一种促进脂肪干细胞增殖的方法

摘要

本发明公开了一种促进脂肪干细胞增殖的方法，包括如下步骤：(1)取皮下脂肪组织，PBS缓冲液冲洗，除去脂肪组织膜和血管并剪成1mm3大小碎块，酶消化，消化结束后加入完全培养基，离心、弃上清，细胞沉淀重悬于完全培养基，接种于培养瓶中，培养24h后换培养液除去未贴壁细胞，之后每3天换液，细胞融合后用0.25％胰酶和1mmol/L EDTA 37℃消化3～5min，完全培养基终止消化，1:2比例传代；(2)取传代细胞以1.5×104/cm2的密度接种于含有完全培养基的培养瓶中，培养48h后更换培养基为不完全培养基，同时加入假白榄烷型二萜类化合物继续培养24～72h。表泽漆萜A、表泽漆萜B和表泽漆萜F可以用作脂肪干细胞增殖促进剂，可以添加到DMEM培养基中制备成脂肪干细胞高增殖培养基。

权利要求

1.一种促进脂肪干细胞增殖的DMEM培养基，其特征在于：添加有假白榄烷型二萜类化合物，所述假白榄烷型二萜类化合物为表泽漆萜A或表泽漆萜B或表泽漆萜F。

说明书

一种促进脂肪干细胞增殖的方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物领域，涉及一种促进脂肪干细胞增殖的方法。

背景技术

[0002] 脂肪干细胞是脂肪组织中一类多能干细胞，其在体内外特定的条件下，可分化形成多种细胞类型，如脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、肌肉细胞等。由于脂肪干细胞易于分离，且可以在体外条件下大量扩增和长期稳定培养，因此，可以作为组织再生工程理想的细胞源。在细胞移植组织重建的过程中，需要为新组织的形成提供足够的细胞来源。但是，多数情况下，移植的细胞不能很好地存活和增殖，因此，找到合适的药物来促进移植的干细胞增殖对于提高干细胞移植治疗的效果至关重要。

发明内容

[0003] 本发明目的在于提供一种促进脂肪干细胞增殖的方法，以较快获得大量脂肪干细胞用于干细胞移植等手术治疗。

[0004] 上述目的通过如下技术方案实现：

[0005] 一种促进脂肪干细胞增殖的方法，包括如下步骤：

[0006] (1)脂肪干细胞的分离培养：取患者或健康志愿者皮下脂肪组织，PBS缓冲液冲洗2～3次，用眼科剪和眼科镊除去脂肪组织膜和血管并剪成1mm3大小的碎块，0.1％Ⅰ型胶原酶和0.25％胰酶37℃消化40min，期间搅拌4～5次，消化结束后加入完全培养基，1500r/min离心10min，弃上清去除悬浮的脂肪细胞及脂滴，细胞沉淀重悬于完全培养基，接种于培养瓶中，于37℃，5％CO2培养箱中培养，24h后换培养液除去未贴壁细胞，之后每3天换液，细胞融合后用0.25％胰酶和1mmol/LEDTA37℃消化3～5min，完全培养基终止消化，1:2比例传代；

[0007] (2)脂肪干细胞的诱导增殖：取传代细胞以1.5×104/cm2的密度接种于含有完全培养基的培养瓶中，37℃，5％CO2培养48h后，更换培养基为不完全培养基，同时加入假白榄烷型二萜类化合物继续培养24～72h。

[0008] 优选地，所述假白榄烷型二萜类化合物为表泽漆萜A或表泽漆萜B或表泽漆萜F。

[0009] 优选地，完全培养基为含10％胎牛血清的DMEM。

[0010] 优选地，不完全培养基为不含胎牛血清的DMEM。

[0011] 优选地，步骤(2)取第10～15代传代细胞用于诱导增殖。

[0012] 一种促进脂肪干细胞增殖的DMEM培养基，添加有假白榄烷型二萜类化合物，所述假白榄烷型二萜类化合物为表泽漆萜A或表泽漆萜B或表泽漆萜F。

[0013] 本发明提供的方法比常规培养方法具有更高的脂肪干细胞增殖率，有助于较快获得大量脂肪干细胞用于干细胞移植等手术治疗。

附图说明

[0014] 图1为各组脂肪干细胞增殖率(％)；

[0015] 图2为表泽漆萜A、表泽漆萜B、表泽漆萜F和泽漆萜F化学结构比较。

具体实施方式

[0016] 下面结合具体实施例介绍本发明的技术方案。下述实施例中未特别强调的实验材料均为常规实验材料，无特别要求，都是本领域技术人员容易获得的常规材料。

[0017] 一、实验材料

[0018] 表泽漆萜A、表泽漆萜B、表泽漆萜F和泽漆萜F根据文献方法自制，纯度大于98％。

[0019] DMEM培养基和胎牛血清购于Gibco公司。CCK-8试剂盒购于日本同仁。

[0020] 二、实验方法

[0021] 1、脂肪干细胞的分离培养

[0022] 取健康志愿者的皮下脂肪组织，PBS缓冲液冲洗3次，用眼科剪和眼科镊除去脂肪3
组织膜和血管并剪成1mm大小的碎块，0.1％Ⅰ型胶原酶和0.25％胰酶37℃消化40min，期间搅拌5次，消化结束后加入完全培养基(含10％胎牛血清的DMEM，下同)，1500r/min离心
10min，弃上清去除悬浮的脂肪细胞及脂滴，细胞沉淀重悬于完全培养基，接种于培养瓶中，于37℃，5％CO2培养箱中培养，24h后换培养液除去未贴壁细胞，之后每3天换液，细胞融合后用0.25％胰酶和1mmol/L EDTA37℃消化4min，完全培养基终止消化，1:2比例传代。

[0023] 2、脂肪干细胞的诱导增殖和计数

[0024] 取第12代细胞以1.5×104/cm2的密度接种于96孔培养板，培养于完全培养基中，37℃，5％CO2培养48h后，更换培养基为不完全培养基(不含胎牛血清的DMEM)，分组培养：

[0025] 表泽漆萜A组：在不完全培养基中添加终浓度为20μM表泽漆萜A；

[0026] 表泽漆萜B组：在不完全培养基中添加终浓度为20μM表泽漆萜B；

[0027] 表泽漆萜F组：在不完全培养基中添加终浓度为20μM表泽漆萜F；

[0028] 泽漆萜F组：在不完全培养基中添加终浓度为20μM泽漆萜F；

[0029] 对照组：仅仅为不完全培养基。

[0030] 培养48h后，每孔加入细胞计数试剂盒中的CCK-8溶液10μL，在细胞培养箱内继续孵育2h后，分别用酶标仪在450nm测定吸光度。每组实验重复3次。分别计算表泽漆萜A组、B组、F组和泽漆萜F组比对照组细胞浓度提高百分比作为表泽漆萜A组、B组、F组和泽漆萜F组的诱导增殖率(％)。

[0031] 3、统计方法

[0032] 数据处理采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，结果以均数±标准差表示，组间比较P＜0.05认为有统计学差异。

[0033] 三、实验结果

[0034] 表泽漆萜A组、B组、F组和泽漆萜F组的诱导增殖率分别为(72.7±4.8)％、(69.8±5.1)％、(74.3±5.5)％、(5.8±3.1)％，如图1所示。

[0035] 该结果表明，表泽漆萜A、表泽漆萜B和表泽漆萜F可以促进脂肪干细胞增殖，而同为假白榄烷型二萜类化合物的泽漆萜F对脂肪干细胞的增殖无明显促进作用。这可能与化学结构中部分取代基的构型有关。因此，表泽漆萜A、表泽漆萜B和表泽漆萜F可以用作脂肪干细胞增殖促进剂，可以添加到DMEM培养基中制备成脂肪干细胞高增殖培养基。

[0036] 上述具体实施例仅用于解释本发明的技术方案，本领域技术人员应当明白，本发明的保护范围并不受限于上述具体实施例。