玉米气孔开放型钾离子吸收通道Zmk2-1分子及其应用

摘要

玉米气孔开放型钾离子吸收通道Zmk2‑1分子及其应用，本发明通过将玉米气孔开放型钾离子吸收通道Zmk2‑1基因转入水稻，获得了超表达水稻材料，该材料在高氮及高钾条件下气孔开度、光合速率及蒸腾速率较野生型显著增加，同时植株（关键功能叶）含氮量显著增加，并展现出良好的增产效果和应用前景。

权利要求

1.氨基酸序列如SEQ ID No.2 所示玉米气孔开放型钾离子吸收通道Zmk2-1分子在提高水稻氮素利用效率中的应用。

2.一种提高水稻氮素利用效率的方法，其特征在于将序列如 SEQ ID No.1所示玉米气孔开放型钾离子吸收通道Zmk2-1分子基因导入水稻中并表达的步骤。

说明书

玉米气孔开放型钾离子吸收通道Zmk2-1分子及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种玉米气孔开放型钾离子通道Zmk2-1 分子及其应用。

背景技术

[0002] 水稻是重要的粮食作物，对国家的粮食安全战略起着极其重要的作用(黄建晔等，2004)。 现有的水稻高产主要以氮素化肥的大量投入来保证，如水稻主产区太湖流域水稻生长季单季 施氮量最高达到366kg N hm-2(Wang et al.,2004)，年施氮量最高达520kg氮hm-2(李伟波 等，1997)，而我国稻田的氮肥利用效率仅在30％或以下(王光火等,2003)，高量氮肥投入虽 能一定程度的保证产量，但过多的氮肥投入会造成施肥后短期氮营养过量，而植物不能及时 利用(Dobermann et al.,2002；Wang et al.,2007)，一方面,会通过淋溶、挥发、反硝化、径流 等途径损失到环境中从而造成环境风险(Galloway et al.,2008；
刘丽颖等，2013；巨晓棠等， 2014)。另一方面，短时期内植物不能及时利用过量氮肥，造成氮素吸收利用率和农学利用率 降低(蔡贵信等，1995；张福锁等，2008)，氮肥利用与农学效应之间出现不同步现象，这些 将严重阻碍我国农业的可持续发展同时也不符合国家的粮食安全战略。

[0003] 针对水稻氮肥利用率低引发的能源浪费、环境污染及生产效率降低等系列问题，近年来 通过挖掘基因资源以改变水稻的遗传特性成为提高氮素利用效率的一条新途径。铵态氮和硝 态氮是土壤中存在的两大主要无机氮源，淹水条件下水稻吸收的硝态氮占总氮吸收量的 25％-40％(Kirk and Kronzucker et al.,2005)，水稻对硝态氮的吸收主要是通过硝酸根转运体 (Nitrate Transporter，NRT)介导的，对水稻中硝酸转运体生理生化机制的研究并不少见，但 是目前为止，仅仅OsNRT2.3b展现出较好的应用前景(Fan et al.,2016)。

[0004] 铵(NH4+)是水稻偏好的氮源(Kronzucker et al.,2001；Yang et al.,2015)，因此调控铵 转运体的功能曾被寄予厚望，研究试图从增强单个NH4+吸收基因(AMT)途径探讨提高水稻 氮素利用效率的方法，结果表明，这一分子调控设想，仅在NH4+供应不足情况下才有细微效 果(Hoque et al.,2006；Ranathunge et al.,2014)，这一特征与我国当前高量施肥的集约化生产模 式不匹配；另一方面的努力是通过增强铵同化基因GS的活性促进NH4+的同化过程，以期获 得较高的氮同化效率并达到增产目的，结果发现超量表达水稻根部铵同化主效基因OsGS1；2 及地上部铵同化主效基因OsGS1；1的转基因水稻，其GS活性和叶片可溶性蛋白含量增加， 整个植株的总氨基酸和总氮含量增加，但籽粒产量和籽粒总氨基酸含量却降低(Cai et al., 2009)，同时超量表达GS1；1和GS1；2的转基因水稻，其植物生长和发育、产量均下降(Bao et al.,2014)。而超表达OsAMT1；3的水稻在低氮和高氮营养条件下均表现出生长受阻的表型， 可能是由于铵的过量吸收打破了水稻体内的碳氮平衡(Bao et al.,2015)。由此可见，力求通 过改变水稻遗传形状来提高水稻氮素利用效率的设想，基因资源匮乏是重要的限制因素，多 角度多方位寻找提高水稻氮素利用效率且有较好应用前景的基因资源仍然为当前现状所需。

[0005] 植物中的钾离子通道主要有Shaker型、TPK型及Kir型三种类型。目前已从十几种植物 中克隆到三十多个Shaker型家族基因，基于已鉴定的多个植物Shaker型钾通道的序列相似性、 基因结构和功能特征，Pilot等将它们分成5个亚组：groupⅠ的典型代表是AKT1型钾通道， 主要存在于根中；groupⅡ的典型代表是KAT1型钾通道，主要存在于叶片尤其是保卫细胞 中；弱内向整流钾通道被归为第3组(groupⅢ)，分布广泛，在韧皮部中表达尤为丰富，单 独存在不产生电流，调控其它通道功能的Shaker型通道被归为第4组(groupⅣ)，主要存 在于根中；所有介导外向电流的植物Shaker型钾通道被归为第五组(group V)，在根、茎及 保卫细胞中均有存在(Pilot et al.,2003)。其中，水稻AKT1对盐胁迫敏感。通过超表达 OsAKT1能够提高水稻的抗渗透胁迫和抗干旱胁迫能力(Ahmad et al.,2016)；OsKAT1能提 高水稻细胞的钾含量，增加水稻耐盐胁迫的能力(Obata et al.，2007)。

[0006] 玉米气孔开放型钾离子吸收通道Zmk2-1属于KAT1型钾通道，主要定位在气孔保卫细 胞，通过在异源表达系统非洲爪蟾蛙卵中证明，该通道在高K+条件下运作吸收K+(Su et al., 2015)，很可能在调控气孔开度方面起重要作用。

发明内容

[0007] 解决的技术问题：本发明提供一种玉米气孔开放型钾离子吸收通道Zmk2-1分子及其应 用。

[0008] 技术方案：一种玉米气孔开放型钾离子吸收通道Zmk2-1分子，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

[0009] 编码上述玉米气孔开放型钾离子吸收通道Zmk2-1分子的基因。

[0010] 编码上述玉米气孔开放型钾离子吸收通道Zmk2-1分子的基因，序列如SEQ ID No.1所 示。

[0011] 含上述玉米气孔开放型钾离子吸收通道Zmk2-1分子基因的真核表达载体。

[0012] 真核表达载体，所述真核表达载体为将玉米Zmk2-1构建到单子叶植物超表达载体 pCambia1301-ubiquitin-NOS(简称pUN1301，由本实验室通过pCambia1301改造而来)中， 所得到的重组质粒pUN1301-Zmk2-1。

[0013] 上述玉米气孔开放型钾离子吸收通道Zmk2-1分子在控制水稻气孔开度、速率及蒸腾效 率方面的应用。

[0014] 一种提高水稻氮素利用效率的方法，所述方法将所述玉米气孔开放型钾离子吸收通道 Zmk2-1分子基因基因导入水稻中并表达的步骤。

[0015] 有益效果：本发明先从玉米郑丹958中克隆得到了Zmk2-1基因，通过在水稻中成功利 用这一基因，在高铵及高钾条件下通过提高水稻的气孔开度、光合速率及蒸腾效率，从而提 高水稻对氮的有效利用能力。本申请通过将玉米气孔开放型钾离子吸收通道Zmk2-1基因转 入水稻，获得了超表达水稻材料，该材料在高氮及高钾条件下气孔开度、光合速率及蒸腾速 率较野生型显著增加，同时植株(关键功能叶)含氮量显著增加，并展现出良好的增产效果 和应用前景。

附图说明

[0016] 图1为玉米Zmk2-1基因克隆图，其中A：M为marker,lane 1为玉米Zmk2-1的PCR结 果；B：M为Marker,lane 1-lane8为TA-Zmk2-1的PCR鉴定结果；

[0017] 图2是双元表达载体pCambia1301-ubiquitin-NOS(pUN1301)创制系列图，其中A:M为 marker,lane 1为NOS的PCR结果；B:M Marker,lane1为TA-NOS的双酶切结果；C：M为 Marker,lane1为pCambia1301–NOS的双酶切结果；D：M为Marker,lane1为ubiquitin启动 子PCR结果；E：M为Marker,lane1为TA-ubiquitin的双酶切结果；F:M1为1kb DNA ladder mraker,M2为DL2000DNAMarker,lane1为pUN1301的HindIII/BamHI的双酶切结果。

[0018] 图3是重组质粒pUN1301-Zmk2-1的酶切鉴定结果图：M1为λHind-III DNA Marker， M2为250bp DNA ladder Marker,lane 1-lane2为pUN1301-Zmk2-1的BamHI/SmaI双酶切结果。

[0019] 图4是Zmk2-1转水稻材料的鉴定结果图，lane 1是中花11野生型对照(负对照)，lane 2-lane8分别是转Zmk2-1水稻株系6,8,15,16,20,21,30,lane 9是pUN1301-Zmk2-1重组质粒对 照(正对照，)M为DL2000DNA Marker。

[0020] 图5是水培条件下转Zmk2-1株系在不同供铵及供K+条件下的气孔开度、光合速率和蒸 腾速率图。Line 15表示获得的转Zmk2-1水稻株系15,line 16表示获得的转Zmk2-1水稻株系 16，WT表示中花11野生型。

[0021] 图6是水培条件下转Zmk2-1水稻株系在不同供铵及供K+条件下的氮钾元素积累量图。

[0022] 图7是小区实验不同肥力条件下转Zmk2-1水稻株系的孔开度、光合速率和蒸腾速率图。

[0023] LN表示小区实验中的低氮，HN表示小区实验中的高氮；LK表示小区实验中的低钾， HK表示小区实验中的高钾。

[0024] 图8是小区实验不同肥力条件下转Zmk2-1水稻株系的剑叶含氮量图。

[0025] 图9是小区实验不同肥力条件下转Zmk2-1水稻株系的总生物量及籽粒产量图。

[0026] 注：上述所有Marker均购自TAKARA公司。

具体实施方式

[0027] 实施例1玉米Zmk2-1基因的克隆

[0028] 提取水培生长10天的玉米郑丹958的总RNA并以其为模板，以Oligo(dT)18为引物反 转录，得到反转录产物cDNA。以此cDNA为模板，以特异引物Zmk2-1-BamHI-P1和 Zmk2-1-SmaI-P2进行PCR扩增。

[0029] 上游引物Zmk2-1-BamHI-P1：GGCGGATCCATGACTCAAGCTAATTCAAAGTC[0030] 下游引物Zmk2-1-SmaI-P2：GGCCCCGGGCTACATCTCAAGAAGGAATAGATG[0031] 基因全长PCR反应体系：

[0032]

[0033] 基因全长PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃ 延伸2min30sec，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。电泳检测，结果得到约2.2kb 左右的单一产物(图1-A)。

[0034] PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，于紫外照射下，割下含有目的条带的凝胶块，用胶回 收试剂盒(MACHEREY-NAGEL,T40609.250)回收目的片段。将此回收的目的条带与pMD19-T Simple Vector连接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α。随机挑取8个单克隆TA-Zmk2-1/DH5α(含重组质粒TA-Zmk2-1的DH5α菌)进行PCR鉴定。

[0035] 以TA-Zmk2-1/DH5α菌液为模板，以引物Zmk2-1-BamHI-P1和Zmk2-1-SmaI-P2进行PCR 扩增。

[0036] PCR反应体系

[0037]

[0038] PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸 2min30sec，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。电泳检测，结果得到约2.2kb左右的 单一产物(图1-B)，选取扩增出目的条带的克隆送测序，目的基因测序结果大小为2178bp， 与已经报道的Zmk2-1(Su et al.,2015)序列完全一致。

[0039] Zmk2-1的cDNA序列(大小为2178bp)及其编码的蛋白质的氨基酸序列(大小为726aa) 如SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示。

[0040] 实施例2：转Zmk2-1基因水稻的制备

[0041] 1.水稻超表达载体pCambia1301-ubiquitin-NOS(pUN1301)的构建[0042] (1)重组质粒pCambia1301-NOS的构建

[0043] 以购买的双元表达载体pBI121质粒为模板，以特异引物NOS-SacI-P1和NOS-EcoRI-P2 进行PCR扩增克隆胭脂碱合酶(nopaline synthase，NOS)终止子基因。

[0044] 上游引物NOS-SacI-P1:GGCGAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTC

[0045] 下游引物NOS-EcoRI-P2:GGCGAATTCCCGATCTAGTAACATAGATG

[0046] NOS基因全长扩扩增PCR反应体系同实施例1，PCR反应程序：5℃预变性5min；95℃ 变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。 电泳检测，结果得到约265bp左右的单一产物(图2-A)。

[0047] PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，于紫外照射下，割下含有目的条带的凝胶块，用DNA 胶回收试剂盒(MACHEREY-NAGEL,T40609.250)回收目的片段。将此回收的目的条带与 pMD19-T Simple Vector连接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α。随机挑取单克隆TA-NOS/DH5α(含重组质粒TA-NOS的DH5α菌)培养，提取培养的重组菌的质粒，将得到的重组质粒用 SacI/EcoRI进行双酶切鉴定，将双酶切得到有条带大小分别为265bp和2692bp的克隆进行测 定(图2-B)，经测序验证所得的NOS基因序列100％正确。将NOS基因经SacI/EcoRI酶分 构建到pCambia1301(从Clotech公司购买,大小为11849bp)质粒，转化大肠杆菌感受态细胞 DH5α后，提取质粒并酶切(图2-C)鉴定。

[0048] 酶切体系如下：

[0049]

[0050] 结果表明已经成功获得重组质粒pCambia1301-NOS，大小为12204bp。

[0051] (2)重组质粒pCambia1301-ubiquitin-NOS的构建

[0052] 以购买的双元表达载体pUBi质粒为模板，以特异引物ubiquitin-HindIII-P1和ubiquitin- BanHI-P2进行PCR扩增泛素(ubiquitin)启动子。

[0053] 上游引物ubiquitin-HindIII-P1:GGCAAGCTTGCATGCCTGCAGTGCAGCGTG[0054] 下游引物ubiquitin-BanHI-P2:GGCGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGAAG[0055] Ubiquitin基因全长扩扩增PCR反应体系同实施例1，PCR反应程序：5℃预变性5min； 95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸2min30sec，30个循环；72℃延伸10min；4℃ 保存。电泳检测，结果得到约2kb左右的单一产物(图2-D)。

[0056] PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，于紫外照射下，割下含有目的条带的凝胶块，用DNA 胶回收试剂盒(MACHEREY-NAGEL,T40609.250)回收目的片段。将此回收的目的条带与 pMD19-T Simple Vector连接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α。随机挑取单克隆 TA-ubiquitin/DH5α(含重组质粒TA-ubiquitin的DH5α菌)培养，提取培养的重组菌的质粒， 将得到的重组质粒用HindIII/BamHI进行双酶切鉴定，将双酶切得到有条带大小分别为2kb 和2692bp的克隆进行测序(图2-E)，经测序验证所得的ubiquitin启动子序列100％正确。将 ubiquitin启动子经HindIII/BamHI酶分构建到上述实施例1(1)中pCambia1301-NOS质粒， 转化大肠杆菌感受态细胞DH5α后，提取质粒并用HindIII/BamHI酶切(图2-F)鉴定。

[0057] 酶切体系同实施例1，结果表明已经成功获得重组质粒pCambia1301-ubiquitin-NOS,简称 pUN1301，大小为14101bp。

[0058] 2.重组质粒pUN1301-Zmk2-1表达载体的构建

[0059] 将玉米Zmk2-1基因经BamHI/SmaI构建到pUN1301上，转化大肠杆菌感受态细胞 DH5α后，提取质粒并酶切(图3)鉴定。

[0060] 酶切体系如下：

[0061]

[0062] 结果表明已经成功获得重组质粒pUN1301-Zmk2-1。

[0063] 3.转Zmk2-1基因水稻的转化及培育

[0064] 采用根癌农杆菌介导法将构建的表达载体pUN1301-Zmk2-1转入水稻中花11品种。诱导 水稻成熟愈伤，将长到适度大小的愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液侵染5-10分钟，将愈伤 组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30-40分钟，愈伤组织置于共培养基上，28℃暗培养3天， 然后将愈伤转入含50mg/L潮霉素的选择培养基上进行筛选，挑取颜色亮黄的抗性愈伤移入 装有分化培养基的培养皿中，放入恒温培养箱分化成苗。再放入生根培养基中壮苗一到两周。

[0065] 4.转Zmk2-1水稻的鉴定

[0066] (1)水稻DNA的提取：TPS法

[0067] a取长约2cm的水稻叶片放入干净的研钵中，加入1mL TPS提取液研磨，用移液枪将 研磨充分的提取液转移到1.5mL的离心管中；

[0068] b放入75℃金属浴中20min；

[0069] c 12000rpm离心5min；

[0070] d取500μL上清液于另一离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒，混匀。静置10min；

[0071] e弃上清，加入1mL-20℃预冷的70％乙醇，洗涤一次。8500rpm，5min；

[0072] f弃上清，使沉淀干燥。加入50μL超纯水溶解DNA。

[0073] (2)PCR反应

[0074] 在PCR八联管中加入如下的20L反应体系：

[0075]

[0076] Zmk2-1转基因株系检测引物：

[0077] Zmk2-1-qF：5'-CGAAATTGGATGCCAGAAGTTTCCGG-3'

[0078] pUN1301-R：5'-GGCTTTACACTTTATGCTTCCGG-3'

[0079] PCR程序为：95℃,预变性5min；95℃，1min；60℃,1min,72℃,2min，30个循环； 72℃再延伸10min.

[0080] PCR产物的检测得到502bp的片段(图4)，最终选取line15及16两株表型较为一致的 株系进行研究。

[0081] 实施例3营养液培养条件下转Zmk2-1水稻氮素利用效率检测

[0082] (1)转Zmk2-1水稻气孔导度、光合速率及蒸腾速率检测

[0083] 将转Zmk2-1T3代纯系水稻材料在0.1、5mM NH4+及0.1、5mM K+的营养液中处理2周， 同时野生型中花11作为对照，采用LiCor-6400光合仪测定每株水稻的剑叶(每张叶片测定 叶尖、叶中及叶基三个部位)的气孔开度，光合速率及蒸腾速率。结果显示，在低铵(0.1mM + +NH4)及低钾(0.1mM K)条件下，超表达株系15及16的气孔开度、光合速率及蒸腾速率 与野生型相比没有显著差异，而在高铵(5mM NH4+)及高钾(5mM K+)条件下，超表达株 系的气孔开度、光合速率及蒸腾速率显著高于野生型(图5)，表明Zmk2-1能够促进水稻气孔 开放，且能够增强水稻的光合能力及蒸腾作用。

[0084] (2)转Zmk2-1水稻的氮素利用效率检测

[0085] 实施例3(1)中培养的水稻材料，测定完气孔开度、光合速率及蒸腾速率后，分别收获 转基因水稻及对照的根部和地上部样品，用去离子水洗净，称量鲜重，105℃杀青30min，65℃ 烘干至恒重；粉碎；称重；H2SO4-H2O2消化，用元素分析仪分别测定不同样品的含N量，计 算各样品的N积累量，结果显示，高铵及高钾处理两周后，转基因材料的N积累量较野生型 有显著提高(图6)。

[0086] 实施例4小区实验检验转Zmk2-1水稻的氮素利用效率

[0087] (1)将转Zmk2-1的水稻播种至低氮(LN,66.7kg纯N/hm2)、高氮(HN,300kg纯N /hm2)、低钾(LK,不另施钾肥，土壤基础有效钾)及高钾(HK,240kg K2O/hm2)四个肥力 水平小区中，在结实灌浆期测定剑叶的光合速率、气孔导度及蒸腾速率，同时采集剑叶进行 含N量测定，结果显示，高氮及高钾处理条件下，转Zmk2-1水稻line15及16的气孔开度、 光合速率及蒸腾速率显著高于野生型(图7)，同时高氮及高钾条件下转基因水稻的剑叶含 呈增加趋势(图8)。

[0088] (2)实施例3中的水稻，在成熟期将地上部齐地面割下，单株收获装至独立的网袋中， 晾干后进行生物量、籽粒产量的鉴定，结果显示，高铵及高钾条件下转Zmk2-1株系的总生 物量及籽粒产量(图9)均显著高于野生型。也就是说，Zmk2-1通过调控水稻的气孔开度， 增强了水稻的光合速率及蒸腾速率，光合效率的增强促进了光合产物的积累，蒸腾速率的提 高带动了氮钾养分向地上部的转移，促进了结实灌浆期关键功能叶剑叶氮的积累，利于其光 合作用时间的延长及碳水化合物的积累，并且这些优势最终体现在转Zmk2-1水稻的产量上。

[0089] 本发明并不局限于上述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征 或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。