一种稀土-有机多孔材料及其制备方法和在神经疾病标记物谷氨酸检测中的应用

摘要

本发明涉及一种稀土‑有机多孔材料及其制备方法和在神经疾病标记物谷氨酸检测中的应用。采用的技术方案是：将Ln(NO3)3·6H2O、羟基对苯二甲酸和2‑氟苯甲酸溶解在有机溶剂、水和硝酸的混合溶液中；超声均匀后密封，置于110℃的烘箱中3天；自然冷却到室温，洗涤，过滤并干燥，得到稀土‑有机多孔材料。本发明所制备的稀土‑有机多孔材料对神经疾病标记物谷氨酸具有显著的荧光响应，把稀土发光作为內标，有机分子的发光作为检测信号，可实现谷氨酸的高选择性检测，进而该材料可用于神经疾病的早期预防和诊断。

权利要求

1.一种稀土-有机多孔材料，其特征在于：所述的稀土-有机多孔材料为三维晶态孔笼化合物，属于P4/mnc空间群，该多孔材料中稀土离子形成分立的六核稀土簇，六核稀土簇通过去质子化的羟基对苯二甲酸连接，该材料采用如下方法制得：将Ln(NO3)3·6H2O、羟基对苯二甲酸和2-氟苯甲酸分别溶解在有机溶剂中制成三种溶液，浓度均为0.01 mol/L，然后将上述三种溶液按体积比为1:1:8混合，再加入去离子水和硝酸得到混合溶液，混合溶液中有机溶剂、去离子水和硝酸的体积比为73:6:2；制得的混合溶液放入密闭容器中，在100℃ 120℃反应2 4天，自然冷却到室温，离心分离，清洗，过滤并~ ~干燥，得到稀土-有机多孔材料；

所述的Ln(NO3)3·6H2O为Eu(NO3)3·6H2O、Tb(NO3)3·6H2O或Gd(NO3)3·6H2O；

所述的羟基对苯二甲酸是2-羟基对苯二甲酸；

所述的有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺。

说明书

一种稀土-有机多孔材料及其制备方法和在神经疾病标记物

谷氨酸检测中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种稀土-有机多孔材料的制备方法及其应用，具体的说，涉及Ln3+(Ln＝Eu、Tb、Gd)和羟基对苯二甲酸构筑的稀土-有机多孔材料作为检测神经疾病标记物谷氨酸的荧光探针。

背景技术

[0002] 谷氨酸(glutamate，Glu)是一种重要的兴奋性神经递质，对中枢神经系统正常功能活动与神经调节发挥着重要作用。谷氨酸通过大量的“载体”进行自身的转运及信号传导，以完成机体的生理病理状态的调节，所以，其与许多疾病的发生有着密切的联系。谷氨酸浓度的升高表明一些神经病变，如急性缺血性中风、帕金森氏病、癫痫和阿尔茨海默病的可能发生，因此谷氨酸常常作为神经疾病的一种标记物。通过检测谷氨酸的浓度，进而监控和预防神经疾病的发生。传统的谷氨酸检测方法由于其操作复杂，仪器昂贵，检测费时等缺点而无法广泛应用。荧光检测的方法由于其快速准确、简单高效等优点而被广泛研究。荧光检测的另一巨大优势是能实现原位和实时的谷氨酸监控。稀土-有机多孔材料同时具备稀土离子和有机分子的特性，多孔材料内的功能性位点可以为特异性识别提供平台。引入特异性识别官能团羟基，可实现谷氨酸的选择性检测。多孔性有利于谷氨酸在探针中的富积和扩散，加强谷氨酸与探针的相互作用，进而提高检测的灵敏度。

发明内容

[0003] 本发明的目的在于提供一种稀土-有机多孔材料及其制备方法和在神经疾病标记物谷氨酸检测中的应用，该稀土-有机多孔材料对神经疾病标记物谷氨酸具有高选择性和高灵敏性，可作为荧光探针监测谷氨酸，实现神经疾病的早期监控和预防。

[0004] 为实现上述目的，本发明的用于神经疾病标记物谷氨酸检测的稀土-有机多孔材料为三维多孔化合物，该多孔材料属于P4/mnc空间群，多孔材料中稀土离子形成分立的六核稀土簇，六核稀土簇通过去质子化的羟基对苯二甲酸连接，其分子式为：(C26H30Ln3O22)·(G)x，式中Ln为Eu、Tb或Gd，G代表孔道内的溶剂，x为非定值，可通过热重分析和元素分析确定x的具体数值，有机分子中的羟基作为特异性识别官能团能选择性检测谷氨酸，多孔性有利于谷氨酸在多孔材料中的富积和扩散，加强谷氨酸与探针的相互作用，提高检测的灵敏度。

[0005] 本发明的用于神经疾病标记物谷氨酸荧光检测的稀土-有机多孔材料的制备方法，采用的是溶剂热法，具体步骤如下：

[0006] 将Ln(NO3)3·6H2O、羟基对苯二甲酸和2-氟苯甲酸分别溶解在有机溶剂中制成溶液，浓度均为0.01mol/L，然后按体积比为1:1:8混合，再加入去离子水和硝酸得到混合溶液，混合溶液中有机溶剂、去离子水和硝酸的体积比为73:6:2；制得的混合溶液放入密闭容器中，在100℃～120℃反应2～4天，自然冷却到室温，离心分离，清洗，过滤并干燥，得到目标多孔材料。

[0007] 本发明中，所述的Ln(NO3)3·6H2O为Eu(NO3)3·6H2O、Tb(NO3)3·6H2O或Gd(NO3)3·6H2O。

[0008] 本发明中，所述的羟基对苯二甲酸是(1)2-羟基对苯二甲酸或(2)2,5-二羟基对苯二甲酸或(3)2,3,5,6-四羟基对苯二甲酸或(4)2-羟基-[1,1'-联苯]-4,4'-二甲酸或(5)3-羟基-[1,1'-联苯]-4,4'-二甲酸或(6)2,2'-二羟基-[1,1'-联苯]-4,4'-二甲酸或(7)3,3'-二羟基-[1,1'-联苯]-4,4'-二甲酸或(8)2'-羟基-[1,1':4',1”-三联苯]-4,4”-二甲酸或(9)3,3”-二羟基-[1,1':4',1”-三联苯]-4,4”-二甲酸。

[0009] 本发明制备过程中，所用的有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二乙基乙酰胺、二甲基亚砜、乙腈、二氧六环、四氢呋喃中的任意一种或者几种按任意比的混合。

[0010] 本发明中，制备得到的稀土-有机多孔材料超声分散在溶液中，再加入神经疾病标记物谷氨酸的溶液，常温下搅拌均匀，进行荧光检测。

[0011] 本发明的有益效果在于：

[0012] 1、本发明的稀土-有机多孔材料的制备方法为溶剂热法，该合成方法工艺简单、条件温和，产率高达50％～65％。将反应原料溶解后混合，于100℃～120℃反应就可制备得到目标物质。使用的原料中没有有毒有害物质和催化剂，制备过程中也没有产生有毒有害物质。制得的多孔材料结构新颖，为三维孔笼化合物。该多孔材料隶属四方晶系，空间群为P4/mnc，晶胞参数为 α＝β＝γ＝90°，晶胞体积为 Z＝4，晶体密度Dc＝1.502gcm-3。该多孔材料是由六个稀土离子组成的六核簇和去质子化的羟基对苯二甲酸连接形成的三维无限网络结构，每个六核簇连接十二个去质子化的羟基对苯二甲酸，而每个去质子化的羟基对苯二甲酸则连接两个六核簇。

[0013] 2、本发明制备出的稀土-有机多孔材料是高度有序的孔笼材料，框架中含有两种孔笼，分别是四面体孔笼和八面体孔笼，其中四面体孔笼由六个去质子化的羟基对苯二甲酸和四个六核簇组成，八面体孔笼由十二个去质子化的羟基对苯二甲酸和六个六核簇围绕2 -1
而成，BET面积高达537.7mg 。

[0014] 3、本发明制备出的稀土-有机多孔材料由于其特殊的连接方式和高密度的金属离子，导致其具有很好的稳定性，该多孔材料能在各种有机溶剂、磷酸生理液和酸碱水溶液(pH＝1～13)等条件下，保证其能在复杂苛刻条件下进行使用和重复使用。热重分析表明该稀土有机框架材料能稳定到300℃以上。

[0015] 4、本发明制备出的稀土-有机多孔材料具有优异的发光性能。固态时(C26H30Eu3O22)·(G)x和(C26H30Tb3O22)·(G)x只发射稀土离子的荧光，(C26H30Gd3O22)·(G)x只发射有机分子的荧光，量子效率分别为14％、17％和14％；超声分散在溶液中后，(C26H30Eu3O22)·(G)x和(C26H30Tb3O22)·(G)x同时发射很强的稀土荧光和有机分子荧光，而(C26H30Gd3O22)·(G)x仍然只发射有机分子的荧光，量子效率分别为48％、58％和42％。该稀土-有机多孔材料还具有良好的光稳定性，紫外光持续照射下，三天内没有荧光衰减。

[0016] 5、本发明制备出的稀土-有机多孔材料中有机分子发光与谷氨酸浓度有很强的依赖，而稀土发光则不受谷氨酸浓度的影响。随着谷氨酸浓度的升高，有机分子发光逐渐增强，而稀土发光则基本不变。因此可采用稀土发光为內标，有机分子的发光为检测信号，实现谷氨酸的准确检测。这种內标的检测方法结果准确可靠，不需要额外的校准，操作简单方便。两发射峰的比值与谷氨酸在0-5mM范围内具有良好的线性关系，检测限为3.6μM。此外，(C26H30Tb3O22)n·(G)x的发光颜色随着谷氨酸浓度增加从绿色变到蓝色，因此，可根据探针发光颜色而监控谷氨酸的浓度。

[0017] 6、本发明制备出的稀土-有机多孔材料对谷氨酸检测具有良好的选择性，血液中的主要物质如氯化钠、蛋白酶、磷酸盐、脯氨酸、葡萄糖、尿素等对检测无干扰。

[0018] 7、本发明制备出的稀土-有机多孔材料生物毒性小，生物相容性好。细胞毒性实验表明该探针具有较好的生物相容性。探针浓度增加到200mg/mL时，细胞的成活率仍然大于90％。把该材料与细胞一起培养，发现细胞生长状态正常，且大部分该材料会被细胞吞噬。
吞噬的材料在细胞中仍然保持原有的八面体状。因此，该稀土-有机多孔材料可实现复杂环境及人体内的谷氨酸检测，进而实现预防和监控神经疾病。

附图说明

[0019] 图1是本发明制备的稀土-有机多孔材料(C26H30Tb3O22)·(G)x加入不同量的谷氨酸荧光发射光谱图；

[0020] 图2是本发明制备的稀土-有机多孔材料(C26H30Tb3O22)·(G)x的两发射峰比值与谷氨酸浓度的关系。

具体实施方式

[0021] 实施例1：

[0022] 利用六水合硝酸铽(Tb(NO3)3·6H2O)与2-羟基对苯二甲酸，通过溶剂热法合成了稀土-有机多孔材料(C26H30Tb3O22)·DMF·(H2O)3，其具体的合成路线如下：

[0023] 将2-羟基对苯二甲酸、六水合硝酸铽和2-氟苯甲酸分别溶解在N,N-二甲基甲酰胺中，均制成0.01mol/L的溶液。然后取0.73mL的2-羟基对苯二甲酸溶液、0.73mL的六水合硝酸铽溶液和5.84mL的2-氟苯甲酸溶液，混合均匀，加入到密闭容器中；再加入0.6mL的去离子水和0.2mL的硝酸，密封，在110℃恒温烘箱中反应3天，随炉冷却到室温，离心分离固液体，固体用N,N-二甲基甲酰胺和乙醇清洗，过滤并干燥，得到目标产物(C26H30Tb3O22)·DMF·(H2O)3，晶体为淡黄色的八面体，尺寸大约为0.3mm×0.3mm×0.3mm，产率为55％。

[0024] 通过X-射线单晶衍射法确定其结构，测试结果表明：该材料的分子式为(C26H30Tb3O22)·DMF·(H2O)3，属于四方晶系，空间群为P4/mnc，晶胞参数为a＝α＝β＝γ＝90°，晶胞体积为 Z＝4，晶体密度Dc＝-3
1.502g cm 。制备的稀土-有机多孔材料由六个Tb离子组成的六核簇和去质子化的2-羟基对苯二甲酸连接形成的三维结构。每个Tb3+离子与周围的九个氧原子配位，临近的Tb3+离子通过μ3-OH基团和去质子化的羧酸基团连接而形成六核金属簇，每金属簇与十二个有机配体去质子化的2-羟基对苯二甲酸连接，每个去质子化的2-羟基对苯二甲酸与两个六核簇连接，进而形成三维孔笼结构。该结构为微孔有序结构，含有两种孔笼，分别是八面体孔笼和四面体孔笼。其中八面体孔笼由十二个去质子化的2-羟基对苯二甲酸和六个金属簇围绕而成，四面体孔笼由六个去质子化的2-羟基对苯二甲酸和四个金属簇组成。孔道中有大量的溶剂，这些溶剂可通过交换活化的方式去除，去除溶剂后的BET面积高达537.3m2g-1。

[0025] 获得的稀土-有机多孔材料(C26H30Tb3O22)·DMF·(H2O)3具有高的化学稳定性、光稳定性和热稳定性，能在各种有机溶剂(N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二乙基乙酰胺、乙腈、乙醇、甲醇、二甲基亚砜、二氧六环和四氢呋喃)、磷酸生理液和酸碱水溶液(pH＝1～13)等条件下保持结构完整，热重分析表明该稀土有机框架材料能稳定到320℃。紫外光持续照射下，三天内没有发现荧光衰减。

[0026] 紫外光激发下，固态的该晶体发射明显的铽离子特征荧光(544nm)，配体的发射峰完全消失，量子效率为17％。水溶液中该材料发射强烈的有机分子荧光(430nm)和Tb3+离子特征发射(544nm)，量子效率高达58％。本发明制备出的稀土-有机多孔材料(C26H30Tb3O22)·DMF·(H2O)3中有机分子发光与谷氨酸浓度有很强的依赖，而稀土发光则不受谷氨酸浓度的影响。如图1所示，随着谷氨酸浓度的增加，Tb3+的特征发射强度(544nm处)基本不变，而配体的荧光(430nm处)迅速增加。因此可采用稀土发光为內标，有机分子的发光为检测信号，实现谷氨酸的准确检测。如图2所示，两个发光峰的强度比值与谷氨酸浓度呈较好的线性关系，线性区间为0～5mM，检测限为3.6μM，相应的工作曲线如下：

[0027] I430/I544＝2.038+0.0214c

[0028] 血液中主要的物质如无机盐，葡萄糖，尿素，氯化钠，蛋白酶，磷酸盐，脯氨酸等对检测没干扰。此外，该探针发光颜色随谷氨酸浓度的增加从绿色逐渐变化到蓝色，相应的色坐标由谷氨酸浓度为0mM时的(0.248,0.332)变化到谷氨酸浓度为5mM时的(0.166,0.133)，有望在谷氨酸检测和监控领域得到实际应用。该探针重复性好，检测结果准确可靠，五个循环后检测效果没有任何衰减。该稀土-有机多孔材料对谷氨酸的探测结果与探针浓度无关，采用不同的探针浓度(0.1mg mL-1、0.2mg mL-1、0.5mg mL-1、1mg mL-1、1mg mL-1和5mg mL-1)对同一浓度谷氨酸进行检测，其检测结果是一致的。在25℃、35℃和45℃三个温度下对同一浓度谷氨酸进行检测，结果也是相同的。说明该探针重复性好，检测结果准确可靠。细胞毒性实验表明该探针具有较好的生物相容性，采用MTT法测定细胞毒性时，当探针的浓度增加到200μg mL-1，细胞的成活率仍然高于90％。人体内谷氨酸的正常浓度为14～192mM，该探针的工作范围包括了谷氨酸在人体内正常值范围。当谷氨酸浓度高于192mM，表明可能发生一些神经疾病，因此该探针能用于神经疾病的早期监控和预防。

[0029] 实施例2：

[0030] 利用六水合硝酸铕(Eu(NO3)3·6H2O)与2-羟基对苯二甲酸，通过溶剂热法合成了稀土-有机多孔材料(C26H30Eu3O22)·DMF·(H2O)3，其具体的合成路线如下：

[0031] 将2-羟基对苯二甲酸、六水合硝酸铕和2-氟苯甲酸分别溶解在N,N-二甲基甲酰胺中，均制成0.01mol/L的溶液。然后取0.73mL的2-羟基对苯二甲酸溶液、0.73mL的六水合硝酸铕溶液和5.84mL的2-氟苯甲酸溶液，混合均匀，加入到密闭容器中；再加入0.6mL的去离子水和0.2mL的硝酸，密封，在110℃恒温烘箱中反应3天，随炉冷却到室温，离心分离固液体，固体用N,N-二甲基甲酰胺和乙醇清洗，过滤并干燥得到(C26H30Eu3O22)·DMF·(H2O)3，产率为51％，BET面积高达497.6m2g-1。

[0032] 获得的稀土-有机多孔材料(C26H30Eu3O22)·DMF·(H2O)3为淡黄色晶体，形状为八面体，尺寸大约为0.3mm×0.3mm×0.3mm。该多孔材料能在各种有机溶剂(N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二乙基乙酰胺、乙腈、乙醇、甲醇、二甲基亚砜、二氧六环和四氢呋喃)、磷酸缓冲液和酸碱水溶液(pH＝1～13)等条件下保持结构完整，热重分析表明该稀土有机框架材料能稳定到310℃。

[0033] 紫外光激发下，固体(C26H30Eu3O22)·DMF·(H2O)3发出强烈的红色铕离子荧光(614nm)，量子效率为14％。把(C26H30Eu3O22)·DMF·(H2O)3超声分散在水中时，发射较强的有机分子发光(430nm)和较弱的铕离子发光(614nm)，量子效率为48％。该多孔材料的荧光稳定性很好，紫外光持续激发下，三天内没有发现任何荧光衰减，特别是在水溶液中，两个发射峰的比值没有任何变化。此外，该多孔材料在430nm处的荧光跟谷氨酸浓度有很强的依赖关系，随着谷氨酸浓度的逐渐增加，430nm处的荧光逐渐增加，但是614nm处的荧光则与谷氨酸的浓度无关。两发射峰强度比值与谷氨酸浓度呈下述线性关系：

[0034] I430/I614＝14.13+0.1440c

[0035] 即随着谷氨酸浓度的增加，I430/I614随之线性增长。实际应用中，根据所测得的I430/I614值即可倒推出相应的谷氨酸浓度。血液中主要的物质如无机盐，葡萄糖，尿素，氯化钠，蛋白酶，磷酸盐，脯氨酸等对检测无干扰，表明该探针对谷氨酸具有靶向性和特异性。同时，该探针的发光颜色随谷氨酸浓度而变化，相应的色坐标由谷氨酸浓度0mM的(0.205,0.096)变化到谷氨酸浓度2mM时的(0.168,0.106)，有望在谷氨酸检测和监控领域得到实际应用。

[0036] 实施例3：

[0037] 利用六水合硝酸钆(Gd(NO3)3·6H2O)与2-羟基对苯二甲酸，通过溶剂热法合成了稀土-有机多孔材料(C26H30Gd3O22)·DMF·(H2O)3，其具体的合成路线如下：

[0038] 将2-羟基对苯二甲酸、六水合硝酸钆和2-氟苯甲酸分别溶解在N,N-二甲基甲酰胺中，均制成0.01mol/L的溶液。然后取0.73mL的2-羟基对苯二甲酸溶液、0.73mL的六水合硝酸钆溶液和5.84mL的2-氟苯甲酸溶液，混合均匀，加入到密闭容器中；再加入0.6mL的去离子水和0.2mL的硝酸，密封，在110℃恒温烘箱中反应3天，随炉冷却到室温，离心分离固液体，固体用N,N-二甲基甲酰胺和乙醇清洗，过滤并干燥得到稀土-有机多孔材料(C26H30Gd3O22)·DMF·(H2O)3，产率为62％，BET面积为478.4m2g-1。

[0039] 获得的稀土-有机多孔材料(C26H30Gd3O22)·DMF·(H2O)3为淡黄色晶体，形状为八面体，尺寸大约为0.3mm×0.3mm×0.3mm。该多孔材料具有良好的化学稳定性、热稳定性和光稳定性。紫外光照射下，(C26H30Gd3O22)·DMF·(H2O)3发出较强的蓝光，最大发射波长在425nm处，固态时量子效率为14％，超声分散在水溶液中后量子效率为42％。该探针的最大发射波长位置和发射强度都与谷氨酸浓度有关。当谷氨酸浓度为0mM时，最大发射波长为
425nm，发射强度为2437cps；当谷氨酸浓度逐渐增加到5mM时，最大发射波长逐渐红移到
443nm，发射强度增加到3766cps。相应的色坐标由谷氨酸浓度0mM时的(0.155,0.059)变化到谷氨酸浓度5mM时的(0.152,0.092)，有望在谷氨酸检测和监控领域得到实际应用。

[0040] 实施例4：

[0041] 利用六水合硝酸铽(Tb(NO3)3·6H2O)与2,5-二羟基对苯二甲酸，通过溶剂热法合成了稀土-有机多孔材料(C26H30Tb3O23)·DMF·(H2O)3，其具体的合成路线如下：

[0042] 将2,5-二羟基对苯二甲酸、六水合硝酸铽和2-氟苯甲酸分别溶解在N,N-二甲基甲酰胺中，均制成0.01mol/L的溶液。然后取0.73mL的2-羟基对苯二甲酸溶液、0.73mL的六水合硝酸铽溶液和5.84mL的2-氟苯甲酸溶液，混合均匀，加入到密闭容器中；再加入0.6mL的去离子水和0.2mL的硝酸，密封，在110℃恒温烘箱中反应3天，随炉冷却到室温，离心分离固液体，固体用N,N-二甲基甲酰胺和乙醇清洗，过滤并干燥，得到稀土-有机多孔材料(C26H30Tb3O23)·DMF·(H2O)2，产率为42％，BET面积为324.6m2g-1。

[0043] 获得的稀土-有机多孔材料(C26H30Tb3O23)·DMF·(H2O)2为棕黄色晶体，形状为八面体，尺寸大约为0.35mm×0.35mm×0.35mm，由六核铽稀土簇和去质子化的2,5-二羟基对苯二甲酸连接而成。紫外光激发下，固体(C26H30Tb3O23)·DMF·(H2O)2发出强烈的绿色铽离子荧光(544nm)，量子效率为7.3％。把(C26H30Tb3O23)·DMF·(H2O)2超声分散在水中时，发射较强的有机分子发光(430nm)和较弱的铽离子荧光(544nm)，量子效率为28％。该多孔材料具有良好的化学稳定性、热稳定性和光稳定性。此外，该多孔材料在430nm处的荧光跟谷氨酸浓度有很强的依赖关系，随着谷氨酸浓度的逐渐增加，430nm处的荧光逐渐增加，但是544nm处的荧光则与谷氨酸的浓度无关。两发射峰强度比值与谷氨酸浓度呈下述线性关系：

[0044] I430/I544＝5.037+0.0742c

[0045] 即随着谷氨酸浓度的增加，I430/I544随之线性增长。实际应用中，根据所测得的I430/I544值即可倒推出相应的谷氨酸浓度。血液中主要的物质如无机盐，葡萄糖，氯化钠，尿素，蛋白酶，磷酸盐，脯氨酸等对检测无干扰，表明该探针对谷氨酸具有靶向性和特异性检测效果。同时，该探针的发光颜色随谷氨酸浓度而变化，相应的色坐标由谷氨酸浓度0mM时的(0.233,0.327)变化到谷氨酸浓度为5mM时的(0.156,0.128)，有望在谷氨酸检测和监控领域得到实际应用。

[0046] 上述具体实施方式用来解释说明本发明，但本发明不应该局限于该实施例和附图所公开的内容。所以凡是不脱离本发明公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护范围。