一种紫球藻的两步培养法

摘要

本发明公开了一种紫球藻的两步培养法。包括以下步骤：步骤一：将紫球藻高密度培养至稳定期；步骤二：将稳定期的藻液分为三部分：在一部分藻液中补充新鲜的微藻培养基后继续进行高密度培养；将一部分藻液进行胁迫培养生产胞外多糖；一部分藻液经藻液分离后得到藻泥和上清液，回收上清液并补充由于紫球藻生长而消耗的营养盐后作为微藻培养基进行循环利用培养紫球藻。本发明的方法可以实现连续、高效、低成本养殖紫球藻，同时获取“紫球藻胞外多糖”与“高藻红蛋白含量的紫球藻生物质”，并可用于户外规模化生产。

权利要求

1.一种紫球藻的两步培养法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：将紫球藻高密度培养至稳定期；步骤二：将稳定期的藻液分为三部分：在一部分藻液中补充新鲜的微藻培养基后继续进行高密度培养；将一部分藻液进行胁迫培养生产胞外多糖；一部分藻液经藻液分离后得到藻泥和上清液，回收上清液并补充由于紫球藻生长而消耗的营养盐后进行循环利用培养紫球藻；所述的微藻培养基：每升含有硝酸钠1.5g、磷酸二氢钾0.1g、三氯化铁5mg和碳酸氢钠5.0g，余量为海水。

2.根据权利要求1所述的紫球藻的两步培养法，其特征在于，所述的将紫球藻高密度培养至稳定期具体为：将紫球藻接种到微藻培养基中，连续鼓入含有二氧化碳的气体，在温度

15～30℃、自然光照条件下培养至稳定期。

3.根据权利要求2所述的紫球藻的两步培养法，其特征在于，所述的含有二氧化碳的气体中二氧化碳的浓度为1～5％。

4.根据权利要求1所述的紫球藻的两步培养法，其特征在于，所述的将一部分藻液进行胁迫培养生产胞外多糖具体为：将藻液导入光径为3cm的柱式光生物反应器中，在温度15～

30℃，光照强度100μmol photons/m2s条件下培养，至培养第6天，将光照强度提高至400μmol photons/m2s，诱导紫球藻分泌胞外多糖。

5.根据权利要求1所述的紫球藻的两步培养法，其特征在于，所述的将一部分藻液进行胁迫培养生产胞外多糖具体为：将藻液导入光径为4cm的平板式光生物反应器中，在温度15～30℃，日间平均光照强度大于10000lux条件下培养，诱导紫球藻分泌胞外多糖。

6.根据权利要求1所述的紫球藻的两步培养法，其特征在于，所述的将一部分藻液进行胁迫培养生产胞外多糖具体为：将藻液导入光径为3cm的柱式光生物反应器中，在温度15～

30℃，光照强度100μmol photons/m2s条件下培养，至培养第6天，经藻液分离后收集藻细胞重新悬浮于无氮的微藻培养基中，相同条件下继续培养，诱导紫球藻分泌胞外多糖；所述的无氮的微藻培养基：每升含有磷酸二氢钾0.1g、三氯化铁5mg和碳酸氢钠5.0g，余量为海水。

说明书

一种紫球藻的两步培养法

技术领域：

[0001] 本发明属于海洋微生物技术领域，具体涉及一种紫球藻的两步培养法。背景技术：

[0002] 紫球藻(Porphyridium)是一种隶属于红藻门、红藻纲、红毛菜亚纲、紫球藻目、紫球藻科、紫球藻属的海洋单细胞藻类，它具有极强的环境适应性和快速繁殖能力，可以合成多种生物活性成分，在医药、化妆品、精细化工、食品、保健品等领域均展现出广阔的应用前景和巨大的市场空间。

[0003] 紫球藻细胞在生长过程中可以合成藻红蛋白、红藻多糖、多不饱和脂肪酸、胞外多糖等多种天然活性物质，其中，胞外多糖和藻红蛋白受到广泛关注。紫球藻胞外多糖是一种杂聚硫酸脂多糖，由木糖、半乳糖和葡萄糖等10种单糖组成，含有糖醛酸和硫酸根，平均分子量230万道尔顿，高温耐受性强，具有抗病毒、抗肿瘤、降血脂、抗辐射、抗菌等功效。藻红蛋白是一种水溶性色素蛋白，由脱辅基蛋白和开链四吡咯结构的色基通过硫醚键共价结合而成，是紫球藻细胞主要的捕光分子，藻红蛋白具有很强的着色力、抗氧化、清除自由基、抗过敏功能，可以用在饲料、食品和化妆品等行业，藻红蛋白作为荧光标记可用于临床医学诊断领域，藻红蛋白还是一种很好的光敏剂，可以用于肿瘤光动力治疗。

[0004] 目前国内外对紫球藻胞外多糖的研究主要集中在功效和化学结构方面，而对其分泌机理研究较少，目前普遍认为“紫球藻细胞进入生长稳定期后，向胞外分泌多糖并形成胶质鞘”，此处指的生长稳定期是一种比较模糊的状态，且在大多数情况下，紫球藻细胞进入生长稳定期后，只能分泌少量的胞外多糖，甚至长达1-2个月的培养才能产生0.2～0.6g/L的胞外多糖，该理论并不能很好的指导紫球藻胞外多糖的规模化生产，且大多数依据此理论的研究仍停留在实验室阶段。目前已公开的紫球藻相关专利中，未发现两步法生产“紫球藻胞外多糖”与“高藻红蛋白含量的紫球藻生物质”的专利技术，已公开的文献资料中，也未发现类似技术公开。

[0005] 从以下3个方面叙述现有技术的缺点：

[0006] 1)紫球藻胞外多糖的生产与高藻红蛋白含量的紫球藻生物质的生产不能同时兼顾。现有技术在培养紫球藻生产胞外多糖的同时，细胞分裂减慢或停止，细胞藻红蛋白含量会急剧降低，因此，无法获取高藻红蛋白含量的紫球藻生物质。相反，当利用较优条件培养紫球藻时，可以获得高藻红蛋白含量的紫球藻生物质，但此时紫球藻却分泌极少的胞外多糖或者不分泌胞外多糖。

[0007] 2)实验室用于生产紫球藻胞外多糖的技术不能用于户外规模化生产中。藻细胞进入稳定期后，细胞开始慢慢分泌一定量的胞外多糖，随着培养时间的延长，培养液中的多糖含量逐渐增加，经过1-2个月胞外多糖含量达到稳定，这种低效率的培养方式难以用于规模化生产。

[0008] 3)传统的一步法培养工艺中，培养基难以循环利用，造成原料浪费。发明内容：

[0009] 本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种紫球藻的两步培养法。可以实现连续、高效、低成本养殖紫球藻，同时获取“紫球藻胞外多糖”与“高藻红蛋白含量的紫球藻生物质”，并可用于户外规模化生产。

[0010] 一种紫球藻的两步培养法，包括以下步骤：步骤一：将紫球藻高密度培养至稳定期；步骤二：将稳定期的藻液分为三部分：在一部分藻液中补充新鲜的微藻培养基后继续进行高密度培养；将一部分藻液进行胁迫培养生产胞外多糖；一部分藻液经藻液分离后得到藻泥和上清液，回收上清液并补充由于紫球藻生长而消耗的营养盐后作为微藻培养基进行循环利用培养紫球藻。

[0011] 其中，步骤一：将紫球藻高密度培养至稳定期。该步骤的目的是使在紫球藻快速分裂，达到较高的细胞密度。培养条件包括：培养基种类、营养盐浓度、温度、光照，可在室内或室外培养。任何单一培养条件或者几种培养条件的组合，均需保证紫球藻细胞的比生长速率不低于0.1d-1，最高细胞密度不低于5×107个/毫升。

[0012] 其中，将稳定期的藻液分为三部分。一部分用于藻细胞的继续培养，一部分用于紫球藻胞外多糖的生产，一部分用于收获高藻红蛋白含量的紫球藻生物质(即藻泥)。三部分的比例不受限制，可以根据藻细胞密度和生产需求进行调整。

[0013] 其中，一部分藻液补充新鲜的微藻培养基，使细胞继续分裂生长。藻液中补充步骤一中所用新鲜的微藻培养基，或者补充回收上清液后补充营养盐的微藻培养基，其余培养条件与步骤一相同。

[0014] 其中，一部分藻液设置一定的诱导胁迫条件，使其分泌紫球藻胞外多糖。诱导条件包括：增加光照强度，利用较小光径的反应器培养，减少培养基中氮的浓度。

[0015] 其中，一部分藻液用于收获高藻红蛋白含量的紫球藻生物质(即藻泥)，培养基补充营养盐后循环利用。该收获方式可以为浓缩、离心、过滤、絮凝等。藻泥收集完成后，补充少量的氮元素、磷元素和铁元素，使之成为可以重复利用的培养基。

[0016] 所述的将紫球藻高密度培养至稳定期具体为：将紫球藻接种到微藻培养基中，连续鼓入含有二氧化碳的气体，在温度15-30℃、自然光照条件下培养至稳定期。

[0017] 优选，所述的微藻培养基：每升含有硝酸钠1.5g、磷酸二氢钾0.1g、三氯化铁5mg和碳酸氢钠5.0g，余量为海水。

[0018] 所述的含有二氧化碳的气体中二氧化碳的浓度优选为1～5％。

[0019] 所述的将一部分藻液进行胁迫培养生产胞外多糖具体为：将藻液导入光径为3cm的柱式光生物反应器中，在温度15～30℃，光照强度100μmol photons/m2s条件下培养，至培养第6天，将光照强度提高至400μmol photons/m2s，诱导紫球藻分泌胞外多糖。

[0020] 所述的将一部分藻液进行胁迫培养生产胞外多糖具体为：将藻液导入光径为4cm的平板式光生物反应器中，在温度15～30℃，日间平均光照强度大于10000lux条件下培养，诱导紫球藻分泌胞外多糖。

[0021] 所述的将一部分藻液进行胁迫培养生产胞外多糖具体为：将藻液导入光径为3cm2
的柱式光生物反应器中，在温度15～30℃，光照强度100μmol photons/ms条件下培养，至培养第6天，经藻液分离后收集藻细胞重新悬浮于无氮的微藻培养基中，相同条件下继续培养，诱导紫球藻分泌胞外多糖。

[0022] 所述的无氮的微藻培养基：每升含有磷酸二氢钾0.1g、三氯化铁5mg和碳酸氢钠5.0g，余量为海水。

[0023] 营养充足条件下，紫球藻细胞可以快速分裂，在非常短的时间内达到较高的细胞密度，细胞高密度是胞外多糖分泌的基础，同时，由于藻红蛋白是藻细胞光合作用的主要部件，生长状态较好的藻细胞内，藻红蛋白也处于较高水平。因此，本发明首先利用较优的培养条件，培养紫球藻，使其快速增殖，只有足够的细胞数量，才能保证第二步诱导过程中紫球藻胞外多糖的大量分泌，当达到稳定期后，将培养物分为三部分，第一部分留作藻种，添加新鲜的微藻培养基或循环利用培养基后可以继续培养，第二部分进行胁迫培养生产胞外多糖，第三部分采用合适方式收获藻细胞，获得含藻红蛋白的紫球藻生物质，回收此步骤的培养基添加一定营养盐后用于第一步紫球藻的高密度培养使用(流程见图1)。

[0024] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：

[0025] 1)本发明可以连续、高效、低成本的同步生产“紫球藻胞外多糖”与“高藻红蛋白含量的紫球藻生物质”。

[0026] 2)本发明可以完全利用自然光进行生产，整个培养工艺对能耗的需求极少，放大容易，非常适用于规模化生产。

[0027] 3)培养基可以部分循环利用，减少原料投入，降低对环境的污染。附图说明：

[0028] 图1是紫球藻两步培养法工艺流程。

[0029] 图2是培养桶-平板式光生物反应器两步培养法工艺流程图；其中，1为2000L户外开放式培养桶；2为用于保种的藻液；3为加入新鲜的微藻培养基继续培养的藻液；4为4.0cm光径平板式光生物反应器。具体实施方式：

[0030] 为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

[0031] 实施例1：

[0032] 1.紫球藻的户外高密度培养

[0033] 户外条件下，将紫球藻接种到装有微藻培养基的60L柱形培养容器中培养紫球藻(培养体积50L；微藻培养基的配方为：每升含有硝酸钠1.5g、磷酸二氢钾0.1g、三氯化铁5mg和碳酸氢钠5.0g，余量为海水)，初始接种量为OD750＝0.5，培养深度60cm，连续鼓入二氧化碳加富的压缩空气(压缩空气中的二氧化碳的浓度为1％)，通气量为5L/min，温度范围为15～30℃，自然光照(日间平均光照强度12000lux)条件下培养10天，紫球藻细胞的比生长速率为0.36d-1，最高细胞密度为3.1×108个/毫升，藻红蛋白含量为干重的8.0％，生物质浓度为0.85g/L。

[0034] 2.增加光强诱导紫球藻生产胞外多糖

[0035] 室内条件下，取部分步骤1高密度培养的紫球藻的藻液导入光径为3cm的柱式光生物反应器中，在温度25℃，光照强度100μmol photons/m2s条件下培养紫球藻，至培养第6天，将光照强度提高至400μmol photons/m2s，紫球藻胞外多糖开始快速积累，至培养第10天，胞外多糖含量达到0.48g/L。

[0036] 3.利用较小光径的反应器培养紫球藻生产胞外多糖

[0037] 户外条件下，将60L柱形培养容器培养的紫球藻的藻液导入光径为4cm的平板式光生物反应器中，在温度范围为15～30℃，日间平均光照强度18000lux条件下培养，紫球藻胞外多糖快速积累，至培养第10天，胞外多糖含量达到0.45g/L。

[0038] 4.减少氮浓度诱导紫球藻生产胞外多糖

[0039] 室内条件下，取部分步骤1高密度培养的紫球藻的藻液通过离心法收集藻细胞重新悬浮于新鲜的无氮的微藻培养基(无氮的微藻培养基的配方为：每升含有磷酸二氢钾0.1g、三氯化铁5mg和碳酸氢钠5.0g，余量为海水)中，在温度25℃，光照强度100μmol photons/m2s条件下继续培养，紫球藻胞外多糖快速积累，至培养第10天，胞外多糖含量达到0.30g/L。

[0040] 实施例2：两步培养法工艺的连续培养实例

[0041] 将紫球藻接种到装有1500L微藻培养基(微藻培养基的配方为：每升含有硝酸钠1.5g、磷酸二氢钾0.1g、三氯化铁5mg和碳酸氢钠5.0g，余量为海水)的2000L户外开放式培养桶中，初始接种量为OD750＝0.5，连续鼓入二氧化碳加富的压缩空气(压缩空气中的二氧化碳的浓度为1％)，通气量20L/min，在昼夜温度范围为15～30℃，日间平均光照强度
18000lux条件下培养，培养12天后藻细胞生长至稳定期，生物质浓度为1.0g/L；取1/3稳定期的藻液导入4.0cm光径平板式光生物反应器中，在昼夜温度范围为15～30℃，日间平均光照强度18000lux条件下培养，诱导紫球藻分泌胞外多糖，诱导12天后，胞外多糖含量达到
0.5g/L；取1/3稳定期的藻液通过高速离心机离心的方式收获含藻红蛋白的紫球藻生物质(即藻泥)，共收获湿藻泥2.1千克(折合干藻粉210克)，藻红蛋白含量达到干重的6.2％，回收上清液并补充由于紫球藻生长而消耗的营养盐后作为微藻培养基进行循环利用培养紫球藻；剩余1/3稳定期的藻液重新补充新鲜的微藻培养基(与上述的微藻培养基的配方相同)继续培养12天，重复上述步骤(见图2)。