威灵仙在分离制备5-羟甲基糠醛中的应用

摘要

本发明公开了一种威灵仙在分离制备5‑羟甲基糠醛中的应用，该应用包括以下步骤：威灵仙用酸性溶液进行提取，浓缩后离心冻干得到粗提取物；将粗提取物加甲醇溶液溶解离心，取上清液浓缩，加水溶解得含有5‑羟甲基糠醛的粗提取液；将粗提取液采用大孔树脂进行吸附，经过洗脱再采用高效液相色谱检测，合并洗脱液并浓缩，获得富集物；富集物采用半制备高效液相色谱进行制备并收集含有5‑羟甲基糠醛的流分，浓缩冻干即得5‑羟甲基糠醛。本发明将威灵仙通过酸溶液对威灵仙中的5‑羟甲基糠醛进行提取，采用大孔树脂分离方法结合高效液相色谱和半制备高效液相色谱的方法，实现了从威灵仙分离制备5‑HMF，该纯化方法简单易行，得到的纯品纯度高。

权利要求

1.威灵仙在分离制备5-羟甲基糠醛中的应用；所述应用的具体方法，包括如下步骤：

（1）以威灵仙为原料，在酸性溶液中进行提取，提取液过滤后浓缩、离心、冻干得到5-羟甲基糠醛的粗提取物；

（2）将步骤（1）中的粗提取物，加甲醇溶液溶解、离心，取上清液浓缩，加水溶液溶解，得含有5-羟甲基糠醛的粗提取液；

（3）将步骤（2）中的粗提取液，采用大孔树脂进行吸附，经过水洗脱后，再用乙醇溶液进行洗脱，合并洗脱液并浓缩，获得富集物；

（4）将步骤（3）所得的富集物采用半制备高效液相色谱进行制备并收集含有5-羟甲基糠醛的流分，浓缩，减压干燥，即得5-羟甲基糠醛；其中，步骤（4）所述的半制备高效液相色谱为反相色谱，色谱柱的填料为碳十八反相硅胶，柱长度为10-25 cm，柱内径为20-50 mm；

步骤（4）所述的半制备高效液相色谱的流动相为乙腈和水溶液按体积比为3-20 : 97-80混合或甲醇和水溶液按体积比3-20 : 97-80混合；检测波长为280-284 nm，柱温为25-35 ℃，进样量为1-10 mL，流速为3-5 mL/min。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（1）所述酸性溶液pH ≤ 2。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（1）所述威灵仙与酸性溶液的质量体积比为1:10-12g/mL。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（1）所述提取方法为超声提取法或者加热回流提取法，提取液浓缩后离心的转速为4000-12000 r/min。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（2）所述加甲醇溶液溶解、离心，取上清液浓缩并重复2-3次，粗提取物与甲醇溶液质量体积比为1:5-15 g/mL。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（3）所述的粗提取液先采用大孔树脂进行静态吸附，吸附后首先用水动态脱附，再用体积分数10%-20%的乙醇水溶液进行动态洗脱，将洗脱液进行高效液相色谱检测，合并洗脱液浓缩，获得大孔树脂富集物；步骤（3）所述的高效液相色谱为反相色谱，色谱柱选用Venusil XBP C18色谱柱；步骤（3）所述的高效液相色谱的流动相为乙腈和水溶液按体积比为3-20 : 97-80混合或甲醇和水溶液按体积比

3-20 : 97-80混合；色谱条件为等度洗脱，流速为0.8-1.2 mL/min，检测波长280-284 nm，柱温25-35 ℃，进样量为1-20 μL。

说明书

威灵仙在分离制备5-羟甲基糠醛中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于药物化学领域，具体涉及一种威灵仙在分离制备5-羟甲基糠醛中的应用。

背景技术

[0002] 5-羟甲基糠醛(5-HMF)，分子式为C6H6O3，纯品呈针状、暗黄色粉末或液体，具有吸湿性，易液化。5-HMF主要来源有两个途径：一是由氨基化合物(蛋白质和氨基酸)和还原糖类成分在一定的温度、湿度和pH值等条件下发生麦拉德反应而形成；二是由中药中的糖类成分在酸性环境中受热分解产生，甚至低温也能产生，且含量随着温度的升高而增加。

[0003] 有文献报道，一定剂量的5-HMF被人体吸收后，会对肝脏、心脏等器官产生不良影响，近年来也有文献报道，5-HMF对人体具有抗氧化、改变血液流变等有益的作用。因此，5-HMF可能是一个被人们忽视的活性成分。同时作为一种重要的化工原料，可参与不同类型的反应，合成很多化工产品，广泛用于国民经济的各个领域，因此被美国能源部视为十大生物基平台化学品。

[0004] 目前，5-HMF的制备通常是以糖为原料，通过催化剂的作用，在特定的条件下制备。在制备的过程中容易产生一系列的副反应，产生很多杂质。此方法大大影响了5-HMF的产率。

[0005] 近年来，中药板蓝根、当归、猫爪草、云木香等药材中都发现了5-HMF，何首乌、山茱萸等中药材经过炮制加热后也可以产生5-HMF。威灵仙中的化学成分复杂，包括三萜类、黄酮类、木脂素类、香豆素类、挥发油类、甾体类、生物碱类。中药威灵仙中检测到5-HMF也有过报道，史杜坡等在东北线莲化学成分研究，中草药第38卷第3期2007年3月，报道威灵仙中检测到5-HMF，但是该研究仅仅是检测到存在5-HMF，没有具体的含量测定和制备过程，并且该检测是经过醇提，用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取，反复硅胶柱分离，方法繁琐且产率低。此外，东北铁线莲只是威灵仙中的一种。按2015年版中国药典规定，威灵仙的基源包括三种，分别为毛茛科植物威灵仙Clematis chinensis Osbeck、棉团铁线莲Clematis 
hexapetala Pall.或东北铁线莲Clematis manshurica Rupr.等。文献报道的由于中药成分复杂，同科不同属，甚至是同属不同种的中药在化学成分组成方面都往往存在很大的差异，因此，同一成分在不同中药中的含量测定和分离制备方法在专属性方面都有着不同的要求。对于威灵仙来说，其药材基源的复杂性就为5-HMF成分的含量测定和分离制备带来这样的一个问题。

发明内容

[0006] 发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供威灵仙在分离制备5-羟甲基糠醛中的应用。本发明实现了从成分复杂的中药威灵仙中分离制备5-HMF，开辟了从威灵仙中制备5-HMF的新途径，并且制备方法简单、容易操作，得到的5-HMF纯度高。

[0007] 技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种威灵仙在分离制备5-羟甲基糠醛中的应用。

[0008] 所述威灵仙分离制备5-羟甲基糠醛的具体方法，包括如下步骤：

[0009] (1)以威灵仙为原料，在酸性溶液中进行提取，提取液过滤后浓缩、离心、冻干得到5-羟甲基糠醛的粗提取物；

[0010] (2)将步骤(1)中的粗提取物，加甲醇溶液溶解、离心，取上清液浓缩，加水溶液溶解，得含有5-羟甲基糠醛的粗提取液；

[0011] (3)将步骤(2)中的粗提取液，采用大孔树脂进行吸附，经过水洗脱后，再用乙醇溶液进行洗脱，合并洗脱液并浓缩，获得富集物；

[0012] (4)将步骤(3)所得的富集物采用半制备高效液相色谱进行制备并收集含有5-羟甲基糠醛的流分，浓缩，减压干燥，即得5-羟甲基糠醛。

[0013] 其中，步骤(1)所述威灵仙经过粉碎机粉碎后，过40-100目筛，再优选采用pH≤2的酸性溶液进行提取。

[0014] 步骤(1)所述提取液浓缩后离心的转速为4000-12000r/min。通过离心，除去不溶性杂质。

[0015] 步骤(1)所述威灵仙提取方法可为超声提取法、加热回流提取法等。

[0016] 步骤(1)所述威灵仙与酸性溶液的质量体积比为1:10-12g/mL。

[0017] 其中，步骤(2)所述加甲醇溶液溶解、离心，取上清液浓缩并重复2-3次，粗提取物与甲醇溶液质量体积比为1:5-15g/mL。

[0018] 其中，步骤(3)所述的粗提取液先采用大孔树脂进行静态吸附，吸附后首先用水动态脱附，再用体积分数10％-20％的乙醇水溶液进行动态洗脱，将洗脱液进行高效液相色谱检测，合并洗脱液浓缩，获得大孔树脂富集物。

[0019] 作为优选，所述的步骤(3)中的大孔吸附树脂为非极性或弱极性大孔树脂，大孔吸附树脂在使用之前须经过预处理，除去树脂中含有的分散剂、惰性溶剂，以减少杂质对制备过程的影响。

[0020] 进一步地，所述的步骤(3)中离心后的提取液装大孔树脂柱后，静态吸附一定时间，使目标物质吸附在大孔树脂中，然后用柱体积5-15倍量的水动态冲洗，除去大极性物质，然后用柱体积5-15倍量的体积分数10％-20％乙醇溶液动态洗脱。

[0021] 作为优选，所述的步骤(3)中的洗脱液应分别收集，采用高效液相色谱进行鉴定，合并并浓缩含有5-HMF的洗脱液，获得大孔树脂富集物。

[0022] 步骤(3)所述的高效液相色谱为反相色谱，色谱柱可选用Venusil XBP C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)。

[0023] 步骤(3)所述的高效液相色谱的流动相为乙腈和水溶液按体积比为3-20:97-80混合或甲醇和水溶液按体积比3-20:97-80混合；色谱条件为等度洗脱，流速为0.2-1mL/min，检测波长280-284nm，柱温25-35℃，进样量为1-20μL。作为优选，可以采用流动相为乙腈和体积分数0.5％醋酸水溶液按体积比为3-20:97-80混合或甲醇和体积分数0.5％醋酸水溶液按体积比3-20:97-80混合。

[0024] 其中，步骤(4)所述的半制备高效液相色谱为反相色谱，色谱柱的填料为碳十八反相硅胶，柱长度为10-25cm，柱内径为20-50mm。

[0025] 步骤(4)所述的半制备高效液相色谱的流动相为乙腈和水溶液按体积比为3-20:97-80混合或甲醇和水溶液按体积比3-20:97-80混合；检测波长为280-284nm，柱温为25-35℃，进样量为1-10mL，流速为3-5mL/min。作为优选，可以采用流动相为乙腈和体积分数
0.5％醋酸水溶液按体积比为3-20:97-80混合或甲醇和体积分数0.5％醋酸水溶液按体积比3-20:97-80混合。

[0026] 本发明中威灵仙是常用的中药，在炮制过程中会产生5-HMF，如果威灵仙采用有机溶剂如乙醇对5-羟甲基糠醛进行提取，由于乙醇属于弱极性物质，而5-羟甲基糠醛的极性比较大，该提取不仅效果差，并且方法繁琐且产率低，纯度低；而本发明发现5-羟甲基糠醛的提取含量与酸度密切相关，随着酸度增加，威灵仙中的5-HMF含量显著提高，同时随着酸度增加，威灵仙中的5-HMF纯度显著提高，易于纯化。所以本发明采用酸溶液对威灵仙中的5-羟甲基糠醛进行提取。

[0027] 有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

[0028] (1)本发明以中药威灵仙为原料，通过酸溶液对威灵仙中的5-羟甲基糠醛进行提取，采用大孔树脂分离方法结合高效液相色谱和半制备高效液相色谱的方法，实现了从成分复杂的中药中分离制备5-HMF，开辟了从威灵仙中制备5-HMF的新途径。

[0029] (2)本发明采用的实验方法简单，易操作，纯化方法简单易行，得到的纯品纯度高，可以得到纯度大于90％的5-HMF。

[0030] (3)本发明是通过大量提取试验、检测、制备试验得到的，通过对提取方法、检测、制备方法的筛选，流动相的选择，洗脱方法的选择，建立了威灵仙中5-羟甲基糠醛的分离制备方法，尤其是该方法操作简单，重复性好，稳定性好，结果真实可靠。

附图说明

[0031] 图1为本发明实施例1制备的5-HMF的HPLC检测图；

[0032] 图2为本发明实施例2制备的5-HMF的HPLC检测图；

[0033] 图3为本发明实施例3制备的5-HMF的HPLC检测图。

具体实施方式

[0034] 以下通过附图和实施例对本发明做进一步说明。

[0035] 仪器与试剂

[0036] Agilent 1100型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；电子天平(瑞安市安特称重设备有限公司)；数显恒温水浴锅(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)；调温电热器(上海苏达实验仪器有限公司)；台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；超声清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；JP-100A-2型高速多功能粉粹机(上海市久品工贸有限公司)；超纯水机(陶氏水处理设备工程有限公司)，索氏提取器(上海兰仪实业有限公司)；超声波器(常州市佑达超声波设备有限公司)，AS20005半制备液相色谱系统(江苏汉邦科技有限公司)，AB-8型大孔树脂、D-101型大孔树(天津波鸿树脂科技有限公司)。

[0037] 实施例1

[0038] 取经过粉碎机粉碎后过80目筛的威灵仙药材粉末10.00g，加入pH＝0.5的盐酸溶液100mL，通过索氏提取器100℃加热回流提取，每次90min，共提取2次，合并并浓缩提取液，8000r/min离心30min，冻干得5-羟甲基糠醛的粗提取物；

[0039] 取冻干提取物，按粗提取物与甲醇溶液质量体积比为1:10g/mL加甲醇溶液超声10min溶解，8000r/min离心20min，取上清液浓缩，浓缩物重复上述步骤2次，最终浓缩物加水溶液超声10min溶解，得到5-羟甲基糠醛的粗提取液；

[0040] 取预处理好的AB-8型大孔树脂装入层析柱中，柱体积为20mL，取步骤(2)中的得到的粗提取液上柱，使提取液液面刚好没过大孔树脂面，静态吸附30min，先用5倍柱体积100mL水动态洗脱，除去大极性杂质，然后用体积为5倍柱体积100mL的体积分数10％乙醇溶液洗脱，并分管收集洗脱液，然后用5倍柱体积的20％乙醇溶液洗脱，并分管收集洗脱液。将分管收集的洗脱液分别经高效液相色谱检测，合并并浓缩含有5-HMF洗脱液，得10mL大孔树脂富集物。

[0041] 其中，液相色谱的检测条件为：色谱柱为Venusil XBP C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，以乙腈-体积分数0.5％醋酸水溶液(V/V15:85)等度洗脱，流动相流速为1mL/min，进样量为10μL，柱温为25℃，检测波长为280nm。

[0042] 将大孔树脂富集物离心，转速为4200r/min离心30min，取上清液经半制备高效液相色谱制备，反相色谱，填料为碳十八反相硅胶，柱长为25cm，柱内径为20mm，检测波长为280nm，流速为5mL/min，进样量为5mL，柱温30℃，乙腈-体积分数0.5％醋酸水溶液(V/V 15:
85)等度洗脱，收集含有5-羟甲基糠醛的流分，浓缩，减压干燥，得到5-羟甲基糠醛30mg，5-羟甲基糠醛的色谱图如图1所示。

[0043] 图1结果表示，在pH＝0.5，料液比为1:10的情况下，提取90min，提取2次，采用大孔树脂进行分离并采用以上高效液相色谱检测条件，测得5-HMF的纯度为96％。

[0044] 本实施例威灵仙制备的5-羟甲基糠醛的电子轰击质谱数据为EI-MS(m/z)：126(M+)，97，81，69，53，41，39；1H-NMR(CDCl3，300MHz)W：9.59(1H，s，CHO)，7.23(1H，d，J＝3.5Hz)，6.53(1H，d，J＝3.5Hz)，4.68(2H，s，CH2O)；13C-NMR(CDCl3，75MHz)W：177.7，160.7，152.3，
122.9，110，51.9。

[0045] 实施例2

[0046] 取经过粉碎机粉碎后过40目筛的威灵仙药材粉末10.00g，加入pH＝1的盐酸溶液120mL，通过索氏提取器100℃加热回流提取，每次60min，共提取3次，合并并浓缩提取液，转速为4000r/min离心30min，冻干得粗提取物。

[0047] 取冻干提取物，按粗提取物与甲醇溶液质量体积比为1:15g/mL加甲醇溶液超声10min溶解，8000r/min离心20min，取上清液浓缩，浓缩物重复上述步骤3次，最终浓缩物加水溶液超声10min溶解，得到5-羟甲基糠醛的粗提取液；取预处理好的AB-8型大孔树脂装入层析柱中，柱体积为20mL，取步骤(2)中的得到的粗提取液上柱，使提取液液面刚好没过大孔树脂面，静态吸附60min，先用10倍柱体积200mL水动态洗脱，除去大极性杂质，然后用体积为10倍柱体积200mL的体积分数10％乙醇溶液洗脱，并分管收集洗脱液，然后用体积分数
10倍柱体积200mL 20％乙醇溶液洗脱，并分管收集洗脱液。将分管收集的洗脱液分别经高效液相色谱检测，合并并浓缩含有5-HMF洗脱液，得15mL大孔树脂富集物。

[0048] 其中，液相色谱的检测条件为：色谱柱为Venusil XBP C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，以甲醇-体积分数0.5％醋酸水溶液(V/V 10:90)等度洗脱，流动相流速为0.5mL/min，进样量为20μL，柱温为35℃，检测波长为282nm。

[0049] 将大孔树脂富集物离心，转速为12000r/min离心30min，取上清液经半制备高效液相色谱制备，反相色谱，填料为碳十八反相硅胶，柱长为10cm，柱内径为10mm，检测波长为282nm，流速为3mL/min，进样量为10mL，柱温30℃，甲醇-体积分数0.5％醋酸水溶液(V/V 
10:90)等度洗脱，收集含有5-羟甲基糠醛的流分，浓缩，减压干燥，得到5-羟甲基糠醛5mg，
5-羟甲基糠醛的色谱图如图2所示。

[0050] 图2结果表示，在pH＝1，料液比为1:12的情况下，提取60min，提取3次，采用大孔树脂进行分离并采用以上高效液相色谱检测条件，测得5-HMF的纯度为93％。

[0051] 实施例3

[0052] 取经过粉碎机粉碎后过100目筛的威灵仙药材粉末10.00g，加入pH＝2的盐酸溶液80mL，超声提取，每次120min，共提取1次，合并并浓缩提取液，转速为2000r/min离心30min，冻干得粗提取物；

[0053] 取冻干提取物，按粗提取物与甲醇溶液质量体积比为1:5g/mL加甲醇溶液超声10min溶解，8000r/min离心20min，取上清液浓缩，浓缩物重复上述步骤3次，最终浓缩物加水溶液超声10min溶解，得到5-羟甲基糠醛的粗提取液；取预处理好的D-101型大孔树脂装入层析柱中，柱体积为20mL，取步骤(2)中的得到的粗提取液上柱，使提取液液面刚好没过大孔树脂面，静态吸附45min，先用6倍柱体积120mL水动态洗脱，除去大极性杂质，然后用体积为6倍柱体积120mL的体积分数10％乙醇溶液洗脱，并分管收集洗脱液，然后用6倍柱体积
120mL体积分数20％乙醇溶液洗脱，并分管收集洗脱液。将分管收集的洗脱液分别经高效液相色谱检测，合并并浓缩含有5-HMF洗脱液，得10mL大孔树脂富集物。

[0054] 其中，液相色谱的检测条件为：色谱柱为Venusil XBP C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，以乙腈-体积分数0.5％醋酸水溶液(V/V 20:80)等度洗脱，流动相流速为0.8mL/min，进样量为15μL，柱温为30℃，检测波长为284nm。

[0055] 将大孔树脂富集物离心，转速为12000r/min离心30min，取上清液经半制备高效液相色谱制备，反相色谱，填料为碳十八反相硅胶，柱长25cm，柱内径为50mm，检测波长为284nm，流速为4mL/min，进样量为5mL，柱温30℃，乙腈-体积分数0.5％醋酸水溶液(V/V 20:
80)等度洗脱，收集含有5-羟甲基糠醛的流分，浓缩，减压干燥，得到5-羟甲基糠醛1mg，5-羟甲基糠醛的色谱图如图3所示。

[0056] 图3结果表示，在pH＝2，料液比为1:8的情况下，提取120min，提取1次，采用大孔树脂进行分离并采用以上高效液相色谱检测条件，测得5-HMF的纯度为90％。

[0057] 实施例4

[0058] 实施例4与实施1分离制备方法相同，不同之处在于液相色谱的检测条件为：色谱柱为Venusil XBP C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，以乙腈-水溶液(V/V3:97)等度洗脱，流动相流速为0.2mL/min，进样量为20μL，柱温为35℃，检测波长为280nm。

[0059] 半制备高效液相色谱制备，检测波长为280nm，流速为5mL/min，进样量为10mL，柱温35℃，乙腈-水溶液(V/V 3:80)等度洗脱。

[0060] 对比例1

[0061] 对比例1采用实施例1相同的分离制备方法，不同之处在于：步骤(1)中以威灵仙为原料，在盐酸溶液(pH＝4)中进行提取，提取液过滤后浓缩、离心、冻干得到5-羟甲基糠醛的粗提取物；最后得到5-羟甲基糠醛0.5mg，测得5-HMF的纯度为60％。

[0062] 对比例2

[0063] 对比例2采用实施例1相同的分离制备方法，不同之处在于：步骤(1)中以威灵仙为原料，在中性溶液(pH＝7)中进行提取，提取液过滤后浓缩、离心、冻干得到5-羟甲基糠醛的粗提取物；最后得到5-羟甲基糠醛0.1mg，测得5-HMF的纯度为60％。

[0064] 对比例3

[0065] 对比例3采用实施例1相同的分离制备方法，不同之处在于：步骤(1)中以威灵仙为原料，在pH＝8氢氧化钠溶液中进行提取，提取液过滤后浓缩、离心、冻干得到5-羟甲基糠醛的粗提取物；最后得到5-羟甲基糠醛0.05mg，测得5-HMF的纯度为50％。

[0066] 由对比例1、2和3可以看出，通过pH＝4、中性和碱性溶液进行提取，得到5-羟甲基糠醛的含量非常低，同时纯度也很低。