二芳基噻吩并嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种二芳基噻吩并嘧啶类HIV‑1逆转录酶抑制剂及其制备方法和应用。所述化合物具有式I的结构。本发明还涉及含有式I结构化合物的药物组合物。本发明还提供上述化合物以及含有一个或多个此类化合物的组合物在制备治疗和预防人免疫缺陷病毒(HIV)药物中的应用。

权利要求

1.一种二芳基噻吩并嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂，或其药学上可接受的盐，其特征在于，具有如下所示的结构：

2.如权利要求1所述的二芳基噻吩并嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤包括：以2,4-二氯噻吩并[3,2-d]嘧啶3为初始原料，首先在N,N-二甲基甲酰胺溶液中与4-羟基-3,5-二甲基苯甲醛发生亲核取代生成中间体5；然后中间5与氰甲基磷酸二乙酯发生wittig-honer反应得到关键中间体6，中间体6与2-氟-4-氨基苯腈发生布赫瓦尔德-哈特维希(Buchwald-Hartwig)偶联反应生成目标产物A5；

合成路线如下：

试剂及条件:(i)4-羟基-3,5-二甲基苯甲醛，N,N-二甲基甲酰胺，碳酸钾，室温；(ii)氰甲基磷酸二乙酯，叔丁醇钾，二氯甲烷，0℃；(iii)2-氟-4-氨基苯腈，醋酸钯，4,5-双(二苯基膦)-9,9-二甲基氧杂蒽，碳酸铯，90℃，二氧六环。

3.一种如权利要求1所述的二芳基噻吩并嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂在制备治疗和预防人免疫缺陷病毒(HIV)药物中的应用。

4.一种药物组合物，包含权利要求1所述二芳基噻吩并嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂和一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。

说明书

二芳基噻吩并嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂及其制备方法和

应用

技术领域

[0001] 本发明属于有机化合物合成与医药应用技术领域，具体涉及一种二芳基噻吩并嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 艾滋病(Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS)目前已经成为危害人类生命健康的重大传染性疾病，其主要病原体是人免疫缺陷病毒1型(Human Immunodeficiency Virus Type 1,HIV-1)。尽管高效抗逆转录疗法(Highly Active Antiretroviral Therapy,HAART)的实施显著的改善了艾滋病患者的生存质量，但是耐药问题、药物毒副作用以及长期服用药物的费用等问题，迫使研究者研发高效低毒的新型HIV-1抑制剂。HIV-1非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)具有高效低毒、特异性强的优点，是HAART疗法的重要组成部分。但由于其自身较低的水溶性和较差的透膜性导致其生物利用度低、口服剂量大，进而引起毒副作用和交叉耐药等问题。例如，依曲韦林(Etravirine)需要每日多次给药，且伴随着严重的皮肤过敏反应。利匹韦林(Rilpivirne)药代性质有所提高，但仍存在抑郁、失眠、急性呼吸窘迫综合征、头痛及皮疹等毒副作用，限制了其在临床上的广泛应用。

[0003]

[0004] RDEA003是Ardea Biosciences公司研发的一类新型稠环类NNRTIs，该化合物原研专利(WO 2008058285)报道其对HIV-1野生株、单突变株Y188L以及双突变株L100I/K103N的活性均小于10nM，对单突变株Y181C的活性介于10nM和100nM之间，表现出了较高的抗耐药性。为进一步提高RDEA003的抗耐药性与成药性，本发明对RDEA003进行结构修饰，以期改善化合物的理化性质，提高抗耐药性。

发明内容

[0005] 针对现有技术的不足，本发明提供了一种二芳基噻吩并嘧啶类衍生物的制备方法，本发明还提供上述化合物作为HIV-1逆转录酶抑制剂的活性筛选结果及其应用。

[0006] 本发明的技术方案如下：

[0007] 1.二芳基噻吩并嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂

[0008] 一种二芳基噻吩并嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂，或其药学上可接受的盐，具有通式I所示的结构：

[0009]

[0010] 其中，虚线代表A与B之间为双键、B与D之间为双键、A与B之间为单键或者B与D之间为单键之中的一种；

[0011] A为：S或者C(U)；

[0012] B为：S或者C(V)；

[0013] D为：S或者C(W)；

[0014] 并且A，B和D有且只有一个为S；

[0015] 其中U，V和W各自为独立的为：H，卤素，C1-C6烷基，C2-C6烯基，C3-C6环烷基，苯基，苄基，三氟甲基，氨基，羟基；

[0016] R为：CH3，CN或者CH＝CHCN；

[0017] X为：O或者NH；

[0018] R1，R2各自独立的为：H，氟，三氟甲基。

[0019] 根据本发明优选的，通式I中，

[0020] 虚线代表A与B之间为双键、B与D之间为双键、A与B之间为单键或者B与D之间为单键之中的一种；

[0021] A为：S或者C；

[0022] B为：S或者C；

[0023] D为：S或者C；

[0024] 并且A，B和D有且只有一个为S；

[0025] X为：O；

[0026] R为：CN或者CH＝CHCN；

[0027] R1，R2各自独立的为：H，氟，三氟甲基。

[0028] 根据本发明进一步优选的，二芳基噻吩并嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂是下列化合物之一：

[0029]

[0030]

[0031]

[0032] 本发明中所述的“药学上可接受的盐”是指在可靠的医药评价范围内，化合物的盐类适于与人或较低等动物的组织相接触而无不适当的毒性、刺激及过敏反应等，具有相当合理的收益与风险比例，通常是水或油可溶的或可分散的，并可有效地用于其预期的用途。包括药学上可接受的酸加成盐和药学上可接受的碱加成盐，在这里是可做预期的用途并与式I化合物的化学性质相容的。适宜的盐的列表参见S.M.Birge等，J.Pharm.Sci.,1977,66,
1-19页。

[0033] 2.二芳基噻吩并嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂的制备方法

[0034] 二芳基噻吩并嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂的制备方法，步骤包括：以2,4-二氯取代的噻吩并嘧啶1为初始原料，首先在N,N-二甲基甲酰胺溶液中与取代苯酚或苯胺发生亲核取代生成中间体2；然后中间体2与氟原子或三氟甲基取代的对氰基苯胺发生布赫瓦尔德-哈特维希(Buchwald-Hartwig)偶联反应生成目标产物I；合成路线如下：

[0035]

[0036] 试剂及条件:(i)取代苯酚或苯胺，二甲基甲酰胺，碳酸钾，室温；(ii)氟原子或三氟甲基取代的对氰基苯胺，醋酸钯，4,5-双(二苯基膦)-9,9-二甲基氧杂蒽，碳酸铯，90℃，二氧六环。

[0037] A、B、D、X、R、R1、R2同上述通式I所示。

[0038] 所述的取代苯酚或苯胺为：均三甲基苯酚、2,6-二甲基-4-氰基苯酚、2,6-二甲基-4-(E)-氰基乙烯基苯酚、均三甲基苯胺、2,6-二甲基-4-氰基苯胺、2,6-二甲基-4-(E)-氰基乙烯基苯胺；

[0039] 所述的氟原子或三氟甲基取代的对氰基苯胺为：2-氟-4-氨基苯腈、3-氟-4-氨基苯腈、2,3-二氟-4-氨基苯腈、4-氨基-3-三氟甲基苯甲腈和4-氨基-2-三氟甲基苯甲腈。

[0040] 根据本发明优选的，噻吩并嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂的制备方法，具体步骤如下：

[0041] (1)以2,4-二氯噻吩并[3,2-d]嘧啶3为初始原料，首先在N,N-二甲基甲酰胺溶液中与4-羟基-3,5-二甲基苯腈发生亲核取代生成中间体4；然后中间体4与氟原子或三氟甲基取代的对氰基苯胺发生布赫瓦尔德-哈特维希(Buchwald-Hartwig)偶联反应生成目标产物；

[0042]

[0043] (2)以2,4-二氯噻吩并[3,2-d]嘧啶3为初始原料，首先在N,N-二甲基甲酰胺溶液中与4-羟基-3,5-二甲基苯甲醛发生亲核取代生成中间体5；然后中间5与氰甲基磷酸二乙酯发生wittig-honer反应得到关键中间体6，中间体6与氟原子或三氟甲基取代的对氰基苯胺发生布赫瓦尔德-哈特维希(Buchwald-Hartwig)偶联反应生成目标产物；

[0044]

[0045] (3)以2,4-二氯噻吩并[2,3-d]嘧啶7为初始原料，首先在N,N-二甲基甲酰胺溶液中与4-羟基-3,5-二甲基苯腈发生亲核取代生成中间体8；然后中间体8与氟原子或三氟甲基取代的对氰基苯胺发生布赫瓦尔德-哈特维希(Buchwald-Hartwig)偶联反应生成目标产物；

[0046]

[0047] (4)以2,4-二氯噻吩并[2,3-d]嘧啶7为初始原料，首先在N,N-二甲基甲酰胺溶液中与4-羟基-3,5-二甲基苯甲醛发生亲核取代生成中间体9；然后中间9与氰甲基磷酸二乙酯发生wittig-honer反应得到关键中间体10，中间体10与氟原子或三氟甲基取代的对氰基苯胺发生布赫瓦尔德-哈特维希(Buchwald-Hartwig)偶联反应生成目标产物；

[0048]

[0049] R1、R2同上述通式I所示。

[0050] 3.二芳基噻吩并嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂抑制HIV逆转录酶的应用[0051] 本发明对按照上述方法合成的部分二芳基噻吩并嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂进行了细胞水平的抗HIV-1(IIIB)，双耐药突变株RES056(K103N/Y181C)的活性筛选，以奈韦拉平(NVP)和依曲韦林(ETV)为阳性对照。

[0052] 本发明的二芳基噻吩并嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂可作为非核苷类HIV-1抑制剂应用。具体地说，作为HIV-1抑制剂用于制备抗艾滋病药物。

[0053] 一种抗HIV-1药物组合物，包括本发明的二芳基噻吩并嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂和一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。

[0054] 本发明提供了结构全新的吡啶并嘧啶类HIV-1逆转录酶抑制剂及其制备方法，本发明还提供了化合物抗HIV-1活性筛选结果及其在抗病毒领域中的首次应用。经过试验证明，本发明的吡啶并嘧啶类衍生物可作为HIV-1抑制剂应用并具有很高的应用价值。具体地说，作为HIV-1抑制剂用于制备抗艾滋病药物。

具体实施方式

[0055] 通过下述实施例有助于理解本发明，但是不能限制本发明的内容。

[0056] 实施例1：4–((2-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基苄腈的制备[0057]

[0058] 称取4-羟基-3,5-二甲基苯腈(0.15g,1mmol)和碳酸钾(0.17g,1.2mmol)于5mL的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，室温搅拌15分钟，然后加入2,4-二氯噻吩并[3,2-d]嘧啶(0.21g,1mmol)继续室温搅拌2h(TLC检测反应完毕)。此时有大量的白色固体生成，慢慢地向其中加入25mL冰水，过滤，真空干燥箱干燥，得到白色固体即为化合物4-((2-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基苯腈，收率93.8％，熔点258-260℃。

[0059] 实施例2：4–((2-氯噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基苄腈的制备[0060]

[0061] 称取4-羟基-3,5-二甲基苯腈(0.15g,1mmol)和碳酸钾(0.17g,1.2mmol)于5mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，室温搅拌15分钟，然后加入2,4-二氯噻吩并[2,3-d]嘧啶(0.21g,1mmol)继续室温搅拌2h(TLC检测反应完毕)。此时有大量的白色固体生成，慢慢地向其中加入25mL冰水，过滤，真空干燥箱干燥，得到白色固体即为化合物4-((2-氯噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基苯腈，收率91.7％，熔点269-271℃。

[0062] 实施例3：(E)-3-(4–((2-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基苯基)丙烯腈的制备

[0063]

[0064] 称取4-羟基-3,5-二甲基苯甲醛(4.02g,26.7mmol)和碳酸钾(5.04g,36.6mmol)于150mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，室温搅拌15分钟，然后加入2,4-二氯噻吩并[3,2-d]嘧啶(5.0g,24.4mmol)继续室温搅拌1h(TLC检测反应完毕)。此时有大量的白色固体生成，慢慢地向其中加入250mL冰水，过滤，真空干燥箱干燥，然后在氯仿中重结晶得到白色固体即为化合物4-((2-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基苯甲醛14，收率
95.0％，熔点219-220℃。

[0065] 氰甲基磷酸二乙酯(0.4mL,2.4mmol)溶解到10mL的二氯甲烷中，冰浴条件下向此反应液中慢慢的加入叔丁醇钾(0.27g,2.4mmol)，冰浴搅拌30min。然后向此混合溶液中滴加溶于10mL二氯甲烷的4-((2-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基苯甲醛(0.5g,1.5mmol)溶液，冰浴2h后改问室温搅拌，10h后TLC检测反应完毕。过滤，水洗滤饼，干燥，然后在氯仿中重结晶得到关键中间体(E)-3-(4-((2-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基苯基)丙烯腈15，收率91.7％，熔点225-227℃。

[0066] 实施例4：(E)-3-(4–((2-氯噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基苯基)丙烯腈的制备

[0067]

[0068] 称取4-羟基-3,5-二甲基苯甲醛(4.02g,26.7mmol)和碳酸钾(5.04g,36.6mmol)于150mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，室温搅拌15分钟，然后加入2,4-二氯噻吩并[2,3-d]嘧啶(5.0g,24.4mmol)继续室温搅拌1h(TLC检测反应完毕)。此时有大量的白色固体生成，慢慢地向其中加入250mL冰水，过滤，真空干燥箱干燥，然后在氯仿中重结晶得到白色固体即为化合物4-((2-氯噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基苯甲醛14，收率
92.7％。

[0069] 氰甲基磷酸二乙酯(0.4mL,2.4mmol)溶解到10mL的二氯甲烷中，冰浴条件下向此反应液中慢慢的加入叔丁醇钾(0.27g,2.4mmol)，冰浴搅拌30min。然后向此混合溶液中滴加溶于10mL二氯甲烷的4-((2-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基苯甲醛(0.5g,1.5mmol)溶液，冰浴2h后改问室温搅拌，10h后TLC检测反应完毕。过滤，水洗滤饼，干燥，然后在氯仿中重结晶得到关键中间体(E)-3-(4-((2-氯噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基苯基)丙烯腈15，收率83.5％，熔点234-236℃。

[0070] 实施例5：化合物A1-A20的制备

[0071] 称取化合物4-((2-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基苯腈(1.0mmol)，氟原子或三氟甲基取代的对氰基苯胺(1.2mmol)，醋酸钯(0.02g,0.1mmol)，4,5-双(二苯基膦)-9,9-二甲基氧杂蒽(0.06g,0.1mmol)与碳酸铯(0.65g,2mmol)加入于15mL的二氧六环中，在氮气保护的条件下加热回流12小时。待反应冷却到室温以后，加硅藻土过滤，滤液蒸干。然后加入二氯甲烷溶解，饱和食盐水萃取(3×5mL)，分取有机层，用无水硫酸钠干燥。快速柱层析分离得到目标化合物，进而在乙酸乙酯-石油醚体系中重结晶得到目标化合物A1-A20。

[0072] 4-((2-((4-氰基-2-氟苯基)氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基苄腈(A1)

[0073]

[0074] 白色固体，收率46％，熔点282-283℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.52(s,1H,NH),8.42(d,J＝5.4Hz,1H,C6-thienopyrimidine-H),7.88(t,J＝8.4Hz,1H,C6-Ph’-H),7.79(s,
2H,C3,C5-Ph”-H),7.75(dd,J＝11.2,1.9Hz,1H,C3-Ph’-H),7.46(d,J＝5.4Hz,1H,C7-thienopyrimidine-H),7.38(dd,J＝8.5,1.9Hz,1H,C5-Ph’-H),2.14(s,6H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ165.20,162.73,157.28,153.79,153.32(JCF＝199Hz),138.57,133.62(JCF＝10Hz),133.24(2C),133.18(2C),129.06(JCF＝3Hz),123.92,122.51,119.58(JCF＝
23Hz),118.94,118.65(JCF＝2Hz),109.45,109.00,104.43(JCF＝9Hz),16.20(2C).ESI-MS:
m/z 416.5[M+1]+,433.5[M+NH4]+,438.4[M+Na]+.C22H14FN5OS(415.09).

[0075] 4-((2-((4-氰基-3-氟苯基)氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基苄腈(A2)

[0076]

[0077] 白色固体，收率59％，熔点297-299℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.41(s,1H,NH),8.46(d,J＝5.3Hz,1H,C6-thienopyrimidine-H),7.82(s,2H,C3,C5-Ph”-H),7.66(d,J＝
8.3Hz,1H,C5-Ph’-H),7.63–7.57(m,1H,C2-Ph’-H),7.53(d,J＝5.3Hz,1H,C7-thienopyrimidine-H),7.33(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H,C6-Ph’-H),2.15(s,6H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ165.09,164.89,162.76,162.39,156.95,153.31,147.64(JCF＝12Hz),
138.87,133.83,133.30(2C),133.15(2C),124.00,118.96,115.28(JCF＝2.5Hz),109.77,
109.06,104.50(JCF＝2.6Hz),16.17(2C).ESI-MS:m/z 416.5[M+1]+,433.6[M+NH4]+,438.4[M+Na]+.C22H14FN5OS(415.09).

[0078] 4-((4-(4-氰基-2,6-二甲基苯氧基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)氨基)-2,3-二氟苄腈(A3)

[0079]

[0080] 白色固体，收率51％，熔点290-292℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.90(s,1H,NH),8.44(d,J＝5.4Hz,1H,C6-thienopyrimidine-H),7.77(s,2H,C3,C5-Ph”-H),7.68(ddd,J＝
8.9,7.0,1.7Hz,1H,C5-Ph’-H),7.48(d,J＝5.4Hz,1H,C7-thienopyrimidine-H),7.44(ddd,J＝8.8,6.8,1.9Hz,1H,C6-Ph’-H),2.13(s,6H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ165.13,
162.77,156.99,153.26,140.19,138.78,133.21(2C),133.15(2C),128.08(JCF＝1Hz),
123.95,118.91,117.79,114.09,109.50(JCF＝6Hz),16.17(2C).ESI-MS:m/z 434.5[M+1]+,
456.4[M+Na]+.C22H13F2N5OS(433.08).

[0081] (E)-4-((4-(4-(2-氰基乙烯基)-2,6-二甲基苯氧基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)氨基)-3-氟苄腈(A4)

[0082]

[0083] 白色固体，收率60％，熔点278-280℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.50(s,1H,NH),8.40(d,J＝5.4Hz,1H,C6-thienopyrimidine-H),7.89(t,J＝8.4Hz,1H,C6-Ph’-H),7.73(dd,J＝11.2,1.9Hz,1H,C3-Ph’-H),7.67(d,J＝16.6Hz,1H,ArCH＝),7.55(s,2H,C3,C5-Ph”-H),7.45(d,J＝5.4Hz,1H,C7-thienopyrimidine-H),7.30(dd,J＝8.4,1.8Hz,1H,C5-Ph’-H),6.49(d,J＝16.7Hz,1H,＝CHCN),2.11(s,6H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ165.07,
163.15,157.35,151.68(JCF＝41Hz),150.37,138.40,133.70(JCF＝10Hz),132.28,131.87(2C),129.07(JCF＝2Hz),128.74(2C),123.89,122.46,119.54(JCF＝22Hz),118.67(JCF＝
2Hz),109.04,104.28(JCF＝9Hz),97.20,16.47(2C).ESI-MS:m/z 442.5[M+1]+,459.6[M+NH4]+.C24H16FN5OS(441.11).

[0084] (E)-4-((4-(4-(2-氰基乙烯基)-2,6-二甲基苯氧基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)氨基)-2-氟苄腈(A5)

[0085]

[0086] 白色固体，收率43％，熔点290-292℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.38(s,1H,NH),8.44(d,J＝5.3Hz,1H,C6-thienopyrimidine-H),7.71(d,J＝14.6Hz,1H,ArCH＝),7.64(d,J＝7.9Hz,1H,C5-Ph’-H),7.60(d,J＝8.3Hz,1H,C4-Ph’-H),7.58(s,2H,C3,C5-Ph”-H),7.53(d,J＝5.4Hz,1H,C7-thienopyrimidine-H),7.41–7.37(m,1H,C2-Ph’-H),6.49(d,J＝
16.7Hz,1H,＝CHCN),2.13(s,6H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ164.84,163.13,157.05,
151.62,150.41,147.72(JCF＝12Hz),138.58,133.80,132.44,131.72(2C),128.86(2C),
123.99,119.34,115.31(JCF＝32Hz),109.22,104.63(JCF＝25Hz),97.14,90.84(JCF＝
15Hz),16.46(2C).ESI-MS:m/z 422.6[M+1]+,459.6[M+NH4]+.C24H16FN5OS(441.11).[0087] (E)-4-((4-(4-(2-氰基乙烯基)-2,6-二甲基苯氧基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)氨基)-2,3-二氟苄腈(A6)

[0088]

[0089] 白色固体，收率48％，熔点283-285℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.88(s,1H,NH),8.42(d,J＝5.3Hz,1H,C6-thienopyrimidine-H),7.71(d,J＝7.0Hz,1H,C5-Ph’-H),7.66(d,J＝16.6Hz,1H,ArCH＝),7.54(s,2H,C3,C5-Ph”-H),7.47(d,J＝5.3Hz,1H,C7-thienopyrimidine-H),7.35(ddd,J＝8.9,6.8,1.8Hz,1H,C6-Ph’-H),6.48(d,J＝16.7Hz,
1H,＝CHCN),2.11(s,6H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ164.98,163.17,157.05,151.62,
150.33,138.59,135.94,132.29,131.83(2C),128.70(2C),128.04(JCF＝3Hz),123.91,
119.31,117.65,114.10(JCF＝3Hz),109.49,97.20,93.82(JCF＝12Hz),16.44(2C).ESI-MS:
m/z 460.5[M+1]+,477.4[M+NH4]+.C24H15F2N5OS(459.10).

[0090] 4-((2-((4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基苄腈(A7)

[0091]

[0092] 白色固体，收率52％，熔点289-291℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.42(s,1H,NH),8.46(d,J＝5.3Hz,1H,C6-thienopyrimidine-H),8.19(s,1H,C2-Ph’-H),8.01(d,J＝8.7Hz,
1H,C5-Ph’-H),7.88(d,J＝8.7Hz,1H,C6-Ph’-H),7.79(s,2H,C3,C5-Ph”-H),7.53(d,J＝
5.4Hz,1H,C7-thienopyrimidine-H),2.16(s,6H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ164.82,
162.74,156.95,153.14,145.60,138.85,136.32,133.29(2C),133.11(2C),124.01,
120.94,118.94,116.75,115.96(JCF＝2Hz),109.60(JCF＝3Hz),98.99(JCF＝2Hz),16.20(2C).ESI-MS:m/z 466.4[M+1]+,483.4[M+NH4]+.C23H14F3N5OS(465.09).

[0093] 4-((2-((4-氰基-2-(三氟甲基)苯基)氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基苄腈(A8)

[0094]

[0095] 白色固体，收率53％，熔点240-243℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.86(s,1H,NH),8.39(d,J＝5.3Hz,1H,C6-thienopyrimidine-H),8.18(d,J＝1.9Hz,1H,C3-Ph’-H),7.90(dd,J＝8.6,1.9Hz,1H,C5-Ph’-H),7.81(d,J＝8.6Hz,1H,C6-Ph’-H),7.73(s,2H,C3,C5-Ph”-H),7.40(d,J＝5.4Hz,1H,C7-thienopyrimidine-H),2.11(s,6H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ165.30,162.72,158.34,153.16,142.26,138.50,136.57,133.13(2C),133.04(2C),131.56(JCF＝5Hz),127.97,123.85,123.01(JCF＝30Hz),118.86,118.14,109.36,
108.87,107.10,16.12(2C).ESI-MS:m/z 466.4[M+1]+,483.5[M+NH4]+.C23H14F3N5OS(465.09).

[0096] (E)-4-((4-(4-(2-氰基乙烯基)-2,6-二甲基苯氧基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)氨基)-2-(三氟甲基)苄腈(A9)

[0097]

[0098] 白色固体，收率59％，熔点250-253℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.81(s,1H,NH),8.37(d,J＝5.4Hz,1H,C6-thienopyrimidine-H),8.16(s,1H,C2-Ph’-H),7.83(s,2H,C5,C6-Ph’-H),7.63(d,J＝16.7Hz,1H,ArCH＝),7.50(s,2H,C3,C5-Ph”-H),7.39(d,J＝5.4Hz,1H,C7-thienopyrimidine-H),6.47(d,J＝16.7Hz,1H,＝CHCN),2.09(s,6H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ165.14,163.14,158.33,151.53,150.27,142.29,138.33,136.58,132.19,
131.76(2C),131.54(JCF＝6Hz),128.62(2C),127.74,123.83,123.04(JCF＝30Hz),119.30,
118.19,108.97,106.89,97.20,16.39(2C).ESI-MS:m/z 492.4[M+1]+,509.4[M+NH4]+.C25H16F3N5OS(491.10).

[0099] (E)-4-((4-(4-(2-氰基乙烯基)-2,6-二甲基苯氧基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)氨基)-3-(三氟甲基)苄腈(A10)

[0100]

[0101] 白色固体，收率51％，熔点274-276℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.41(s,1H,NH),8.44(d,J＝5.3Hz,1H,C6-thienopyrimidine-H),8.23(d,J＝2.1Hz,1H,C3-Ph’-H),8.07(d,J＝8.8Hz,1H,C5-Ph’-H),7.83(d,J＝8.7Hz,1H,C6-Ph’-H),7.67(d,J＝16.7Hz,1H,ArCH＝),7.56(s,2H,C3,C5-Ph”-H),7.52(d,J＝5.3Hz,1H,C7-thienopyrimidine-H),6.49(d,J＝16.7Hz,1H,＝CHCN),2.13(s,6H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ164.62,163.12,157.03,
151.51,150.37,145.68,138.60,136.31,132.33(JCF＝25Hz),131.76(2C),128.85(2C),
124.37(JCF＝37Hz),120.86,119.32,116.77,116.11(JCF＝6Hz),109.66,98.87,97.18,
16.48(2C).ESI-MS:m/z 492.4[M+1]+,509.4[M+NH4]+.C25H16F3N5OS(491.10).[0102] 4-((2-((4-氰基-2-氟苯基)氨基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基苄腈(B1)

[0103]

[0104] 白色固体，收率62％，熔点251-254℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.70(s,1H,NH),7.78(s,2H,C3,C5-Ph”-H),7.77–7.72(m,2H,C4,C6-Ph’-H),7.62(d,J＝6.0Hz,1H,C7-thienopyrimidine-H),7.56(d,J＝5.9Hz,1H,C6-thienopyrimidine-H),7.34(dd,J＝8.5,
1.8Hz,1H,C5-Ph’-H),2.13(s,6H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ171.76,162.34,155.90,
153.62,151.45,133.15(4C),128.99(JCF＝3Hz),123.22,122.67,119.66(JCF＝24Hz),
118.98,118.70,118.58(JCF＝2Hz),112.57,109.25,104.78(JCF＝9Hz),16.25(2C).ESI-MS:m/z 416.5[M+1]+,433.6[M+NH4]+,438.4[M+Na]+.C22H14FN5OS(415.09).

[0105] 4-((2-((4-氰基-3-氟苯基)氨基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基苄腈(B2)

[0106]

[0107] 白色固体，收率48％，熔点272-274℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.54(s,1H,NH),7.82(s,2H,C3,C5-Ph”-H),7.66(d,J＝6.0Hz,1H,C7-thienopyrimidine-H),7.63(d,J＝
8.2Hz,1H,C5-Ph’-H),7.59(d,J＝5.9Hz,1H,C6-thienopyrimidine-H),7.45(d,J＝13.4Hz,
1H,C2-Ph’-H),7.26(d,J＝8.0Hz,1H,C6-Ph’-H),2.15(s,6H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ
171.68,162.35,155.51,153.58,147.26(JCF＝12Hz),133.88,133.28(2C),133.08(2C),
123.62,119.01,118.74,115.21(JCF＝9Hz),112.56,109.65,104.52(JCF＝26Hz),91.21(JCF＝15Hz),16.22(2C).ESI-MS:m/z 416.5[M+1]+,433.6[M+NH4]+.C22H14FN5OS(415.09).[0108] 4-((4-(4-氰基-2,6-二甲基苯氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)-2,3-二氟苄腈(B3)

[0109]

[0110] 白色固体，收率71％，熔点260-262℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.06(s,1H,NH),7.76(s,2H,C3,C5-Ph”-H),7.65(d,J＝5.9Hz,1H,C7-thienopyrimidine-H),7.58(d,J＝
5.9Hz,1H,C6-thienopyrimidine-H),7.55(d,J＝1.8Hz,1H,C5-Ph’-H),7.40(ddd,J＝8.8,
13
6.7,1.8Hz,1H,C6-Ph’-H),2.12(s,6H). C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ171.66,162.35,
155.60,153.54,135.49,133.11(4C),128.04(JCF＝4Hz),123.66,118.94(JCF＝24Hz),
118.70,117.89,114.02(JCF＝3Hz),112.89,109.31,16.23(2C).ESI-MS:m/z 434.4[M+1]+,
451.5[M+NH4]+.C22H13F2N5OS(433.08).

[0111] (E)-4-((4-(4-(2-氰基乙烯基)-2,6-二甲基苯氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)-3-氟苄腈(B4)

[0112]

[0113] 白色固体，收率46％，熔点261-262℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.67(s,1H,NH),7.76(d,J＝8.4Hz,1H,C6-Ph’-H),7.73(d,J＝1.5Hz,1H,C3-Ph’-H),7.71-7.69(m,1H,C7-thienopyrimidine-H),7.64(d,J＝16.7Hz,1H,ArCH＝),7.58(d,J＝5.9Hz,1H,C6-thienopyrimidine-H),7.55(s,2H,C3,C5-Ph”-H),7.24(dd,J＝8.6,1.8Hz,1H,C5-Ph’-H),
6.49(d,J＝16.7Hz,1H,＝CHCN),2.11(s,6H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ171.60,162.77,
155.95,153.79,152.00,151.32,150.39,133.32(JCF＝11Hz),132.08,131.73(2C),128.96(JCF＝2Hz),128.70(2C),123.01,122.51,119.56(JCF＝23Hz),118.75,118.59(JCF＝2Hz),
112.64,104.57(JCF＝10Hz),97.04,14.54(2C).ESI-MS:m/z 442.6[M+1]+,459.6[M+NH4]+.C24H16FN5OS(441.11).

[0114] (E)-4-((4-(4-(2-氰基乙烯基)-2,6-二甲基苯氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)-2-氟苄腈(B5)

[0115]

[0116] 白色固体，收率53％，熔点265-267℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.49(s,1H,NH),7.82-7.81(m,1H,C7-thienopyrimidine-H),7.71(d,J＝11.1Hz,1H,ArCH＝),7.66-7.65(m,1H,C2-Ph’-H),7.64-7.63(m,1H,C6-Ph’-H),7.60-7.58(m,1H,C6-thienopyrimidine-H),7.58(s,2H,C3,C5-Ph”-H),7.31(d,J＝8.9Hz,1H,C5-Ph’-H),6.48(d,J＝16.7Hz,1H,＝CHCN),2.12(s,6H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ171.43,162.77,155.63,151.89,150.49,
147.34(JCF＝12Hz),133.86,133.27(JCF＝20Hz),132.32,131.61(2C),128.86(2C),
123.42,118.83,115.23(JCF＝17Hz),112.70,104.66(JCF＝26Hz),97.01,91.16,16.22(2C).ESI-MS:m/z 442.6[M+1]+,459.6[M+NH4]+.C24H16FN5OS(441.11).

[0117] (E)-4-((4-(4-(2-氰基乙烯基)-2,6-二甲基苯氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)-2,3-二氟苄腈(B6)

[0118]

[0119] 白色固体，收率61％，熔点259-261℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.04(s,1H,NH),7.84-7.83(m,1H,C7-thienopyrimidine-H),7.67(d,J＝14.0Hz,1H),7.64(d,J＝3.2Hz,
1H),7.58(d,J＝6.0Hz,1H,C6-thienopyrimidine-H),7.54(s,2H,C3,C5-Ph”-H),7.28(ddd,J＝8.8,6.8,1.8Hz,1H),6.48(d,J＝16.7Hz,1H,＝CHCN),2.10(s,6H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ171.50,162.78,155.67,151.93,150.38,132.11,131.69(2C),128.68(2C),
127.96(JCF＝4Hz),123.48,119.33,118.76,117.73,114.04(JCF＝3Hz),112.96,97.06,
94.13(JCF＝12Hz),16.49(2C).ESI-MS:m/z 460.5[M+1]+,477.4[M+NH4]+.C24H15F2N5OS(459.10).

[0120] 4-((2-((4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)氨基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基苄腈(B7)

[0121]

[0122] 白色固体，收率50％，熔点296-298℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.53(s,1H,NH),8.08(s,1H,C2-Ph’-H),7.93(d,J＝9.0Hz,1H,C5-Ph’-H),7.86(d,J＝8.7Hz,1H,C6-Ph’-H),
7.79(s,2H,C3,C5-Ph”-H),7.67(d,J＝5.9Hz,1H,C7-thienopyrimidine-H),7.59(d,J＝
5.9Hz,1H,C6-thienopyrimidine-H),2.15(s,6H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ171.36,
162.34,155.53,153.40,145.22,136.34,133.25(2C),133.01(2C),132.08(JCF＝32Hz),
124.29,123.71,121.57,121.02,118.98(JCF＝15Hz),116.68,116.08(JCF＝5Hz),113.01,
109.42,99.28,16.26(2C).ESI-MS:m/z 466.3[M+1]+,483.4[M+NH4]+.C23H14F3N5OS(465.09).

[0123] 4-((2-((4-氰基-2-(三氟甲基)苯基)氨基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基苄腈(B8)

[0124]

[0125] 白色固体，收率63％，熔点244-246℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.13(s,1H,NH),8.18(d,J＝1.9Hz,1H,C3-Ph’-H),7.89(dd,J＝8.6,1.9Hz,1H,C5-Ph’-H),7.72(d,J＝8.5,
1H,C6-Ph’-H),7.70(s,2H,C3,C5-Ph”-H),7.57(d,J＝5.9Hz,1H,C7-thienopyrimidine-H),
7.52(d,J＝6.0Hz,1H,C6-thienopyrimidine-H),2.09(s,6H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ
171.88,162.28,157.19,153.43,141.90,136.54,133.25,133.00(2C),132.94(2C),
132.08,131.53(JCF＝5Hz),128.81,124.07(JCF＝30Hz),122.80,118.89(JCF＝24Hz),
118.06,112.39,109.09,107.65,16.15(2C).ESI-MS:m/z 466.4[M+1]+,483.4[M+NH4]+,
488.4[M+Na]+.C23H14F3N5OS(465.09).

[0126] (E)-4-((4-(4-(2-氰基乙烯基)-2,6-二甲基苯氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)-2-(三氟甲基)苄腈(B9)

[0127]

[0128] 白色固体，收率51％，熔点210-212℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.08(s,1H,NH),8.10(s,1H,C2-Ph’-H),7.91(dd,J＝8.6Hz,1H,C5-Ph’-H),7.82(d,J＝8.5,1H,C6-Ph’-H),
7.79(s,2H,C3,C5-Ph”-H),7.65(d,J＝6.0Hz,1H,C7-thienopyrimidine-H),7.61(d,J＝
16.4Hz,1H,ArCH＝),7.54(d,J＝6.0Hz,1H,C6-thienopyrimidine-H),6.44(d,J＝16.7Hz,
1H,＝CHCN),2.09(s,6H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ171.36,162.70,157.23,151.89,
149.58,141.36,136.53,133.21(JCF＝7Hz),131.95,131.58(2C),131.32(JCF＝4Hz),
128.58(2C),122.63,120.32,118.77,118.11,112.51(JCF＝12Hz),108.24,97.03,16.21(2C).ESI-MS:m/z 492.5[M+1]+,509.5[M+NH4]+.C25H16F3N5OS(491.10).

[0129] (E)-4-((4-(4-(2-氰基乙烯基)-2,6-二甲基苯氧基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)-3-(三氟甲基)苄腈(B10)

[0130]

[0131] 白色固体，收率54％，熔点208-210℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.07(s,1H,NH),7.79(d,J＝2.0Hz,1H,C3-Ph’-H),7.71(d,J＝9.3Hz,2H,C5,C6-Ph’-H),7.61(d,J＝16.7Hz,
1H,ArCH＝),7.55(d,J＝5.5Hz,1H,C7-thienopyrimidine-H),7.52(d,J＝6.0Hz,1H,C6-thienopyrimidine-H),7.47(s,2H,C3,C5-Ph”-H),6.45(d,J＝16.7Hz,1H,＝CHCN),2.08(s,
6H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ171.69,162.71,157.19,151.83,150.29,141.92,136.53,
133.00(JCF＝6Hz),131.94,131.58(2C),131.47(JCF＝5Hz),128.58(2C),122.63,119.32,
118.73,118.11,112.51(JCF＝12Hz),107.43,97.03,16.15(2C).ESI-MS:m/z 492.4[M+1]+,
509.5[M+NH4]+.C25H16F3N5OS(491.10).

[0132] 实施例6：目标化合物的体外抗HIV活性测试实验

[0133] 测试原理：

[0134] 化合物体外抗HIV活性筛选采用MTT法。MTT全称为溴化-3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四唑氮，可用于检测细胞的存活和生长。检测原理为：MTT可以与活的细胞内琥珀酸脱氢酶结合还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒沉积在细胞中，而死细胞并无此功能。二甲基亚砜可以溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪检测其在540nm下的吸光度(A)值可以间接的反映活细胞的数量。在一定的细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

[0135] 由于HIV感染的MT-4细胞在一定时间内(5-7天)会发生病变，因此向HIV感染的MT-4细胞悬浊液中加入适当浓度的待检测化合物溶液，经过一段时间(5-7天)的培养后，用MTT分析法测定MT-4细胞活力，得到保护50％细胞免于细胞病变的药物浓度EC50，同时得到目标化合物使50％未感染HIV的细胞发生病变的浓度CC50，计算出选择系数SI(SI＝CC50/EC50)。

[0136] 测试材料和方法：

[0137] (1)HIV-1(IIIB)、HIV-2(ROD)毒株、HIV-1双突变株RES056：由比利时鲁汶大学医学院Rega研究所提供。

[0138] (2)MT-4细胞：由比利时鲁汶大学医学院Rega研究院提供。

[0139] (3)MTT：购自美国Sigma公司。

[0140] (4)样品处理：样品临用前溶于DMSO配成适当浓度，并用双蒸水作5倍稀释，各5个稀释度。

[0141] (5)阳性对照药：奈韦拉平(NVP)和依曲韦林(ETV)。

[0142] (6)测试方法：样品稀释后加入到HIV感染MT-4细胞悬浊液中，经过一段时间后用MTT比色法测定细胞活力，用酶标仪中记录在540nm下的吸光度(A)值，计算出EC50，CC50以及SI。

[0143] (7)MTT比色法：加入样品溶液培养一段时间后，向每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL，继续培养若干小时后，弃染色液，并向每孔加入150μL DMSO，用酶标仪中测定540nm下的吸光度(A)值。

[0144] 实验方法：

[0145] 50μL含1×104MT-4细胞培养液加入96孔细胞培养板，加入20μL感染HIV-1(IIIB、单突变株或双突变株)或HIV-2(ROD)的MT-4细胞混悬液或者空白培养基，加入不同浓度的待测化合物或阳性对照药物溶液，每个浓度设3个复孔。细胞在5％CO2氛围，37℃下培养5天，向每孔加入20mL(5mg/mL)MTT溶液，继续培养2小时，然后加入DMSO，测定反应溶液在540nm处的吸收度，计算化合物不同浓度下的细胞增值率P％。同时设空白和阳性药物对照组，由此计算化合物保护50％的细胞免于HIV诱导的细胞病变所需浓度(EC50)，使50％未感染HIV的细胞发生病变的浓度(CC50)。选择指数的计算：SI＝CC50/EC50。

[0146] 按照上述实验方法对合成的部分吡啶并[3,2-d]嘧啶类衍生物进行了细胞水平的抗HIV-1(IIIB)以及双突变株RES056(K103N/Y181C)的活性筛选，活性结果如表1所示。

[0147] 表1.部分吡啶并嘧啶类类化合物抗HIV活性、毒性及选择指数

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[0150] 化合物活性数据(表1)表明，A2(EC50＝0.0067μM，SI>44643)、A4(EC50＝0.0063μM，SI＝34138)、A5(EC50＝0.0086μM，SI＝18041)、A6(EC50＝0.0089μM，SI＝11505)、B4(EC50＝0.0071μM，SI＝37090)和B5(EC50＝0.0076μM，SI＝34385)对HIV-1IIIB均具有极高的活性和选择指数。对双突变株RES056，A5(EC50＝0.0215μM，SI＝7216)是该系列中活性最好的，是EFV(EC50＝0.1869μM，SI>34)的8.7倍，ETV(EC50＝0.0379μM，SI>121)的1.7倍。此外，A2(EC50＝0.0501μM，SI>5995)、A7(EC50＝0.0215μM，SI＝4104)和B5(EC50＝0.0215μM，SI＝7868)对RES056均表现出了与ETV相当的活性。值得一提的是，该类化合物的细胞毒性普遍较低。