本发明公开了一种光电化学生物免疫传感器及其制备方法和检测特定碱基序列的应用，所述光电化学生物免疫传感器是以FTO导电玻璃电极为基底，通过层层组装的方法在所述基底的表面覆盖邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯、薄层氮化碳和薄层二硫化钼的混合物以及硫化镉量子点纳米复合材料，在所述纳米复合材料的表面通过S‑Cd键固定有基础碱基序列。本发明以电化学信号为检测基础，通过对电极表面明暗电流大小的检测，简单快速的检测出特定碱基序列的浓度，进而确定被测物的浓度。本发明方法操作简单，特异性强，灵敏度高。
1.一种光电化学生物免疫传感器的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤1：称取1.402g三聚氰胺置于坩埚中，然后放入马弗炉中，升温至550℃并保温4小时，保温结束后将坩埚取出，冷却至室温，将所得样品在研钵中研磨成粉末，再将粉末转移至马弗炉中，升温至500℃并保温2小时，冷却后将所得样品以1mg/mL的浓度分散在水中，超声4小时，离心后倒出上层清液，将离心后的沉淀物真空干燥后加入二次水中，获得浓度为
步骤2：在室温下，将40mg钼酸铵和80mg硫脲溶于25ml二甲基甲酰胺中，混合均匀后转移至聚四氟乙烯高压反应釜中，200℃下反应24小时，即可得到黑色的二硫化钼溶液，离心后在-60℃下冻干，将所得二硫化钼固体以1mg/mL的浓度分散在二次水中，备用；
步骤3：称取0.1467g CdCl2于三口烧瓶中，再向其中加入40mL二次水，搅拌溶解完全，然后滴加172μL的巯基丙酸，通氮气，用1mol/L的NaOH调节pH至11，随后滴加0.0601g硫代乙酰胺和10mL二次水的混合溶液，升温至80℃反应2h，自然冷却至室温，向反应液中加入等体积的无水乙醇沉降，离心，倒出上清液，用二次水将体积定容为8mL，即可得到水溶硫化镉量子点溶液；
步骤4：将步骤1获得的浓度为1mg/mL的薄层氮化碳分散液和步骤2获得的浓度为1mg/mL的二硫化钼分散液按体积比1:1-3的比例混合，震荡器震荡至混合均匀，获得薄层氮化碳-二硫化钼混合液，于4℃下放置备用；
步骤5：将FTO导电玻璃电极用声波降解法依次用二次水、丙酮、无水乙醇进行超声清洗，然后置于60℃烘箱中8～12小时，备用；
步骤6：将经步骤5洗净的FTO导电玻璃电极用万用表测试出导电面，将面积固定为5*
9mm2，向导电面上滴加30uL邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯，常温静置1小时，用10mM、pH值为7.4的磷酸缓冲溶剂冲洗，氮气吹干；然后在邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯的表面滴加
20-25uL步骤4获得的薄层氮化碳-二硫化钼混合液，自然条件下晾干；然后再滴加30uL邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯，常温静置1小时，用100mM、pH值为7.4的磷酸缓冲溶剂冲洗，氮气吹干；再滴加15-20uL步骤3获得的水溶硫化镉量子点溶液，自然晾干后用二次水冲洗，N2吹干，即可得到纳米复合材料修饰电极；
步骤7：将1μM的基础碱基序列与10mM三羧甲基磷酸按体积比100:1的比例混合，充分震荡后常温静置活化1小时，以断开二硫键，然后在步骤6所得纳米复合材料修饰电极的表面滴加30uL活化后的基础碱基序列，随后置于4℃下避光孵育12个小时；电极取出后用pH值为
8.0的TE缓冲液冲洗，N2吹干，再将10mM、30uL的六巯基己醇滴加在电极表面来封闭电极表面裸露的镉，随后置于水浴恒温振荡器中于37℃下孵育1小时，取出后用10mM、pH值为7.4的PBS磷酸缓冲溶剂冲洗，N2吹干，得到光电化学生物免疫传感器；
所述基础碱基序列为5’-CAA-AAG-CCC-TTC-TTT-C3-SH，该基础碱基序列会与目标DNA序列发生特异性碱基互补结合。
2.一种权利要求1制备的光电化学生物免疫传感器的应用，其特征在于：是作为检测试剂用于检测慢性髓细胞白血病特定碱基的浓度，包括如下步骤：步骤8：在所述光电化学生物免疫传感器的表面滴加30uL待测浓度的目标DNA，于37℃下孵育90-100分钟，取出后用pH值为8.0的TE缓冲液冲洗，N2吹干；然后滴加30uL信号放大因子，并在37℃下孵育110-120分钟，取出后用pH为8.0的磷酸缓冲溶剂冲洗，氮气吹干，即得待测生物免疫传感器；
步骤9：将步骤8获得的待测生物免疫传感器在2.5mL含有0.1mol/L抗坏血酸和0.1mol/L、pH值为7.4的磷酸缓冲液中进行光电化学测试，获得光电图；利用所得光电图中明暗电流间的差值与待测目标DNA浓度的标准关系曲线获得待测目标DNA的浓度；
步骤8中，所述信号放大因子为羧基化的硒化镉量子点，其制备方法包括如下步骤：
8a、称取1.89g Na2SO3和0.395g Se粉加入三口烧瓶中，然后加入50ml二次水，在70～80℃下搅拌回流反应8小时，获得0.1mol/L的Na2SeSO3溶液；
8b、称取0.2510g CdCl2于三口烧瓶中，加入200ml二次水，搅拌溶解后加入2.64mL、
1mol/L的L-半胱氨酸，搅拌均匀后用1mol/L氢氧化钠溶液调pH值为11，持续通氮气半个小时后加入0.75mL步骤8a制得的0.1mol/L的Na2SeSO3溶液，升至80℃反应2小时，自然冷却，向反应液中加入等体积的无水乙醇沉降，离心，倒出上清液，将固体用二次水定容至15mL，即可得到信号放大因子——羧基化的硒化镉量子点。
步骤9中，进行光电化学测试时，采用三电极体系，以Ag-AgCl电极为参比电极，Pt丝电极为辅助电极，待测生物免疫传感器为工作电极，测试以氙灯为光源，灯头与电极间的距离固定为2.5cm，氙灯照射时间为20秒，避光时间也为20秒，测试时间为400秒，最后得到光电图。
在所述光电化学生物免疫传感器的表面滴加30uL目标DNA标准样品，于37℃下孵育100分钟，取出后用pH值为8.0的TE缓冲液冲洗，N2吹干；然后滴加30uL信号放大因子，即得标准样品生物免疫传感器；将所得标准样品生物免疫传感器在2.5mL含有0.1mol/L抗坏血酸和
0.1mol/L、pH值为7.4的磷酸缓冲液中进行光电化学测试，获得光电图；以目标DNA浓度的对数为横坐标，以明暗电流差为纵坐标进行拟合，即可获得标准关系曲线。
所述目标DNA标准样品的浓度为2uM-1pM，至少取六个不同的点值。
一种光电化学生物免疫传感器及其制备方法和检测特定碱基
序列的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种生物免疫传感器，具体地说是一种光电化学生物免疫传感器及其制备方法和检测特定碱基序列的应用。
背景技术
[0002] 自2009年Wang等首次发现g-C3N4在可见光照射下可催化分解水制氢以来，g-C3N4迅速成为全世界范围光电领域的研究热点(Wang X,Maeda k,ThomasA,etal.A metal-free polymeric photo-catalyst for hydrogen production from water under visible light[J].Nat Mater,2009.8：76.)。
[0003] Xiang及其课题组成员通过溶剂热法将分层状的MoS2/石墨烯复合助催化剂担载在TiO2纳米颗粒上，光催化产氢效率显著提高(XIANG Q,YU J,JARONIEC M.Synergetic effect of MoS2and graphene as cocatalysts for enhanced photocatalytic H2production activity of TiO2 nanoparticles[J].Journal of the American Chemical Society,2012,134(15):6575-6578.)。
[0004] Zong等人认为MoS2与CdS由于相同的S2-离子，二者之间的异质结更容易形成，通过在CdS上但载助催化剂MoS2成功提高了CdS的光电性能(ZONG X,YAN H,WU G,etal.ENhancement of photocatalytic H2evolution on CdS by loading MoS2as cocalyst under visible light irradiation[J].Journal of the American Chemical Society,2008,130(23):7176-7177.)。
[0005] 人慢性髓细胞白血病是一种因为特异性染色体异常而产生的血液肿瘤病，在我国约占慢性白血病的70％。染色体是由一连串基因组成，每一个基因都担负着一定的特殊功能，碱基序列的改变会导致正常基因组成改变，进而会导致染色体发生异常，从而产生病变。因此，监控基因组成的改变对早期发现和治疗人慢性髓细胞白血病有着重大的意义。
[0006] 光电化学就是在光照射下，当无机半导体材料受到能量大于其禁带宽度时，电子从价带跃迁到导带，价带上产生空穴，导带上产生电子，即电子－空穴对，这对电子空穴对一种可能是再复合，另一种可能是导带上的电子转移到外电路或者溶液中的电子受体上，引起光电流的产生。
[0007] 本发明用光电化学的方法可以对人慢性髓细胞白血病的特异性碱基进行定量的检测，从而达到监控基因病变，进而早些进行治疗的目的。
发明内容
[0008] 本发明旨在提供一种光电化学生物免疫传感器及其制备方法和检测特定碱基序列的应用。本发明通过构建光电化学免疫传感器实现了对与人髓细胞白血病相关的特定碱基的检测，方法简单，特异性强，灵敏度高。
[0009] 本发明光电化学生物免疫传感器，是以FTO导电玻璃电极为基底，通过层层组装的方法在所述基底的表面覆盖邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯、薄层氮化碳和薄层二硫化钼的混合物以及硫化镉量子点纳米复合材料(PDDA/C3N4+MoS2/CdS QDs)，在所述纳米复合材料的表面通过S-Cd键固定有基础碱基序列。本发明光电化学生物免疫传感器以电化学信号为检测基础，通过对电极表面明暗电流大小的检测，简单快速的检测出特定碱基序列的浓度，进而确定被测物的浓度。
[0010] 所述基础碱基序列为5’-CAA-AAG-CCC-TTC-TTT-C3-SH，该基础碱基序列会与目标DNA序列发生特异性碱基互补结合。
[0011] 本发明光电化学生物免疫传感器的制备方法，包括如下步骤：
[0012] 步骤1：称取1.402g三聚氰胺置于坩埚中，然后放入马弗炉中，升温至550℃并保温4小时(升温速率为3℃/min)，保温结束后将坩埚取出，冷却至室温，将所得样品在研钵中充分研磨成粉末，再将粉末转移至马弗炉中，升温至500℃并保温2小时(升温速率为5℃/min)，冷却后将所得样品以1mg/mL的浓度分散在水中，超声4小时，然后以9000r/min的转速离心10min，倒出上层清液，将离心后的沉淀物真空干燥后加入二次水中，获得浓度为1mg/mL的薄层氮化碳分散液。
[0013] 步骤2：在室温下，将40mg钼酸铵和80mg硫脲溶于25ml二甲基甲酰胺中，混合均匀后转移至聚四氟乙烯高压反应釜中，200℃下反应24小时，即可得到黑色的二硫化钼溶液，高速离心后在-60℃下冻干，将所得二硫化钼固体以1mg/mL的浓度分散在二次水中，备用；
[0014] 步骤3：称取0.1467g CdCl2于三口烧瓶中，再向其中加入40mL二次水，搅拌溶解完全，然后滴加172μL的巯基丙酸(MPA)，通氮气，用1mol/L的NaOH调节pH至11，随后滴加0.0601g硫代乙酰胺(TAA)和10mL二次水的混合溶液，升温至80℃反应2h，自然冷却至室温，向反应液中加入等体积的无水乙醇沉降，离心(转速8000r/min，15min)，倒出上清液，用二次水将体积定容为8mL，即可得到水溶硫化镉量子点溶液(CdS QDs)；
[0015] 步骤4：将步骤1获得的浓度为1mg/mL的薄层氮化碳分散液和步骤2获得的浓度为1mg/mL的二硫化钼分散液按体积比1:1-3的比例混合，震荡器震荡至混合均匀，获得薄层氮化碳-二硫化钼混合液，于4℃下放置备用；
[0016] 步骤5：将FTO导电玻璃电极用声波降解法依次用二次水、丙酮、无水乙醇进行超声清洗，各3次，每次15分钟，然后置于60℃烘箱中8～12小时，备用；
[0017] 步骤6：将经步骤5洗净的FTO导电玻璃电极用万用表测试出导电面，将面积固定为5*9mm2，向导电面上滴加30uL邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯(PDDA)，常温静置1小时，用
10mM、pH值为7.4的磷酸缓冲溶剂冲洗，氮气吹干；然后在邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯的表面滴加20-25uL步骤4获得的薄层氮化碳-二硫化钼混合液，自然条件下晾干；然后再滴加30uL邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯(PDDA)，常温静置1小时，用100mM、pH值为7.4的磷酸缓冲溶剂冲洗，氮气吹干；再滴加15-20uL步骤3获得的水溶硫化镉量子点溶液，自然晾干后用二次水冲洗，N2吹干，即可得到纳米复合材料修饰电极；
[0018] 步骤7：将1μM的基础碱基序列与10mM三羧甲基磷酸(TCEP)按体积比100:1的比例混合，充分震荡后常温静置活化1小时，以断开二硫键(基础碱基序列中的巯基易与自身的巯基形成二硫键)，然后在步骤6所得纳米复合材料修饰电极的表面滴加30uL活化后的基础碱基序列，随后置于4℃下避光孵育12个小时；电极取出后用pH值为8.0的TE缓冲液冲洗，N2吹干，再将10mM、30uL的六巯基己醇(MCH)滴加在电极表面来封闭电极表面裸露的镉(与其形成硫镉键来封闭电极)，随后置于水浴恒温振荡器中于37℃下孵育1小时，取出后用10mM、pH值为7.4的PBS磷酸缓冲溶剂冲洗，N2吹干，得到光电化学生物免疫传感器。
[0019] 本发明光电化学生物免疫传感器的应用，是作为检测试剂用于检测慢性髓细胞白血病特定碱基的浓度，具体包括如下步骤：
[0020] 步骤8：在本发明光电化学生物免疫传感器的表面滴加30uL待测浓度的目标DNA，于37℃下孵育90-100分钟，取出后用pH值为8.0的TE缓冲液冲洗，N2吹干；然后滴加30uL信号放大因子，并在37℃下孵育110-120分钟，取出后用pH为8.0的磷酸缓冲溶剂冲洗，氮气吹干，即得待测生物免疫传感器；
[0021] 步骤9：将步骤8获得的待测生物免疫传感器在2.5mL含有0.1mol/L抗坏血酸和0.1mol/L、pH值为7.4的磷酸缓冲液中进行光电化学测试，获得光电图；利用所得光电图中明暗电流间的差值与待测目标DNA浓度的标准关系曲线获得待测目标DNA的浓度。
[0022] 步骤8中，所述信号放大因子为羧基化的硒化镉量子点(CdSe QDs)，其制备方法包括如下步骤：
[0023] 8a、称取1.89g Na2SO3和0.395g Se粉加入三口烧瓶中，然后加入50ml二次水，在70～80℃下搅拌回流反应8小时，获得0.1mol/L的Na2SeSO3溶液。
[0024] 8b、称取0.2510g CdCl2于三口烧瓶中，加入200ml二次水，搅拌溶解后加入2.64mL、1mol/L的L-半胱氨酸(L-cys)，搅拌均匀后用1mol/L氢氧化钠溶液调pH值为11，持续通氮气半个小时后加入0.75mL步骤1a制得的0.1mol/L的Na2SeSO3溶液，升至80℃反应2小时，自然冷却，向反应液中加入等体积的无水乙醇沉降，离心(转速8000r/min，15min)，倒出上清液，将固体用二次水定容至15mL，即可得到信号放大因子——羧基化的硒化镉量子点(CdSe QDs)。
[0025] 步骤9中，进行光电化学测试时，采用三电极体系，以Ag-AgCl电极为参比电极，Pt丝电极为辅助电极，待测生物免疫传感器为工作电极，测试以氙灯为光源，灯头与电极间的距离固定为2.5cm，氙灯照射时间为20秒，避光时间也为20秒，测试时间为400秒，最后得到光电图。
[0026] 步骤9中，所述标准关系曲线是通过如下方法获得：
[0027] 在本发明光电化学生物免疫传感器的表面滴加30uL目标DNA标准样品，于37℃下孵育100分钟，取出后用pH值为8.0的TE缓冲液冲洗，N2吹干；然后滴加30uL信号放大因子，即得标准样品生物免疫传感器；将所得标准样品生物免疫传感器在2.5mL含有0.1mol/L抗坏血酸和0.1mol/L、pH值为7.4的磷酸缓冲液中进行光电化学测试，获得光电图(见图2)；以目标DNA(髓细胞白血病特定碱基)浓度的对数为横坐标，以明暗电流差为纵坐标进行拟合，即可获得标准关系曲线(图2插图)。检测表明当髓细胞白血病的特定碱基的浓度在2uM-1pM的浓度范围内呈线性关系检测线达1pM。
[0028] 所述目标DNA标准样品的浓度分别为2uM，100nM，10nM，1nM，0.1nM，0.01nM，1pM。
[0029] 本发明采用二维结构的MoS2和类石墨烯结构的g-C3N4作为生物免疫传感器的基底。将MoS2与C3N4结合，易形成异质结构，使得光诱导g-C3N4表面产生的电子能够迅速迁移到MoS2纳米片上，缩短了电荷传输的距离，提高了光电效率。在光的照射下，电极表面产生电流，我们将电流信号收集起来，根据光电流信号的大小来判断碱基序列的浓度及生物免疫传感器的特异性来判断碱基序列的准确性。
[0030] 与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：
[0031] 1、本发明通过构建光电化学免疫传感器实现了对与人髓细胞白血病相关的特定碱基的检测，方法简单，特异性强，灵敏度高。
[0032] 2、本发明中对与人髓细胞白血病相关的特定碱基的检测所需样品量少，检测成本低。
[0033] 3、本发明通过构建邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯/薄层氮化碳和薄层二硫化钼的混合物/硫化镉量子点复合物膜来制备生物免疫传感器，浓度改变后光电流变化明显，生物相容性好，且具有很高的稳定性。
附图说明
[0034] 图1为本发明光电化学生物免疫传感器的制备及检测过程原理示意图。
[0035] 图2本发明对浓度分别为2uM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM、1pM(从左到右)的目标DNA浓度进行光电检测的测试结果，插图为标准曲线关系。
[0036] 图3为本发明中薄层氮化碳和薄层二硫化钼的混合物的扫描电子显微镜(SEM)表征的结果。
[0037] 图4为本发明中硫化镉量子点复合物的透射电子显微镜(TEM)表征的结果。
具体实施方式
[0038] 实施例1：
[0039] 本实施例中光电化学生物免疫传感器的制备方法如下：
[0040] 1、称取1.402g三聚氰胺置于坩埚中，然后放入马弗炉中，升温至550℃并保温4小时(升温速率为3℃/min)，保温结束后将坩埚取出，冷却至室温，将所得样品在研钵中充分研磨成粉末，再将粉末转移至马弗炉中，升温至500℃并保温2小时(升温速率为5℃/min)，冷却后将所得样品以1mg/mL的浓度分散在水中，超声4小时，然后以9000r/min的转速离心10min，倒出上层清液，将离心后的沉淀物真空干燥后加入二次水中，获得浓度为1mg/mL的薄层氮化碳分散液。
[0041] 2、在室温下，将40mg钼酸铵和80mg硫脲溶于25ml二甲基甲酰胺中，混合均匀后转移至聚四氟乙烯高压反应釜中，200℃下反应24小时，即可得到黑色的二硫化钼溶液，高速离心后在-60℃下冻干，将所得二硫化钼固体以1mg/mL的浓度分散在二次水中，备用；
[0042] 3、称取0.1467g CdCl2于三口烧瓶中，再向其中加入40mL二次水，搅拌溶解完全，然后滴加172μL的巯基丙酸(MPA)，通氮气，用1mol/L的NaOH调节pH至11，随后滴加0.0601g硫代乙酰胺(TAA)和10mL二次水的混合溶液，升温至80℃反应2h，自然冷却至室温，向反应液中加入等体积的无水乙醇沉降，离心(转速8000r/min，15min)，倒出上清液，用二次水将体积定容为8mL，即可得到水溶硫化镉量子点溶液(CdS QDs)；
[0043] 4、将步骤1获得的浓度为1mg/mL的薄层氮化碳分散液和步骤2获得的浓度为1mg/mL的二硫化钼分散液按体积比1:3的比例混合，震荡器震荡至混合均匀，获得薄层氮化碳-二硫化钼混合液，于4℃下放置备用；
[0044] 5、将FTO导电玻璃电极用声波降解法依次用二次水、丙酮、无水乙醇进行超声清洗，各3次，每次15分钟，然后置于60℃烘箱中8～12小时，备用；
[0045] 6、将经步骤5洗净的FTO导电玻璃电极用万用表测试出导电面，将面积固定为5*9mm2，向导电面上滴加30uL邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯(PDDA)，常温静置1小时，用
10mM、pH值为7.4的磷酸缓冲溶剂冲洗，氮气吹干；然后在邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯的表面滴加20uL步骤4获得的薄层氮化碳-二硫化钼混合液，自然条件下晾干；然后再滴加
30uL邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯(PDDA)，常温静置1小时，用100mM、pH值为7.4的磷酸缓冲溶剂冲洗，氮气吹干；再滴加15uL步骤3获得的水溶硫化镉量子点溶液，自然晾干后用二次水冲洗，N2吹干，即可得到纳米复合材料修饰电极；
[0046] 7、将1μM的基础碱基序列与10mM三羧甲基磷酸(TCEP)按体积比100:1的比例混合，充分震荡后常温静置活化1小时，以断开二硫键(基础碱基序列中的巯基易与自身的巯基形成二硫键)，然后在步骤8所得纳米复合材料修饰电极的表面滴加30uL活化后的基础碱基序列，随后置于4℃下避光孵育12个小时；电极取出后用pH值为8.0的TE缓冲液冲洗，N2吹干，再将10mM、30uL的六巯基己醇(MCH)滴加在电极表面来封闭电极表面裸露的镉(与其形成硫镉键来封闭电极)，随后置于水浴恒温振荡器中于37℃下孵育1小时，取出后用10mM、pH值为7.4的PBS磷酸缓冲溶剂冲洗，N2吹干，得到光电化学生物免疫传感器。
[0047] 将本实施例制备的光电化学生物免疫传感器作为检测试剂用于检测慢性髓细胞白血病特定碱基的浓度，具体如下：
[0048] 8、在光电化学生物免疫传感器的表面滴加30uL待测浓度的目标DNA，于37℃下孵育90-100分钟，取出后用pH值为8.0的TE缓冲液冲洗，N2吹干；然后滴加30uL信号放大因子，并在37℃下孵育120分钟，取出后用pH为8.0的磷酸缓冲溶剂冲洗，氮气吹干，即得待测生物免疫传感器；
[0049] 9、将步骤8获得的待测生物免疫传感器在2.5mL含有0.1mol/L抗坏血酸和0.1mol/L、pH值为7.4的磷酸缓冲液中进行光电化学测试，获得光电图；利用所得光电图中明暗电流间的差值与待测目标DNA浓度的标准关系曲线获得待测目标DNA的浓度。
[0050] 步骤8中，所述信号放大因子为羧基化的硒化镉量子点(CdSe QDs)，其制备方法包括如下步骤：
[0051] 8a、称取1.89g Na2SO3和0.395g Se粉加入三口烧瓶中，然后加入50ml二次水，在70～80℃下搅拌回流反应8小时，获得0.1mol/L的Na2SeSO3溶液。
[0052] 8b、称取0.2510g CdCl2于三口烧瓶中，加入200ml二次水，搅拌溶解后加入2.64mL、1mol/L的L-半胱氨酸(L-cys)，搅拌均匀后用1mol/L氢氧化钠溶液调pH值为11，持续通氮气半个小时后加入0.75mL步骤1a制得的0.1mol/L的Na2SeSO3溶液，升至80℃反应2小时，自然冷却，向反应液中加入等体积的无水乙醇沉降，离心(转速8000r/min，15min)，倒出上清液，将固体用二次水定容至15mL，即可得到信号放大因子——羧基化的硒化镉量子点(CdSe QDs)。
[0053] 步骤9中，进行光电化学测试时，采用三电极体系，以Ag-AgCl电极为参比电极，Pt丝电极为辅助电极，待测生物免疫传感器为工作电极，测试以氙灯为光源，灯头与电极间的距离固定为2.5cm，氙灯照射时间为20秒，避光时间也为20秒，测试时间为400秒，最后得到光电图。
[0054] 步骤9中，所述标准关系曲线是通过如下方法获得：
[0055] 在本发明光电化学生物免疫传感器的表面滴加30uL目标DNA标准样品，于37℃下孵育90-100分钟，取出后用pH值为8.0的TE缓冲液冲洗，N2吹干；然后滴加30uL信号放大因子，即得标准样品生物免疫传感器；将所得标准样品生物免疫传感器在2.5mL含有0.1mol/L抗坏血酸和0.1mol/L、pH值为7.4的磷酸缓冲液中进行光电化学测试，获得光电图(见图2)；以目标DNA(髓细胞白血病特定碱基)浓度的对数为横坐标，以明暗电流差为纵坐标进行拟合，即可获得标准关系曲线(图2插图)。检测表明当髓细胞白血病的特定碱基的浓度在2uM-
1pM的浓度范围内呈线性关系检测线达1pM。
[0056] 所述目标DNA标准样品的浓度分别为2uM，100nM，10nM，1nM，0.1nM，0.01nM，1pM。
[0057] 本发明光电化学生物免疫传感器的稳定性好，特异性强，灵敏度高，对NH2-DNA的浓度检测范围是1PM-2μM，检测线达1PM，具有很高的实用性。
[0058] 实施例2：
[0059] 本实施例的制备过程同实施例1，不同的是步骤4中，薄层氮化碳分散液和二硫化钼分散液按体积比1:1的比例混合。所得生物免疫传感器和实施例1的形貌和性质类似，通过对人髓细胞特异碱基的检测，发现结果相同。
[0060] 实施例3：
[0061] 本实施例的制备过程同实施例1，不同的是步骤6中，在邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯的表面滴加25uL步骤4获得的薄层氮化碳-二硫化钼混合液。所得生物免疫传感器和实施例1的形貌和性质类似，通过对人髓细胞特异碱基的检测，发现结果相同。
[0062] 实施例4：
[0063] 本实施例的制备过程同实施例1，不同的是步骤6中，滴加20uL步骤3获得的水溶硫化镉量子点溶液。所得生物免疫传感器和实施例1的形貌和性质类似，通过对人髓细胞特异碱基的检测，发现结果相同。
[0064] 实施例5：
[0065] 本实施例的制备过程同实施例1，不同的是步骤8中，孵育时间100min改为90min。所得生物免疫传感器和实施例1的形貌和性质类似，通过对人髓细胞特异碱基的检测，发现结果相同。
[0066] 实施例6：
[0067] 本实施例的制备过程同实施例1，不同的是步骤8中，滴加30uL信号放大因子，并在37℃下孵育110分钟。所得生物免疫传感器和实施例1的形貌和性质类似，通过对人髓细胞特异碱基的检测，发现结果相同。
