具有显著的抗肿瘤活性。但由于低溶解度和严重不良副作用，在临床试验中失败。目前，喜树碱类似物伊立替康(Irinotecan)和拓扑替康(Topotecan)已被美国食品和药物管理局(FDA)批准用于治疗结肠癌。伊立替康在水中能够水解出7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)，后者具有比伊立替康本身高1000倍的抗肿瘤活性。但伊立替康在人体内仅能够水解少量的7-乙基-10-羟基喜树碱，故其对癌细胞的杀伤力也明显受损。HPPH是一种光敏剂，全称为2-(1-己氧基乙基)-2-去乙稀基-焦脱缓叶绿酸-a(2-[1-hexyloxyethyl]-2-devinyl pyropheophorbide-a)。HPPH在激光照射后，会消耗分子氧以产生单线态氧以杀死癌细胞。CPT作为一种拓扑异构酶I抑制剂，可稳定拓扑异构酶I-DNA复合物，引起DNA损伤，从而杀死癌细胞。此外，CPT是一种缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)抑制剂，能够降低癌症细胞在低氧环境的存活能力。因此，CPT有望增强HPPH诱导的细胞毒效应。
此外，HPPH本身可以作为荧光染料和Cu-64标记的螯合剂，可以通过荧光和定量PET成像监测药物。因此，我们在此发明了一种同时载有喜树碱类和HPPH的化合物，作为谷胱甘肽(GSH)敏感性异二聚体多功能前药，其不仅具有特别高的负载效率和高负载能力，也可以在体内直接PET药物成像，而且还能够实现协同癌症治疗。值得注意的是，PET药物成像的特性使得能够准确监测异二聚体多功能前药并确定其体内的药代动力学和生物分布。此外，当所述异二聚体通过二硫键连接时，二硫键容易被癌细胞中高浓度的GSH裂解，然后通过级联反应从异二聚体多功能前药中释放CPT和HPPH。

[0005] 目前，国内外尚无这种异二聚体多功能前药被报道。

发明内容

[0006] 本发明的首要目的是提供一种可在肿瘤细胞选择性释放喜树碱和HPPH的前药，具有显著的癌细胞抑制效果，同时不良副作用低。

[0007] 本发明的另一目的是提供制备所述的前药的方法，合成过程简单易行，载药量高。

[0008] 本发明的再一目的是提供所述的前药在制备癌症治疗药物中的应用。

[0009] 本发明的上述目的通过以下技术方案实现：

[0010] 首先，提供一种基于喜树碱类的异二聚体多功能前药，它同时载有喜树碱类和HPPH，是喜树碱或其衍生物与HPPH通过连接基团形成的喜树碱类-HPPH前药，其结构如式(I)所示：

[0011]

[0012] 其中，

[0013] R为-CH2CH2-、-SS-、或者 中的一种；R1是喜树碱类基团。

[0014] 本发明的方案中，所述的喜树碱或其衍生物可以选自喜树碱或7-乙基-10-羟基喜树碱中的任意一种。

[0015] 本发明优选的方案中，所述的多功能前药是喜树碱与HPPH通过所述连接基团R形成的前药，即所述式(I)中的R为-SS-，R1是喜树碱基团；其结构如下式(II)所示[0016]

[0017] 本发明还提供一种制备所述喜树碱类-HPPH前药的方法，是以喜树碱或其衍生物为原料，在有机溶剂中，通过与带有相应基团的原料反应，制成喜树碱或其衍生物前药中间体，最后所述中间体再和HPPH反应制备得到所述的喜树碱类-HPPH前药。

[0018] 本发明所述的制备喜树碱类-HPPH前药的方法，具体包括以下步骤：

[0019] 1)在有机溶剂中，在酰化催化剂存在下使用三光气活化喜树碱或其衍生物内酯环上的羟基，再加入过量的2,2'-二硫代二乙醇或1,6-己二醇反应，或者2,2'-(丙烷-2,2-二基双(硫))二乙醇，得到中间体1；

[0020] 2)将步骤1)得到的中间体1和HPPH在有机溶剂中混合，通过偶联试剂反应生成酯键，得到本发明所述的部分喜树碱类-HPPH前药。

[0021] 本发明优选的所述制备方法中，步骤1)所述的有机溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、1,4-二氧六环或二甲基甲酰胺中的任意一种。

[0022] 本发明优选的所述制备方法中，步骤1)所述的酰化催化剂选自N-乙基-N′-[(3-二甲氨基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)、4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP)或N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)的任意一种。

[0023] 本发明优选的所述制备方法中，步骤2)所述的有机溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、1,4-二氧六环或二甲基甲酰胺中的任意一种。

[0024] 本发明优选的所述制备方法中，步骤2)所述的偶联试剂选自1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)、N,N-二环己基碳酸二亚胺(DCC)或1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐(PyBOP)中的任意一种。

[0025] 本发明优选的一种实施方式中，制备式(II)所示前药的方法合成路线如下：

[0026]

[0027] 具体包括如下步骤：

[0028] 在DMAP的存在下，在二氯甲烷中，使用三光气活化喜树碱的羟基，然后与过量的2,2'-二硫代二乙醇反应，制备得到中间体CPT-ss-OH；再将CPT-ss-OH和HPPH一起在二氯甲烷中混合，并加入EDC和DMAP搅拌，制备得到式(II)所示前药：CPT-ss-HPPH。

[0029] 本发明优选的另一种实施方式中，制备了以下式(III)所示的前药：

[0030]

[0031] 其合成路线如下：

[0032]

[0033] 具体包括如下步骤：

[0034] 在DMAP的存在下，在二氯甲烷中，使用三光气活化喜树碱的羟基，然后与过量的1,6-己二醇反应，制备得到中间体CPT-cc-OH；再将CPT-cc-OH和HPPH一起在二氯甲烷中混合，并加入EDC和DMAP搅拌，制备得到式(II)所示前药：CPT-cc-HPPH。

[0035] 本发明的前药可以直接单独用作癌症治疗药物，也可以进一步制成其他药物学上可接受的剂型用于癌症治疗。因此，本发明还提供所述喜树碱类-HPPH前药在药物学上可接受的制剂。

[0036] 本发明优选的方案中，所述的制剂是纳米颗粒制剂，所述的纳米颗粒外部为赋形剂和/或药用载体，所述的赋形剂和/或药用载体内部包裹本有发明所述的喜树碱-HPPH前药。

[0037] 所述的赋形剂和药用载体包括但不限于吐温系列乳化剂(如吐温80、吐温20等)、聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)、脂质体(liposome)或者两亲性高分子中的任意一种或两种以上的混合物。本发明优选两亲性高分子。

[0038] 所述的两亲性高分子选自聚乙二醇-b-聚乳酸(polyethylene glycol-b-polylactide,PEG-b-PLA)、聚乙二醇-b-聚己内酯(polyethylene glycol-b-polycaprolactone,PEG-b-PCL)或聚乙二醇-b-聚磷酯(polyethylene glycol-b-polyphosphoester,PEG-b-PPE)中的任意一种。

[0039] 本发明还提供所述的喜树碱类-HPPH前药在制备所述癌症治疗药物中的应用。

[0040] 本发明优选的应用方案中，使用两亲性高分子对所述的喜树碱类-HPPH前药进行物理包裹，制备得到纳米颗粒。

[0041] 本发明的一种优选的实施方式中，使用两亲性高分子作为药用载体对所述的喜树碱类-HPPH前药进行物理包裹；具体是将本发明所述的喜树碱类-HPPH前药和两亲性高分子以一定比例一起溶于有机溶剂(如四氢呋喃)，然后滴入正在搅动或者超声的水溶液中，然后挥发掉有机溶剂，制得纳米颗粒。所述的两亲性高分子选自PEG-b-PLA、PEG-b-PCL或PEG-b-PPE中的任意一种。

[0042] 在本发明中，喜树碱类和HPPH通过连接键连接在一起形成前药，特别是两者通过二硫键连接在一起时，能够在肿瘤细胞内选择性地释放喜树碱类和HPPH。目前，国内外尚无这种前药被报道。本发明所述的前药及其纳米颗粒制剂具有如下优点：

[0043] (1)喜树碱类和HPPH具有协同作用；

[0044] (2)喜树碱类被化学修饰，在连接键断裂前，对细胞的毒性小；

[0045] (3)当喜树碱类和HPPH被二硫键连接时，该前药对细胞内的还原性物质，如谷胱甘肽敏感，接触谷胱甘肽后能迅速释放喜树碱类和HPPH；

[0046] (4)现有技术中，喜树碱类和HPPH均不易被两亲性高分子包裹，且包裹的药物容易从颗粒内释放出来，而本发明中的前药，由于分子量更大，更疏水，导致他们从颗粒中的释放速度大大降低，有利于降低药物的毒副作用，提高疗效；

[0047] (5)本发明合成的前药能够非常高效地被包裹，纳米颗粒的载药量也非常高；

[0048] (6)前药的合成简单，纳米颗粒的制备容易，有利于临床转化。

附图说明

[0049] 图1为实施例1制备的CPT-ss-HPPH的ESI-MS谱图。

[0050] 图2为实施例1制备的CPT-ss-HPPH的1H NMR(300MHz,CDCl3)谱图。

[0051] 图3为实施例2制备的CPT-cc-HPPH的ESI-MS谱图。

[0052] 图4为实施例2制备的CPT-cc-HPPH的1H NMR(300MHz，CDCl3)谱图。

[0053] 图5为CPT、HPPH和实施例1制备的CPT-ss-HPPH的紫外可见光谱图。

[0054] 图6为实施例3中使用蒽-9,10-二丙酸(ADPA)监测不同药物产生ROS能力的实验中用671纳米激光分别照1、2、3、4、5、6和7分钟后得到的不同药物的UV-Vis光谱图。其中，(a)为HPPH经激光照射后的UV-Vis光谱图；(b)为CPT-ss-HPPH经激光照射后的UV-Vis光谱图；(c)是对HPPH和CPT-ss-HPPH在410纳米的吸光度定量分析；(d)是对HPPH和CPT-ss-HPPH在
662纳米的吸光度定量分析；(e)是HPPH和CPT-ss-HPPH的降解分析。

[0055] 图7为实施例4制备的CPT-ss-HPPH NPs的TEM图像。

[0056] 图8为实施例5所述体外药物释放实验中CPT NPs、HPPH NPs、CPT-cc-HPPH NPs和CPT-ss-HPPH在PBS中的药物释放速率随时间变化图。

[0057] 图9为实施例6所述体外细胞毒性实验测定结果曲线图。

[0058] 图10为实施例4中的CPT-ss-HPPH NP的水合直径分布图。

[0059] 图11为实施例4中的CPT-ss-HPPH NP的zeta电位图。

[0060] 图12为实施例7中荧光显微镜观测到的HCT116肿瘤细胞对HPPH NPs、CPT-cc-HPPH NPs和CPT-ss-HPPH NPs的细胞摄取。比例尺为30微米。

[0061] 图13为实施例8所述HCT116荷瘤小鼠的正电子发射计算机断层扫描(PET)成像。其中白色圆圈为肿瘤位置。

[0062] 图14为实施例8所述通过PET对药物在肿瘤的富集的定量分析(n＝3)。

[0063] 图15为实施例8所述通过对离体器官的γ计数确定的药物分布(n＝3)。

[0064] 图16为实施例9所述体内治疗实验所得肿瘤生长曲线图；其中横坐标第0和第4天处箭头代表静脉注射，第2和第6天处箭头代表激光照射。

[0065] 图17为实施例9所述体内治疗实验所得注射制剂后小鼠的存活率。

具体实施方式

[0066] 下面通过实施例对本发明进行具体描述，本实施例只用于对本发明作进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据上述发明的内容做出的一些非本质的改进和调整，均属本发明保护范围。

[0067] 实施例1：CPT-ss-HPPH的制备

[0068] 在20mL二氯甲烷中混合DMAP(1.15mg，9.42μmol)，HPPH(30mg，4.71μmol)和CPT-ss-OH(51.0mg，94.3μmol)。在搅拌下用滴加5mL EDC HCl(18.1mg，94.3μmol)的二氯甲烷溶液。在室温下搅拌24小时后，通过薄层色谱(TLC)证实HPPH完全反应。使用旋转蒸发器浓缩混合物溶液，随后使用梯度乙酸乙酯和己烷作为洗脱液通过快速色谱法(Teledyne ISCO +CombiFlash)纯化。产量39.9mg(74％)。ESI-MS m/z(M)calcd 1146.46,found 1147.24(M+H+).1H NMR(300MHz,CDCl3)δ9.80(d,J＝8.9Hz,1H),9.52(s,1H),8.44(d,J＝5.7Hz,1H),
8.00(t,J＝8.7Hz,1H),7.69–7.51(m,2H),7.42–7.28(m,2H),7.21(d,J＝7.5Hz,1H),5.91(p,J＝6.5Hz,1H),5.68(d,J＝17.2Hz,1H),5.38–5.3(m,1H),5.09(qd,J＝20.0,3.0Hz,
2H),4.81(d,J＝6.0Hz,1H),4.69(dd,J＝17.3,1.2Hz,1H),4.44–4.38(m,1H),4.40–4.28(m,2H),4.26–4.17(m,3H),3.73(q,J＝7.4Hz,2H),3.67(s,3H),3.65–3.55(m,1H),3.36(d,J＝2.7Hz,3H),3.28(s,3H),2.88(t,J＝6.6Hz,2H),2.77(t,J＝6.6Hz,2H),2.58–2.18(m,
4H),2.13(dd,J＝9.2,6.7Hz,4H),1.80–1.75(m,3H),1.75–1.68(m,3H),1.59(s,6H),1.22–
1.19(m,2H),0.99(t,J＝7.4Hz,3H),0.77(m,3H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ196.18,172.89,
171.54,167.36,160.19,155.39,153.53,150.94,148.94,145.77,145.14,141.44,141.34,
139.87,137.77,136.46,135.68,132.54,132.44,130.73,130.61,130.46,130.40,129.43,
129.36,128.32,128.08,127.96,127.83,127.75,127.67,120.16,120.07,105.98,104.19,
95.76,92.70,78.21,77.36,72.98,69.86,67.14,66.64,62.38,51.59,50.06,48.12,
37.29,36.68,31.96,31.87,31.02,30.36,26.22,24.89,23.31,22.72,19.67,17.63,
14.12,12.22,11.50,11.16,7.82.

[0069] 图1为CPT-ss-HPPH的ESI-MS谱，图2为CPT-ss-HPPH的1H NMR谱图，均证明了制备该化合物成功。CPT-ss-HPPH的紫外可见光谱也显示了CPT和HPPH的特征光谱(图5)。

[0070] 实施例2：CPT-cc-HPPH的制备

[0071] 在20mL二氯甲烷中混合DMAP(0.58mg，4.75μmol)，HPPH(15mg，23.5)和CPT-cc-OH(23.8mgmg，47.1μmol)。在搅拌下用滴加5mL EDC HCl(9.1mg，47.1μmol)的二氯甲烷溶液。在室温下搅拌24小时后，通过薄层色谱(TLC)证实HPPH完全反应。使用旋转蒸发器浓缩混合物溶液，随后使用梯度乙酸乙酯和己烷作为洗脱液通过快速色谱法(Teledyne ISCO CombiFlash)纯化。产量:22.5mg(86％).ESI-MS m/z(M+)calcd 1110.55,found 1111.32(M+H+).1H NMR(300MHz,CDCl3)δ9.78(d,J＝4.1Hz,1H),9.52(s,2H),8.50(s,1H),8.19–7.95(m,4H),7.79–7.59(m,2H),7.57–7.45(m,2H),7.27(s,2H),5.98–5.83(m,2H),5.68(d,J＝
17.3Hz,2H),5.37(dd,J＝17.1,1.1Hz,2H),5.28(d,J＝8.9Hz,1H),5.20(s,2H),5.17–5.02(m,3H),4.46(q,J＝7.4Hz,1H),4.28(d,J＝8.3Hz,1H),4.11–3.98(m,2H),3.99–3.81(m,
2H),3.79–3.53(m,7H),3.37(s,3H),3.27(s,3H),2.73–2.57(m,1H),2.56–2.39(m,1H),
2.38–2.15(m,2H),2.11(d,J＝6.7,1.4Hz,5H),1.80(d,J＝7.3,1.3Hz,4H),1.71(t,J＝
7.6Hz,5H),1.57(s,6H),1.42(t,J＝6.8Hz,4H),1.36–1.14(m,11H),0.98(t,J＝7.5Hz,
3H),0.80–0.73(m,3H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ196.29,173.20,171.59,167.56,160.34,
157.38,155.39,153.91,152.35,150.96,149.10,146.47,145.92,145.13,141.50,139.86,
137.85,136.41,135.73,135.68,132.39,131.10,131.07,130.71,130.55,129.64,128.44 
128.36,128.13,128.09,128.03,127.99,120.38,106.09,104.22,96.00,92.71,77.78,
77.36,72.94,69.84,69.06,67.19,64.55,51.75,50.12,49.96,48.18,32.06,31.86,
31.09,30.35,28.44,26.21,25.54,25.32,24.86,23.30,22.71,19.66,17.61,14.11,
12.23,11.49,11.19,7.78。

[0072] 图3为CPT-cc-HPPH的ESI-MS谱，图4为CPT-cc-HPPH的1H NMR谱图，均证明了制备该化合物成功。

[0073] 实施例3：HPPH和CPT-ss-HPPH的活性氧(ROS)生成

[0074] 通过使用蒽-9,10-二丙酸(ADPA)作为ROS猝灭剂来测量HPPH和实施例1制备的CPT-ss-HPPH的ROS生成。简而言之，将ADPA溶解于DMSO中，稀释至在410nm处具有1.1的UV-Vis吸光度。然后加入1mM DMSO中的HPPH或CPT-ss-HPPH并使终浓度为10μM。所获得的溶液用强度为100mW的671纳米激光照射7分钟。在每分钟，通过UV3100PC分光光度计(VWR，Radnor，PA)记录溶液的UV-Vis吸光度。所得结果由Origin 8分析。

[0075] 如图6所示，我们发现，随着照射时间的增加，HPPH和CPT-ss-HPPH的吸光度不断减小。值得注意的是，与HPPH相比，CPT-ss-HPPH的吸光度的降低更快，表明CPT-ss-HPPH能够产生更多的ROS(图6a-c)。此外，在662nm处HPPH或CPT-ss-HPPH的吸光度损失表明他们在激光照射期间的不稳定(图6a-b)。通过测定662nm处吸光度的损失进行的定量分析显示，接近90％的HPPH降解，相比之下，CPT-ss-HPPH少于20％(图6d-e)。这些结果表明，通过将CPT与HPPH连结在一起形成前药，HPPH的光稳定性和ROS生成能力均得到改善。

[0076] 实施例4：药物纳米颗粒的制备

[0077] 纳米颗粒通过纳米沉淀法获得。简而言之，将CPT-ss-HPPH、CPT-cc-HPPH和HPPH以100μg/mL的浓度溶解于四氢呋喃(THF)中，并添加不同量的聚合物PEG45-b-PLA28分别与上述几种药物充分混合。在搅拌下将混合物溶液从THF中沉淀至水中，并且在通风橱中过夜蒸发除去THF。之后，将混合物以3000RPM离心3分钟以除去任何可能的沉淀物。通过UV-Vis在
660nm测定药物含量。关于CPT包封，使用二甲基亚砜(DMSO)溶解CPT和PEG45-b-PLA28，随后在搅拌下逐滴沉淀到水中。由于离心过程中的高度聚集，不能进行离心。通过高效液相色谱法(HPLC)测量CPT的量。根据以下等式计算载药量(DL)和包封率(EE)。

[0078] DL(％)＝包封药物的质量/载体和包封药物的质量×100％

[0079] EE(％)＝包封药物的重量/初始摄入药物的重量×100％

[0080] 研究结果如表1所示。由于CPT固有的芳香性质，在水溶液和大多数有机溶剂中都具有有限的溶解度。二甲基亚砜(DMSO)是CPT唯一具有良好溶解度的普通溶剂。在4％的药物/聚合物进料比下，通过从DMSO到水的纳米沉淀获得的纳米颗粒具有430±86nm的数均流体动力学直径(表1，序号1)。然而，获得的纳米颗粒不稳定，并在几个小时内沉淀。作为对比，当HPPH的进料比率为10％时，负载效率(LE)高达98％并且药物负载量(DL)高达8.9％(表1，序号2)。当CPT与HPPH连接时，CPT的亲水性羟基和HPPH的亲水性羧酸基分别转化为疏水性碳酸酯和酯基，导致CPT-ss-HPPH的整体疏水性增强。CPT-ss-HPPH的疏水性增加能够更有效地被包封成具有比相应单体更高的LE和DL的纳米载体。结果表明，当药物/聚合物比例从0.2增加到1.5时，CPT-ss-HPPH的DL从16％增加到接近60％，定量LE为96％(表1，序号3-6)。在0.2的进料比下，所获得的纳米颗粒的流体动力学直径为34±9nm(图10)，具有中性ζ电位(图11)。透射电子显微镜(TEM)显示这些纳米颗粒是球形的，平均尺寸为35±5nm(图
7)。在药物投入比为0.4时发现了相似的尺寸分布。在较高的进料比下，它们的直径增加到约50nm(表1，序号5-6)。正如预期的那样，对照CPT-cc-HPPH在0.2药物/聚合物进料比率下也具有高LE(表1，序号7)。由于CPT-ss-HPPH的简单性和有效性，优异的LE和DL对于转化研究具有很高的吸引力。

[0081] 表1

[0082] 序号 药物 比例a 直径(nm)b LE(％) DL(％)1 CPT 0.04 430±86 NAc NAc
2 HPPH 0.1 35±9 98 8.9
3 CPT-ss-HPPH 0.2 34±9 97 16
4 CPT-ss-HPPH 0.4 33±8 97 28
5 CPT-ss-HPPH 1.0 46±11 98 49
6d CPT-ss-HPPH 1.5 52±13 97 59
7 CPT-cc-HPPH 0.2 35±9 97 16

[0083] a药物/PEG-b-PLA的进料比例；b由DLS测量的数字平均流体动力学直径；c不稳定，未进行纯化；d3天后观察到可见的沉淀物。

[0084] 实施例5：药物释放

[0085] 药物的释放通过透析法测量纳米粒子的药物释放。简而言之，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释包含药物的纳米粒子至3.5μM的药物浓度。将1.0mL转移至半透膜管(MWCO：50kDa)中，并分别在37℃下在含有或不含有10mM谷胱甘肽(GSH)的25mLPBS透析4天。在不同的时间点，测定透析液中残留的药物。CPT-ss-HPPH、CPT-cc-HPPH和HPPH通过UV-Vis测量，CPT通过HPLC测量。测量后将测量的样品溶液加回到透析液中。共三组平行试验。

[0086] 胶束药物从高分子胶束制剂中的释放主要是扩散控制过程，这取决于几个因素，包括载体和药物的固有性质，药物在载体上的分布以及释放环境。事实上，胶束制剂的一个普遍缺点是药物初始突释，这通常是由纳米颗粒表面上的弱结合药物引起的。在我们的CPT-ss-HPPH中，更低的水溶性和增加的分子量将会可能导致药物释放速度低于任一种单体药物。另外，我们预计GSH通过切割二硫键会促进CPT-ss-HPPH的药物释放。因此，我们在37℃下研究了CPT NPs、HPPH NPs、CPT-cc-HPPH NPs和CPT-ss-HPPH在PBS中的药物释放(在有和没有10mM GSH的情况下)(图8)。正如预期的那样，CPT和HPPH从纳米颗粒中的释放非常快，类似于大多数胶束制剂，其释放半衰期分别仅为4.6小时和5.6小时。相比之下，CPT-ss-HPPH和CPT-cc-HPPH显示几乎零级释放，其中药物几乎以恒定速率释放。它们的半衰期值被确定为51小时(CPT-ss-HPPH)和46小时(CPT-cc-HPPH)，这比任一单体长约10倍。对于药物递送而言，缓慢的零级释放是非常需要的，因为它可以减少血液循环期间的过早药物释放，并因此改善副作用。如上所述，CPT-ss-HPPH的另一个重要特征是其GSH敏感的二硫键，其允许HPPH和未经过修饰的CPT通过两步级联反应释放。我们的观察证实了这一特征，即10mM GSH确实导致药物释放快得多，释放半衰期仅24小时(图8)。在存在GSH的情况下，释放半衰期显着降低(24小时对51小时)将允许在细胞内化后有效的药物活化和释放，由此允许CPT-ss-HPPH有效杀死细胞。这些药物释放研究表明，我们的GSH敏感的CPT-ss-HPPH纳米颗粒是一个良好控制的响应药物释放系统。

[0087] 实施例6：体外细胞毒性测定

[0088] 将人结肠癌细胞HCT116铺在McCoy's 5a培养基(10％胎牛血清和1％青霉素)的96孔板中。将细胞在37℃含有5％CO2的潮湿气氛中于孵育。使用细胞培养基将药物或载有药物的纳米颗粒稀释至预定浓度。每孔加入100μL具有不同指定药物浓度的细胞培养基。通过加入100μL培养基产生阴性对照。24小时后，用671nm激光以10mW照射含有HPPH，CPT-ss-HPPH或CPT-cc-HPPH的样品孔1分钟。照射后，这些细胞再孵育24小时。对于没有激光处理的样品，将细胞直接孵育48小时。孵育后，用含有0.5mg/mL的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓(MTT)的100μL培养基更换培养基并与其一起孵育2小时。除去含有未反应的MTT的培养基后，将左边的蓝色甲crystals结晶溶解于100μLDMSO中，在BioTek Synergy H4混合读数仪中以波长570nm测定吸光度。测得的吸光度减去空白对照，并且基于对对照未处理的细胞的相对吸光度计算细胞存活力。使用GraphPad Prism 5进行IC50值的计算和统计分析。

[0089] 我们首先测量了游离CPT、HPPH和它们的1:1混合物的细胞毒性。HPPH和CPT的IC50分别为92nM和100nM，而组合的IC50下降到23nM(图9)。药物联合指数(CI)计算为0.49，这表明CPT和HPPH之间具有高协同性。强大的协同作用可能是它们不同的细胞杀伤机制和CPT使得细胞易受由激光照射HPPH引起的低氧水平的综合结果。由于相对缓慢的释放，CPT-ss-HPPH NPs在没有激光照射时的体外细胞毒性(IC 50：4.9μM)显示出比任何单体药物低得多，并且非响应性CPT-cc-HPPH NPs显示非常低的体外细胞毒性(IC50>100μM)，表明二硫键在激活CPT-ss-HPPH治疗功效中的关键作用。用CPT-ss-HPPH NPs处理的细胞的激光照射显著增强细胞毒性，IC50从4.9μM降低至1.4μM。如果我们假设CPT-ss-HPPH的激光诱导的细胞毒性接近于CPT-cc-HPPH(IC50：34μM)，那么CPT-ss-HPPH中CPT和HPPH的CI将为0.33。

[0090] 实施例7：体外细胞摄取

[0091] 我们使用荧光显微镜研究HPPH NPs、CPT-ss-HPPH NPs和CPT-cc-HPPH NPs的体外细胞摄取。将5μM的每种制剂与HCT116细胞一起孵育24小时，并在荧光成像前在37℃下用Hoechst33342(Life Technologies，Carlsbad，CA)在细胞培养孵育器中染色0.5小时。然后在成像之前用Dulbecco's PBS洗涤细胞三次。选择DAPI通道用于检测Hoesse33342染色的细胞核，选择CY7.5通道收集来自HPPH、CPT-ss-HPPH和CPT-cc-HPPH的荧光。结果如图12所示，CPT-ss-HPPH NPs和CPT-cc-HPPH NPs均如HPPH NP那样有效地内化到细胞中。

[0092] 实施例8：放射性[64Cu]标记HPPH NPs和CPT-ss-HPPH NPs，以及它们在HCT116肿瘤的体内PET成像

[0093] CPT-ss-HPPH和HPPH分别以1.0mg/mL溶于DMSO中。然后，将0.1mL在50℃下温育，并与0.1mL在0.4M乙酸钠(pH＝5.6)缓冲液中的[64CuOAc]混合。将混合物溶液进一步温育5-7分钟，然后加入0.2mL PEG45-b-PLA28(DMSO中10mg/mL)。进一步搅拌30分钟后，将0.2mL水加入到混合物中，然后使用PBS作为洗脱液通过PD-10柱进行纯化。包括纯化的总标记程序花费了大约1小时。在静脉注射前，放射性标记的HPPH NPs和CPT-β-HPPH NPs与PEG45-b-PLA28的储备溶液混合，使聚合物获得的最终浓度约为10mg/mL，放射性为120-150μCi(4.44-5.55MBq)/100μL。

[0094] 通过皮下注射5×106HCT116细胞在PBS(100μL)中的悬浮液制备HCT116荷瘤裸鼠(7周龄，雌性)。当肿瘤大小达到500mm3时，将小鼠用于PET成像。示踪剂注射前，使用异氟烷/O 2(2％v/v)麻醉小鼠。上述PEG45-b-PLA28与64Cu标记的药物在PBS(100μL)中混合后静脉注射麻醉的小鼠(每只小鼠4.44-5.55MBq/120-150μCi)。在注射后的指定时间点，在Inveon DPET扫描仪上扫描小鼠。使用3D有序子集期望最大化算法重建PET图像而不校正衰减或散射。ASI Pro VMTM软件用于图像分析。感兴趣区域(ROI)使用IRW(西门子)绘制。注射后48小时处死上述小鼠。收集器官并称量湿重。在γ-计数器(Wallac Wizard 1480，PerkinElmer)上测量收集的器官和一系列标准溶液的64Cu放射性。转换器官的放射性以计算每克组织注射剂量的百分比(％ID/g)。

[0095] 如图13所示，与HPPH相比，在相应时间点在肿瘤中累积的CPT-ss-HPPH显著增加。经过衰变校正的PET图像的量化表明CPT-ss-HPPH的肿瘤积累在注射后24小时达到6.0±
0.6％ID/g并且在48小时时保持高达6.1±0.8％ID/g，而HPPH在48小时时仅为2.8±0.8％ID/g(图14)。基于对切除的器官进行γ计数的离体生物分布证实了CPT-ss-HPPH显着高于HPPH的肿瘤积累(图15)。由于HPPH和CPT-ss-HPPH的纳米载体尺寸相同，CPT-ss-HPPH相对于HPPH的显着更高的积聚归因于在血液循环期间CPT-ss-HPPH的过早释放少，因而在肿瘤中保留较高。需要注意的是，CPT-ss-HPPH的缓慢过早释放也预期会降低静脉内给药后的全身毒性。

[0096] 实施例9：体内治疗HCT116荷瘤小鼠

[0097] 通过皮下注射5×106HCT116细胞在PBS(100μL)中的悬浮液制备HCT116荷瘤裸鼠3
(7周龄，雌性)。当肿瘤在肿瘤接种后第10天(约60mm)时，小鼠开始用通过静脉内注射100μL药物或PBS，每4天一次总共2次(CPT剂量：3.0mg/kg，HPPH：5.5mg/kg，CPT-ss-HPPH：9.9mg/kg，CPT-cc-HPPH：9.6mg/kg)。在每次注射后2天，用200mW的671nm激光照射肿瘤10分钟。每2天监测肿瘤体积和小鼠体重。当任何尺寸的肿瘤接近2厘米或当小鼠体重损失超过20％时，使小鼠安乐死。使用以下公式分别计算每种肿瘤的体积：

[0098] 体积＝(长度*宽度2)/2

[0099] 使用GraphPad Prism 5(La Jolla，CA)分析结果。

[0100] 由于PET成像显示注射48小时后CPT-ss-HPPH的肿瘤积累最高，我们每隔4天给小鼠静脉内给予两剂，并且在每次注射后2天使用671nm激光照射肿瘤10分钟，在200毫瓦/平方厘米。如图16所示，用PBS或PBS+激光处理的小鼠的肿瘤快速生长，但用激光照射处理CPT-ss-HPPH NPs显著缩小了肿瘤体积。相反，CPT NPs和HPPH NPs都表现出有限的肿瘤生长抑制。此外，CPT-cc-HPPH相对于CPT-ss-HPPH的明显较差的肿瘤抑制清楚地证明了GSH可切割的二硫键的必要性。上述结果一致地表明，用CPT-ss-HPPH NPs处理的小鼠显示出比其他处理组最好的存活率(图17)。

[0101] 总之，我们设计了一种全新的GSH响应异二聚体多功能前药，可有效地装载到聚合物纳米载体中，并将两种协同药物共同递送至肿瘤，从而导致有利的肿瘤治疗。本发明所述的异二聚体多功能前药可以通过简单的反应来制备，并且以高负载能力和定量负载效率包封入生物相容性PEG-b-PLA中。值得注意的是，本发明中优选的前药CPT-ss-HPPH形成的纳米颗粒表现出比相应的负载单体药物的纳米颗粒药物释放慢10倍；其结构中的二硫键对于按需药物释放和保持有效的细胞毒性是必不可少的。此外，荧光性质和HPPH可直接进行放射性标记的能力允许我们通过荧光显微镜观察其体外细胞摄取药物，并通过PET成像研究其体内药物成像，证明了负载CPT-ss-HPPH的纳米颗粒显著改善了向肿瘤的药物递送。最后，本发明的CPT-ss-HPPH纳米颗粒通过联合化学疗法和光动力疗法显示出协同的肿瘤治疗功效。总体而言，我们的多功能前药结构为药物递送开辟了新的途径。