一种快速检测淀粉类样品中自由基相对含量的方法

摘要

本发明涉及一种快速检测淀粉类样品中自由基相对含量的方法，属于化学检测以及化学分析技术领域。本发明的目的是配置一种新的可用于检测淀粉类样品自由基相对含量的化学发光溶液，并以此溶液为基础，建立一种可快速检测淀粉类样品中自由基相对含量的方法。本发明提供的溶液所需的luminol、Na2CO3、hemin价格较低、易于获得、无毒无害，且配制方法简单，操作方便；本发明提供的方法使用的仪器设备价格较低、操作方便，方法本身测定灵敏度较高，能够快速检测淀粉类样品自由基相对含量。

权利要求

1.一种用于检测淀粉类样品自由基相对含量的化学发光溶液，其特征在于，所述溶液的成分包含：鲁米诺、Na2CO3以及Hemin；

所述鲁米诺在整个溶液中的浓度为0.7mM；所述Na2CO3在整个溶液中的浓度为11.8mM；

所述Hemin在整个溶液中的浓度为3.835×10-5-5.75×10-5M。

2.如权利要求1所述的一种用于检测淀粉类样品自由基相对含量的化学发光溶液在化学分析、化学检测以及生物检测领域的应用。

3.一种快速检测淀粉类样品中自由基相对含量的方法，其特征在于，包含如下步骤：步骤一：配置Luminol-Hemin-Na2CO3化学发光溶液：将Luminol、Hemin、Na2CO3溶于水中，使得鲁米诺在整个溶液中的浓度为0.7mM，Na2CO3在整个溶液中的浓度为11.8mM，Hemin在整个溶液中的浓度为3.835×10-5-5.75×10-5M；

步骤二：将待检测的淀粉类样品中加入Luminol-Hemin-Na2CO3化学发光溶液中并进行化学发光检测；

步骤三：通过检测初始光强判断待检测的淀粉类样品中的自由基相对含量。

4.如权利要求3所述的一种快速检测淀粉类样品中自由基相对含量的方法，其特征在于，所述步骤一制得的Luminol-Hemin-Na2CO3化学发光溶液需避光静置存储至少1天后，再进行使用。

5.如权利要求3所述的一种快速检测淀粉类样品中自由基相对含量的方法，其特征在于，所述步骤三为在容器内加入Luminol-Hemin-Na2CO3化学发光溶液，并加入待测淀粉样品，混匀后置于化学发光仪的检测腔内进行化学发光检测，检测得到发光强度随时间的变化曲线中时间为0min时的发光强度即可认定为此样品的自由基相对含量。

6.如权利要求3所述的一种快速检测淀粉类样品中自由基相对含量的方法在在化学分析、化学检测以及生物检测领域的应用。

说明书

一种快速检测淀粉类样品中自由基相对含量的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种快速检测淀粉类样品中自由基相对含量的方法，属于化学检测以及化学分析技术领域。

背景技术

[0002] 自由基是具有未配对电子的分子、原子或离子，由于具有化学性质活泼、氧化能力强、半衰期短等特点，会产生氧化应激效应。而食品作为直接与消化道相接触的物质，是引起外源性氧化应激的主要风险源。已有研究表明不适当的加工方式或是过度加工会使食品本身产生大量的自由基，而过多摄入这种过度加工的食品会对机体的细胞层面造成负面影响，从而与机体的疾病、衰老相关。

[0003] 淀粉是一种易获得、廉价的生物高聚物，被广泛应用于食品、纺织等多个领域，被人类大量使用。但是，在淀粉加工成产品的过程中，高温高压均会使淀粉产生大量的自由基。我们需要对淀粉类产品中的自由基含量进行检测，从而反向监控淀粉制品在加工过程中是否存在过度加工等现象，降低淀粉制品中自由基含量。

[0004] 目前，可用于检测自由基的方法与技术有很多。其中，电化学法、毛细管电泳法抗干扰能力较弱，不适合复杂体系自由基的检测；分光光度法利用具有捕获自由基能力且捕获后吸光度值会发生变化的化学试剂进行检测，但灵敏度较低，专一性差；高效液相色谱法多与多种检测手段联用进行测定，但一般用于液相体系；而电子顺磁共振技术因为具有灵敏度较高、不破坏样品、测定快速等特点，现已广泛应用于生物大分子自由基的测定，被认为是现有的测试结果最为准确的检测自由基的手段。

[0005] 然而，大部分自由基在常温下极不稳定，一般的电子顺磁共振波谱仪无法检测，需引入硝酮类或亚硝基类等价格昂贵的自由基捕获剂对短寿命自由基进行捕获，且自由基捕获剂本身对光线、温度敏感，会给检测造成困难；此外，波谱仪对低于自由基浓度检测限的样品也无法测定；并且，由于水在X波段介电常数较大，会引起强烈的非磁共振吸收，降低仪器的灵敏度，甚至使得仪器无法测定，因此当谱仪在X波段工作时，需对含水样品采取更换特殊样品管等措施，由此增加了样品测定前处理的难度。

[0006] 淀粉类产品体系复杂，并且通常含水量较高，以上方法均不适用于检测淀粉类产品，因此，急需找到一种抗干扰能力强、灵敏度高、专一性强、不破坏样品、快速并且成本低、设备简单、操作方便的可用于检测淀粉类样品的方法

[0007] 化学发光技术也是一种间接测定自由基的常用方法，其原理是利用发光剂与自由基反应，生成激发态的中间物质，再从激发态返回基态，同时将能量以光辐射的形式释放出来，产生化学发光现象。化学发光法具有灵敏度高、设备简单、操作方便、样品用量少、分析速度快等特点，现多应用于评价某种自由基清除剂的抗氧化清除自由基的能力，而直接将化学发光光强与自由基含量相关联的研究较少。 以及Heide等人采用化学发光法研究了经过Co60辐射的食品物料的化学发光情况，但是其采用的方法仅能粗略判断特定样品是否经过辐射，并不能真实反映样品中自由基的含量(一般由EPR测定)，将样品中自由基含量与发光光强相关联。

[0008] 本发明尝试以现有的化学发光技术为出发点，找到一种适合淀粉类样品自由基相对含量测定的快速可靠的化学发光溶液以及测定方法，以弥补电子顺磁技术测定自由基的诸多局限，同时也评价了淀粉在真实水合过程中自由基释放的情况。

发明内容

[0009] 本发明的目的是配置一种新的可用于检测淀粉类样品中自由基相对含量的化学发光溶液，并以此溶液为基础，建立一种可快速检测淀粉类样品中自由基相对含量的方法。本发明提供的发光溶液所需的luminol、Na2CO3、hemin价格较低、易于获得、无毒无害，且配制方法简单，操作方便；本发明提供的方法使用的仪器设备价格较低、操作方便，方法本身测定灵敏度较高，能够快速检测淀粉类样品自由基相对含量。

[0010] 本发明的技术方案如下：

[0011] 本发明提供了一种用于检测淀粉类样品自由基相对含量的化学发光溶液，所述溶液的成分包含：鲁米诺、Na2CO3以及Hemin。

[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述鲁米诺在整个溶液中的浓度为0.7mM；所述-5Na2CO3在整个溶液中的浓度为11.8mM；所述Hemin在整个溶液中的浓度为3.835×10 -5.75×10-5M。

[0013] 在本发明的一种实施方式中，所述鲁米诺在整个溶液中的浓度为0.7mM；所述Na2CO3在整个溶液中的浓度为11.8mM；所述Hemin在整个溶液中的浓度为3.835×10-5M。

[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述化学发光溶液的pH为11。

[0015] 本发明提供了上述用于检测淀粉类样品自由基相对含量的化学发光溶液在化学分析、化学检测以及生物检测领域的应用。

[0016] 本发明提供了一种快速检测淀粉类样品中自由基相对含量的方法，包含如下步骤：

[0017] 步骤一：配置Luminol-Hemin-Na2CO3化学发光溶液；

[0018] 步骤二：将待检测的淀粉类样品中加入Luminol-Hemin-Na2CO3化学发光溶液中并进行化学发光检测；

[0019] 步骤三：通过检测初始光强判断待检测的淀粉类样品中的自由基相对含量。

[0020] 在本发明的一种实施方式中，所述步骤一为：将Luminol、Hemin、Na2CO3溶于水中，使得鲁米诺在整个溶液中的浓度为0.7mM，Na2CO3在整个溶液中的浓度为11.8mM，Hemin在整个溶液中的浓度为3.835×10-5-5.75×10-5M。

[0021] 在本发明的一种实施方式中，所述步骤一为：将Luminol、Hemin、Na2CO3溶于去离子水中，使得鲁米诺在整个溶液中的浓度为0.7mM，Na2CO3在整个溶液中的浓度为11.8mM，Hemin在整个溶液中的浓度为3.835×10-5M。

[0022] 在本发明的一种实施方式中，所述步骤一制得的Luminol-Hemin-Na2CO3化学发光溶液需避光静置存储至少1天后，再进行使用。

[0023] 在本发明的一种实施方式中，所述步骤一制得的Luminol-Hemin-Na2CO3化学发光溶液需避光静置存储1天，再进行使用。

[0024] 在本发明的一种实施方式中，所述步骤三为在容器内加入Luminol-Hemin-Na2CO3化学发光溶液，并加入待测淀粉样品，混匀后置于化学发光仪的检测腔内进行化学发光检测，检测得到发光强度随时间的变化曲线中时间为0min时的发光强度即可认定为此样品的自由基相对含量。

[0025] 在本发明的一种实施方式中，所述步骤三为于10mL具塞锥形瓶内加入5mL的Luminol-Hemin-Na2CO3化学发光溶液，并立即加入已过80目筛待测淀粉样品0.05g，加塞，漩涡震荡2s进行混匀，立即置于化学发光仪的检测腔暗室内进行化学发光检测，检测得到发光强度随时间的变化曲线，其中时间为0min时的发光强度(即初始发光强度)即可认定为此样品的自由基相对含量。

[0026] 本发明提供了上述快速检测淀粉类样品中自由基相对含量的方法在在化学分析、化学检测以及生物检测领域的应用。

[0027] 有益效果：

[0028] (1)本发明得到的化学发光溶液能大幅度增强淀粉样品化学发光测定过程中的发光强度，从而增强测定时样品之间的差异性，更真实反映淀粉样品中所含的自由基相对含量。

[0029] (2)本发明的化学发光溶液使用的Luminol、Hemin以及Na2CO3价格较低、易于获得、无毒无害，且配制方法简单，操作方便。

[0030] (3)本发明提供的检测方法灵敏度较高，准确度可达90％以上。

[0031] (4)本发明提供的检测方法测定时仅需极少量的待测淀粉样品(0.05g)就能进行，且即使是高水分含量(40％)的淀粉样品也能准确测定。

[0032] (5)本发明提供的检测方法使用仪器设备价格较低、操作方便快速。

附图说明

[0033] 图1为热处理后大米淀粉中的自由基信号。

[0034] 图2为水分含量4％的淀粉体系EPR信号强度与CL初始光强对比。

[0035] 图3为水分含量12％的淀粉体系EPR信号强度与CL初始光强对比。

[0036] 图4为水分含量20％的淀粉体系EPR信号强度与CL初始光强对比。

[0037] 图5为碳酸盐缓冲液水合淀粉的固有发光光强。

[0038] 图6为Luminol-Na2CO3溶液检测水合淀粉的发光光强。

[0039] 图7为Luminol-NaOH溶液检测水合淀粉的发光光强。

[0040] 图8为Luminol-Na2CO3/NaHCO3溶液检测水合淀粉的发光光强。

[0041] 图9为Hemin添加前后水合淀粉的化学发光光强对照。

[0042] 图10为无大米淀粉(空白)以及大米淀粉不同浓度Hemin化学发光初始光强。

[0043] 图11为Luminol-Hemin-Na2CO3水合淀粉化学发光初始光强随存放时间的曲线。

具体实施方式

[0044] 本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面以大米淀粉为例对本发明作进一步说明。

[0045] 材料与试剂

[0046] 大米淀粉购自江西金农生物科技有限公司，淀粉纯度大于95％。鲁米诺Luminol以及氯化高铁血红素Hemin均购自Sigma公司，其余试剂为分析纯。

[0047] 水分含量测定方法：

[0048] 采用国标直接干燥法(GB 5009.3-2016)测定。取洁净铝制扁形称量瓶，置于105℃烘箱中，瓶盖斜支于瓶边，加热1.0h，取出盖好，置干燥器内冷却0.5h，称量，并重复干燥至前后两次质量差不超过2mg，即为恒重。将混合均匀的淀粉称取2g试样(精确至0.0001g)，放入此称量瓶中，精密称量后，置于105℃烘箱中，瓶盖斜支于瓶边，干燥2h～4h后，盖好取出，放入干燥器内冷却0.5h后称量。然后再放入105℃烘箱中干燥1h左右，取出，放入干燥器内冷却0.5h后再称量。并重复以上操作至前后两次质量差不超过2mg，即为恒重。

[0049] 按下式进行计算：

[0050] X＝[(m1-m2)/(m1-m3)]×100％

[0051] 式中：X-试样中水分的含量,单位为克每百克(g/100g)；m1-称量瓶和试样的质量，位为克(g)；m2-称量瓶和试样干燥后的质量，位为克(g)；m3-称量瓶的质量，位为克(g)；100-单位换算系数。

[0052] 化学发光测定方法

[0053] 化学发光测定采用西安瑞万电致化学发光仪(检测波长350nm-650nm，检测最高灵敏度420nm)，化学发光仪器参数设置：检测方式为强度方式，采样速率10T/s，放大级数设为3，光电倍增管高压600V，测定采集时间设置为5min。

[0054] 测定方法为：于10mL具塞锥形瓶内加入5mL水合溶液或化学发光溶液进行化学发光测定，盖塞，漩涡震荡2s，立即测定，此测定结果为溶液空白本底光强。待溶液本底发光光强稳定后取出，立即加入已过80目筛的原淀粉或热处理淀粉样品0.05g，盖塞，漩涡震荡2s，立即测定，此测定结果为淀粉样品光强。

[0055] 电子顺磁共振测定方法

[0056] EPR测定采用EMXplus-10/12型电子顺磁共振仪(德国布鲁克公司)。

[0057] 测定方法为：准确称取原淀粉或热处理淀粉样品60.0mg±0.5mg于内径3mm的样品核磁管内，样品管置于谐振腔内。仪器的微波频率为9.85Hz，调试频率为100kHz。图谱在室温20℃下测定，中心磁场(Center Field)＝335mT，扫场宽度(Sweep Width)＝15mT，调制幅度(ModulateAmplitude)＝0.3mT，微波功率设定为20mW。

[0058] 测得谱图峰对峰高度比上样品质量即为EPR自由基信号强度(dy/g)。

[0059] 数据处理及分析

[0060] 应用Microsoft Office  2012软件以及OriginPro9SR1(OriginLb Corporation，USA)软件进行数据计算和图谱制作及分析。

[0061] 实施例1：大米淀粉水分含量调节

[0062] 称取一定质量的淀粉样品，均匀平铺于洗净烘干的不锈钢浅口托盘中，用喷壶称取一定质量的去离子水，均匀地向淀粉喷水，注意喷水力度，以免喷水导致淀粉粉末飞散到空气中，造成损失。喷水结束后，混合收集水合淀粉样品置于烧杯中，利用玻璃棒进行手动混合搅拌1min，以确保混合均匀。用水分含量测定方法测定水分调节后的大米淀粉样品水分含量，若测得水分含量低于或高于所需调节的水分含量，根据结果喷壶加入适量去离子水或大米淀粉，搅拌均匀。再进行水分测定，重复上述步骤直至水分含量达到所需调节的水分含量(4％、12％、20％)，冷冻保存。

[0063] 实施例2：大米淀粉热处理

[0064] 称取1g原大米淀粉或经过水分含量调节的淀粉于内径为1.2cm的敞口石英试管中，轻敲试管使淀粉粉末混合均匀且处于同一水平高度上。将装好淀粉样品的试管置于温度已调节至120℃的烘箱的同一位位置进行热处理，待热处理时间到既定时间后迅速取出置于干燥器中冷却30min至室温，取出密闭储存。

[0065] 用电子顺磁共振测定方法测定热处理后大米淀粉中的自由基信号。(图1为热处理后大米淀粉中的自由基信号)

[0066] (实施例1、2为模拟大米淀粉加工生产过程。)

[0067] 实施例3：制备Luminol-Hemin-Na2CO3化学发光溶液

[0068] 将Luminol、Hemin、Na2CO3溶于去离子水中，使得鲁米诺在整个溶液中的浓度为0.7mM，Na2CO3在整个溶液中的浓度为11.8mM，催化增敏剂Hemin在整个溶液中的浓度为-5
3.835×10 M，得到Luminol-Hemin-Na2CO3化学发光溶液。

[0069] 实施例4：检测不同水分含量大米淀粉自由基含量

[0070] 于10mL具塞锥形瓶内加入5mL的Luminol-Hemin-Na2CO3化学发光溶液，并立即加入已过80目筛待测淀粉样品0.05g，加塞，漩涡震荡2s，立即置于化学发光仪的检测腔暗室内进行化学发光检测，检测得到发光强度随时间的变化曲线，其中时间为0min时的发光强度(即初始发光强度)即可认定为此样品的自由基相对含量

[0071] 检测结果：EPR技术认为是测试结果最为准确的检测自由基的手段，不同水分含量淀粉样品EPR信号强度(自由基含量)与CL初始光强呈现一致的趋势。将EPR信号强度与CL水合初始光强进行相关性分析，水分含量分别为4％、12％、20％时，两者相关系数分别为0.994、0.964、0.970，均呈现显著相关性。图2、3、4分别为水分含量4％、12％、20％的淀粉体系EPR信号强度与CL初始光强对比。

[0072] 对比例1：大米淀粉水合处理

[0073] 采用去离子水、pH值为7.2的磷酸盐缓冲液(0.2M)以及pH为10.83的碳酸盐缓冲液(0.1M)对经烘箱120℃处理1h的淀粉进行水合，测定其固有水合发光光强。

[0074] 检测结果：采用去离子水以及磷酸盐缓冲液水合光强热处理前后基本没有差别，光强在0-1之间；采用碳酸盐缓冲液处理未经处理原淀粉光强为2-0之间，而处理120℃-1h淀粉光强在2-3之间。

[0075] 由对比例1可知：淀粉一经水合就会产生固有发光现象，且在随后的2分钟内迅速衰减，但测得的总体发光强度都较低，仪器噪音较强，普通化学发光检测器难以检测。(图5为碳酸盐缓冲液水合淀粉的固有发光光强)

[0076] 对比例2：制备Luminol-Hemin-Na2CO3化学发光溶液

[0077] 将实施例2中浓度11.8mM的Na2CO3替换为浓度2.5mM的NaOH或者浓度0.1M的Na2CO3/NaHCO3溶液，分别制备Luminol-Na2CO3溶液、Luminol-NaOH溶液、Luminol-Na2CO3/NaHCO3溶液，并分别检测它们用于检测水合后大米淀粉的发光光强。

[0078] 检测结果：当pH相同时，只有碱环境为Na2CO3时，CL测得的初始光强为120℃-7h处理样品＞120℃-1h处理样品>未处理样品，符合图1EPR测得的自由基信号强度规律，而当碱环境为NaOH或Na2CO3/NaHCO3溶液时，初始光强并不符合此规律。

[0079] (图6为Luminol-Na2CO3溶液检测水合淀粉的发光光强、图7为Luminol-NaOH溶液检测水合淀粉的发光光强、图8为Luminol-Na2CO3/NaHCO3溶液检测水合淀粉的发光光强)对比例3：制备Luminol-Hemin-Na2CO3化学发光溶液

[0080] 将实施例2改为不引入Hemin。

[0081] 检测结果为：添加催化剂Hemin前后的化学发光光强随时间变化曲线类似，而添加了Hemin化学发光剂的淀粉发光强度(初始光强785.5±75.66)要显著高于未添加的化学发光剂(初始光强67.5±4.95)。

[0082] (图9为Hemin添加前后水合淀粉的化学发光光强对照)

[0083] 对比例4：制备Luminol-Hemin-Na2CO3化学发光溶液

[0084] 改变实施例3中Hemin浓度。

[0085] 检测结果为：如图10，在hemin7.67×10-7-1.975×10-5M浓度范围内，未处理样品的初始光强要始终高于烘箱120℃处理1h的初始光强，这正好与EPR测得的自由基信号强度-5 -5趋势相反，而当浓度在3.835×10 -5.7525×10 M范围内时，未处理样品的初始光强要低于烘箱120℃处理1h样品的初始光强，与自由基信号强度趋势一致。而当浓度为3.835×10-
5M时，这两种样品初始光强差异更大。

[0086] 因此，不同浓度的hemin会对空白或是样品测定得到的初始发光强度造成影响，只-5 -5有在浓度为3.835×10 -5.75×10 M范围内，120℃处理1h样品初始光强要大于未处理样品，与EPR测得的自由基信号强度相符。而当hemin浓度为3.835×10-5M时，120℃处理1h样品与未处理样品初始光强差距较大，此浓度更能凸显淀粉样品的差异性，且在浓度下测得的初始光强数值高、稳定性好。

[0087] (图10为无大米淀粉、水合大米淀粉(未处理淀粉、处理120℃-1h淀粉)不同浓度Hemin化学发光初始光强)

[0088] 对比例5：制备Luminol-Hemin-Na2CO3化学发光溶液

[0089] 改变实施例3中Luminol-Hemin-Na2CO3放置时间。

[0090] 检测结果为：新配置的发光剂水合初始光强要低于存储1天的发光剂，存储1天左右的发光剂水合初始光强呈现最高，且随着储存时间的延长，初始光强呈现下降的趋势，当存储3天后，初始光强下降趋势逐渐减弱后维持稳定。

[0091] (图11为Luminol-Hemin-Na2CO3水合淀粉化学发光初始光强随存放时间的曲线)[0092] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。