京尼平苷在缓解骨骼肌纤维化中的应用

摘要

本发明公开了京尼平苷在缓解骨骼肌纤维化中的应用，属于天然产物治疗领域。本发明用京尼平苷刺激C2C12成肌细胞，结果表明京尼平苷可以明显减轻成纤维细胞的纤维化程度。进一步通过建立挫伤导致骨骼肌损伤的小鼠模型，腹腔注射京尼平苷标品对小鼠进行治疗，证明了京尼平苷在受损骨骼肌中发挥抗纤维化作用。此外，本发明用TGF‑β和Smad4刺激过后的C2C12成肌细胞，纤维化程度明显增加，然而再用京尼平苷处理后，相较于没处理的，纤维化水平显著下降。可见，京尼平苷缓解骨骼肌纤维化的作用机制可能与TGF‑β/Smad4信号通路密切相关。

权利要求

1.京尼平苷在制备用于缓解骨骼肌纤维化的药物中的应用，其特征在于，所述骨骼肌纤维化为骨骼肌在受到急性创伤进行再生修复时，肌纤维呈现持续的变性、坏死、再生、发炎或/以及细胞外基质大量沉积从而阻碍组织的重塑的过程。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述缓解是指在一定剂量和时间范围内，使成纤维细胞和损伤骨骼肌腓肠肌组织中的促纤维化基因collagen I(Col I)、Vimetin(Vim)、α-smooth muscle actin(α-SMA)和Smad4的表达下降，也使得骨骼肌细胞中由于受损增加的胶原纤维和ColⅠ的含量也降低。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述京尼平苷的来源包括：栀子粕、栀子果、杜仲，白花蛇舌草、黄连解毒汤。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上接受的辅料，包括溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、缓冲剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物是气雾剂或者敷料。

6.京尼平苷在制备用于治疗或祛除骨骼肌纤维化导致的疤痕组织的药物中的应用。

说明书

京尼平苷在缓解骨骼肌纤维化中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及京尼平苷的新用途，具体为京尼平苷在缓解骨骼肌纤维化中的应用，属于天 然产物治疗领域。

背景技术

[0002] 骨骼肌是人体最直接参与运动的器官，约占人体总重量的40％-50％，也是人体最大的组 织，在人类活动、社交和职业中扮演着重要的角色。骨骼肌损伤是运动医学中常见的软组织 损伤，而骨骼肌是具有完全再生能力的组织，在急性创伤性损害后骨骼肌多能完成再生修复。 受损后骨骼肌组织将依次经历炎症期、肌卫星细胞增殖活化期和再生纤维成熟重塑或纤维化 期几个过程。肌纤维是骨骼肌的基本结构，当肌纤维呈现持续的变性坏死和再生，同时伴有 慢性炎症，最后肌卫星细胞耗竭或分化异常，细胞外基质大量沉积导致纤维化发生。骨骼肌 过度纤维化表现为成纤维细胞等多种细胞的大量增殖、活化，伴随大量的胶原蛋白生成，并 且无法被机体吸收，从而导致组织的重塑障碍。骨骼肌纤维化导致疤痕组织的形成，是骨骼 肌慢性疾病和外伤的病理性标志之一，严重影响骨骼肌的愈合质量，造成运动收缩能力的下 降。一旦疤痕形成，肌组织的完全修复将不可能发生。

[0003] 在骨骼肌损伤修复过程中，转化生长因子β(TGF-β)是一种关键的促纤维化细胞因子， 可促进细胞外基质的形成，促进成纤维细胞合成胶原蛋白、纤维粘蛋白及蛋白多糖等细胞外 基质，同时促进细胞外基质蛋白特异性表面膜受体的表达。而TGF-β在肌肉损伤过程中的纤 维化作用主要通过TGF-β-Smad信号通路来调节的。Smad蛋白家族成员作为TGF-β下游的受 体激酶，在TGF-β信号通路中扮演着重要的介导作用。迄今为止，在哺乳动物中发现了8个 Smads家族成员，并根据它们的结构和功能将其分成三个亚族：(1)受体激活的Smads (R-Smads)，包括Smad1、2、3、5、8；(2)通用型Smads(co-smad)，目前在人类中仅发 现Smad4；(3)抑制型Smads(I-Smads)，包括Smad6、7。Smad4是所有R-Smads的结合配 体，是TGF-β超家族信号通路的关键环节，在纤维化病理进程中起着至关重要的作用。 TGF-β-Smad信号通路涉及TGF-β受体I激酶(TGF-β1)与Smad2/3直接作用，并使Smad2/3 磷酸化，然后磷酸化的Smad2/3与Smad4结合形成稳定的异源多聚体，并且Smad4促进Smad 复合体入核后，调节靶基因的转录。

[0004] 针对骨骼肌损伤，目前的物理疗法有休息、冰敷、医用臭氧、低强度激光、脉冲超声波， 化学疗法有抗氧化剂(维生素C、乙酰基半胱氨酸等)、抗炎药物(非甾体类)、抗纤维化药 物(如替米沙坦、脂氧素A4等)以及生长因子注射(如胰岛素样生长因子-1)，但是物理疗 法和化学疗法在效果、副作用、安全性等方面中存在一定的问题，治疗和预防的手段仍然很 有限。我们可以从经过漫长进化和自然筛选而形成的天然产物入手，探索新思路。而天然产 物在治疗骨骼肌损伤方面的研究有但很少，目前只有在杜氏肌营养不良症上，有相关研究发 现膳食天然多酚、楮(Broussonetia kazinoki Sieb.)中的Kazinol-P具有改善作用。

[0005] 栀子果是茜草科栀子属植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的成熟果实，主要分布在热 带、亚热带地区，在中国其产量约占世界总产量的90％。栀子果是卫生部颁布的首批药食两 用资源，常用来做中药、食品添加剂、食用色素、榨油等，具有消炎、镇痛、保肝利胆、抗 氧化等功效。其主要活性成分包含环烯醚萜、藏红花苷类，环烯醚萜类主要以京尼平苷为主， 藏红花苷类主要以藏红花素为主。京尼平苷是栀子众多药理活性的物质基础之一，含量随产 地的不同主要在3-8％，其结构式如图1所示。在一定剂量范围内，京尼平苷具有抗炎、神经 保护、降血糖等作用。此外，有研究表明，京尼平苷可通过抑制TGF-β/Smad和ERK-丝裂原 活化蛋白激酶(MAPK)信号通路来减轻肝纤维化，但迄今为止，京尼平苷在骨骼肌纤维化 的缓解作用方面还未见报道。

发明内容

[0006] 本发明提供了用于缓解骨骼肌纤维化的化合物或者组合物，所述化合物为京尼平苷，所 述组合物为含有京尼平苷的组合物。

[0007] 所述骨骼肌纤维化为骨骼肌在受到急性创伤进行再生修复时，肌纤维呈现持续的变性、 坏死、再生、发炎或/以及细胞外基质大量沉积从而阻碍组织的重塑的过程。

[0008] 所述缓解是指在一定剂量和时间范围内，京尼平苷的刺激作用使成纤维细胞和损伤骨骼 肌腓肠肌组织中的促纤维化基因collagen I(Col I)、Vimetin(Vim)、α-smooth muscle actin (α-SMA)和Smad4的表达相较于不做处理时显著下降，也使得骨骼肌细胞中由于受损增 加的胶原纤维和ColⅠ的含量也显著降低。

[0009] 所述京尼平苷的来源可以是：栀子粕，栀子果，杜仲，白花蛇舌草、黄连解毒汤等。

[0010] 所述组合物，还包括药学上接受的辅料，包括溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、 着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫 味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、 缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释 剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。

[0011] 所述化合物或者组合物，还可以用于制备用于治疗骨骼肌慢性疾病的药物，或者制备用 于治疗或祛除骨骼肌纤维化导致的疤痕组织的药物，或者制备用于治疗肌肉损伤的药物，或 者制备用于祛除皮肤疤痕组织的化妆品。

[0012] 本发明用含有京尼平苷的栀子粕水提物和醇提物来处理C2C12成肌细胞，发现粗提物可 以抑制纤维化进程。用京尼平苷标品来刺激C2C12成肌细胞，结果表明京尼平苷可以明显减 轻成纤维细胞的纤维化程度。本发明通过建立挫伤导致骨骼肌损伤的小鼠模型，腹腔注射京 尼平苷标品对小鼠进行治疗，证明了京尼平苷在受损骨骼肌中发挥抗纤维化作用。我们发现 用TGF-β和Smad4刺激过后的C2C12成肌细胞，纤维化程度明显增加，然而再用京尼平苷处 理后，相较于没处理的，纤维化水平显著下降。可见，京尼平苷缓解骨骼肌纤维化的作用机 制可能与TGF-β/Smad4信号通路密切相关。

附图说明

[0013] 图1京尼平苷的化学结构式。

[0014] 图2京尼平苷在未作处理的栀子粕中的浓度与含量与经水提或醇提处理后的浓度与含 量。

[0015] 图3 C2C12细胞纤维化相关基因在栀子粕水提、醇提物的作用下蛋白和mRNA水平的表 达变化。

[0016] (A)用栀子粕水提、醇提物处理C2C12肌管细胞12h(水提物、醇提物中京尼平苷的 浓度为0.4mg/mL)，用二甲基亚砜(DMSO)作为对照。通过免疫印迹分析(western blot) 测定α-SMA、ColⅠandVim的蛋白质水平，GAPDH是内参。(B-D)通过实时定量荧光 PCR(RT-qPCR)检测ColⅠ、Vim和α-SMA的mRNA水平。数据用平均值±标准误表 示，每组三次平行。与对照相比，*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001(T检验)。

[0017] 图4不同浓度京尼平苷对C2C12细胞纤维化相关基因在蛋白和mRNA水平中的表达变 化。

[0018] (A-C，E)用不同浓度(0,0.05,0.1,0.2,0.4,0.8mg/mL)的京尼平苷刺激C2C12肌管 细胞12h，用RT-qPCR分析α-SMA、ColⅠ、Vim和Smad4的mRNA水平。数据用平均值± 标准误表示，每组三次平行。与对照相比，*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001(T检验)。 (D，F)同样的浓度梯度下，通过western blot测定α-SMA、ColⅠ、Vim和Smad4的蛋白 质水平，GAPDH是内参。

[0019] 图5京尼平苷处理不同时间后C2C12细胞纤维化相关基因在蛋白和mRNA水平中的表 达变化。

[0020] (A-C，E)用0.4mg/mL的京尼平苷分别处理C2C12肌管细胞0、1、2、4、8、12h， 用RT-qPCR分析α-SMA、ColⅠ、Vim和Smad4的mRNA水平。数据用平均值±标准误表 示，每组三次平行。与对照相比，*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001(T检验)。(D，F) 同样的时间梯度下，通过western blot测定α-SMA、ColⅠ、Vim和Smad4的蛋白质水平， GAPDH是内参。

[0021] 图6京尼平苷对小鼠骨骼肌损伤导致的纤维化的改善作用。(A)对骨骼肌急性损伤模型 小鼠的腓肠肌(时间点0、7、14和21天)进行苏木精与苏红(HE)染色(n＝3)(显微镜20 倍，20X)。(B)对骨骼肌急性损伤模型小鼠的腓肠肌(时间点0、7、14和21天)进行天 狼腥红染色(n＝3)(20X)。(C)对骨骼肌急性损伤模型小鼠的腓肠肌(时间点0、7、14和 21天)进行免疫组化(ColⅠ抗体)染色(n＝3)(20X)。(D)对骨骼肌急性损伤模型小鼠的 腓肠肌(时间点0、7、14和21天)进行HE染色(n＝3)(20X)，Con为空白对照组，未作 处理的损伤组；Geni为京尼平苷(geniposide)处理组，剂量为25mg/kg/d(根据小鼠体重)。 (E)对骨骼肌急性损伤模型小鼠的腓肠肌(时间点0、7、14和21天)进行天狼腥红染色(n＝3) (20X)，Con为空白对照组，未作处理的损伤组；Geni为京尼平苷处理组，剂量为25mg/kg/d (根据小鼠体重)。(F)对骨骼肌急性损伤模型小鼠的腓肠肌(时间点0、7、14和21天)进 行免疫组化(ColⅠ抗体)染色(n＝3)(20X)，Con为空白对照组，未作处理的损伤组；Geni 为京尼平苷处理组，剂量为
25mg/kg/d(根据小鼠体重)。(G，I)通过Western blot分析急 性损伤小鼠(14天)胫骨前肌组织中α-SMA、ColⅠ、Vim和Smad4中的蛋白水平，GAPDH 是内参。Con为空白对照组，未作处理的损伤组；Geni为京尼平苷处理组，剂量为25mg/kg/d (根据小鼠体重)(n＝3)。(H)RT-qPCR分析急性损伤小鼠(14天)腓肠肌中α-SMA、Vim 和ColⅠ的mRNA水平，数据用平均值±标准误表示，每组三次平行。与对照相比，*，P<0.05； **，P<0.01；***，P<0.001(T检验)。Con为空白对照组，未作处理的损伤组；Geni为京尼 平苷处理组，剂量为25mg/kg/d(根据小鼠体重)(n＝3)。

[0022] 图7京尼平苷对TGF-β刺激的C2C12细胞纤维化相关基因在蛋白和mRNA水平中的表 达变化。

[0023] (A-C，E)用TGF-β(20ng/ml)刺激C2C12肌管细胞，再用0.4mg/mL的京尼平苷刺 激12h，检测在qPCR上α-SMA、ColⅠ、Vim和Smad4的mRNA表达。Con为DMSO处理 的空白对照组，TGF-β为TGF-β刺激组，TGF-β+Geni为TGF-β和geniposide共同刺激组。数 据用平均值±标准误表示，每组三次平行。与对照相比，*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001 (T检验)。(D，F)用TGF-β(20ng/ml)刺激C2C12肌管细胞，再用0.4mg/mL的京尼平 苷刺激12h，检测α-SMA、ColⅠ、Vim和Smad4的蛋白水平表达。GAPDH是内参。不同处 理组，“+”代表存在，“-”代表不存在。

[0024] 图8京尼平苷对Smad4刺激的C2C12细胞纤维化相关基因在蛋白和mRNA水平中的表 达变化。

[0025] (A)将Smad4转染进C2C12肌管细胞，再用0.4mg/mL的京尼平苷刺激24h，通过Western blot分析Smad4、Col I、α-SMA和Vim的蛋白表达，GAPDH为内参。不同处理组，“+”代 表存在，“-”代表不存在。(B)将Smad4转染进C2C12肌管细胞，再用0.4mg/mL的京尼平 苷刺激24h，通过RT-qPCR分析Col I、α-SMA和Vim的mRNA表达。Control+Vector为DMSO 空白对照组，Geni+Vector为未转染Smad4京尼平苷处理组，Geni+Smad4为转染Smad4后京 尼平苷处理组。数据用平均值±标准误表示，每组三次平行。与对照相比，*，P<0.05；**，  P<0.01；***，P<0.001(T检验)。

具体实施方式

[0026] 实施例1京尼平苷的提取及环节骨骼肌纤维化作用的验证

[0027] 1实验方法

[0028] 1.1栀子粕水提物、醇提物的制备方法

[0029] (1)栀子粕水提物的制备

[0030] 将栀子粕磨粉、过60目筛。称15g栀子粕粉末并加入150mL去离子水在 60℃水浴中浸提1h。过滤后，留上清液，再在滤渣中加入100mL去离子水，60℃ 水浴1h。同样地，第三次浸提是在滤渣中加入50mL去离子水。水浴1h结束后， 混合所有上清液，冷却，4000rpm离心10min，收集上清液。用大孔吸附树脂 HPD-100A进行纯化。先对HPD-100A大孔树脂进行预处理：用95％乙醇进行动 态洗脱，乙醇用量4BV(柱床体积)，以2BV/h的速度过柱(如有气泡产生，须 赶出气泡)，然后用蒸馏水以2BV/h的速度淋洗树脂至流出液在烧杯中无明显乙 醇气味时为止，最终水位要保持在树脂层面以上，以免干柱。取一部分预处理 过的HPD-100A树脂，对上清液进行静态吸附12h，再用2BV的去离子水、2BV 的5％的乙醇、2BV的10％的乙醇和5BV的20％乙醇进行动态连续洗脱，洗脱 流速为1BV/h，其中收集20％乙醇洗脱液，50℃旋转蒸发至乙醇全部除去。接着 进行冷冻干燥，得到的粉末即为栀子粕水提物，放入-20℃冰箱待用。

[0031] (2)栀子粕醇提物的制备

[0032] 将栀子粕磨粉、过60目筛。称取40g栀子粕粉末，加入400mL60％乙醇， 室温浸提8h，过滤收集上清液。再在滤渣中加入200mL60％乙醇浸提8h，过滤 收集上清液。第三次加入100mL60％乙醇。混合所有滤液，4000rpm离心10min， 收集上清液，然后50℃旋转蒸发至乙醇全部除去。用大孔吸附树脂HPD-100A 进行纯化。取一部分预处理过的HPD-100A树脂，对上清液进行静态吸附12h， 再用2BV的去离子水、2BV的5％的乙醇、2BV的10％的乙醇和
5BV的20％乙 醇进行动态连续洗脱，洗脱流速为1BV/h，其中收集20％乙醇洗脱液，50℃旋转 蒸发至乙醇全部除去。接着进行冷冻干燥，得到的粉末即为栀子粕醇提物，放 入-20℃冰箱待用。

[0033] 通过高效液相色谱测得栀子粕水提物和醇提物中京尼平苷的含量，分别为 674mg/g和421mg/g。色谱条件如下：

[0034] C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：甲醇：0.05％的磷酸水溶液(梯 度洗脱0-20min:10:90；20-30min:50：50；30-40min:20:80；40-45min:10:90)柱 温30℃；检测波长
238nm；流速1.0mL/min；进样量10μL。京尼平苷标准品购自 Sigma公司。

[0035] 1.2细胞培养与转染

[0036] C2C12小鼠成肌细胞置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养，生长在含有 10％胎牛血清(FBS)和1％的双抗(P/S)的DMEM培养基中。C2C12细胞和 原代成肌细胞诱导分化为肌纤维时，需要将细胞培养基中FBS的成分更换为2％ 马血清(HS)即可。

[0037] 对C2C12细胞进行如下处理：(1)待C2C12细胞分化第4天，分别用一定 浓度的水提物(112.4mg/mL)和醇提物(154.0mg/mL)刺激细胞12h，空白对照 加入DMSO；(2)用0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8mg/mL的京尼平苷分别刺激细 胞12h；(3)用0.4mg/mL的京尼平苷分别刺激细胞0、1、2、4、8、12h；(4) 用20ng/ml的TGF-β刺激细胞，再用0.4mg/mL的京尼平苷刺激
12h；(5)用 Lipofectamine LTX和Plus试剂进行细胞转染，在细胞中转入质粒Smad4，再用 
0.4mg/mL的京尼平苷刺激24h。

[0038] 1.3动物实验

[0039] 实验中所用2-3周的雄鼠饲养在SPF(无特定病原体)级动物房中，动物可以 自由进食和饮水(由上海斯莱克实验动物中心提供)。动物房保持恒温22±3℃， 相对湿度35±5％，12小时为周期昼夜循环。模式动物的使用和操作均严格按照 江南大学食品科学与技术学院动物管理和使用委员会的规程进行。

[0040] 待雄鼠适应了新环境之后，将其随机分为七组。一组小鼠作为空白对照， 不做砸伤处理也不注射京尼平苷，另外六组要建立腓肠肌急性损伤模型：腹腔 注射水合氯醛(0.7ml/100g)麻醉后，将小鼠的左右后肢分别固定在平板上，并 将15g不锈钢球(直径2cm)从固定1米的高度砸伤小鼠后肢肌肉，连续砸两 次。其中三组根据体重每天注射京尼平苷标品(25mg/kg)，另外三组空白对照不 给药，连续21天。在用京尼平苷治疗第7、12、21天时，处死一组药物处理组 和一组空白组，其中21天时处死所有小鼠，取左右后肢中的腓肠肌、比目鱼肌、 胫骨前肌，将右腿腓肠肌固定在10％福尔马林中用于组学分析，其余组织放入 用液氮立即冷冻，放入-80℃保存。

[0041] 1.4免疫印迹分析(western blot)

[0042] 按照标准方案，检测收获的C2C12细胞和腓肠肌组织中Col I、Vim、α-SMA 和Smad4的表达。

[0043] 1.5RNA提取和实时定量荧光PCR

[0044] 使用Trizol试剂从C2C12细胞和组织样品中提取总RNA，并用Nanodrop 对RNA浓度进行测定。使用Prime Script RT系统(Takara)合成第一链cDNA。 实时定量PCR在ABI STEP-ONE7900RT-PCR系统上进行。每个样品做三次平 行。使用的特定引物序列示于下表。

[0045]

[0046] 1.6组学分析

[0047] 将小鼠GAS组织在10％福尔马林中和液中固定72h，然后通过酒精梯度 (30-100％)让GAS脱水，清洗，最后包埋于石蜡中，然后使用切片机垂直切 成厚度为5μm的肌肉纤维切片。使用苏木精和伊红(HE)和天狼星红(Sirius Red) 染色观察在挫伤后7、14和21天收获的GAS样品。电转染后4天收集的GAS 样品切片，使用Col 1抗体来进行免疫组织化学染色观察。用倒置光学显微镜来 观察切片。

[0048] 2实验结果

[0049] 2.1栀子粕粗提物对C2C12肌管细胞中的纤维化过程起到抑制作用

[0050] 从图3的蛋白质和mRNA水平可以看出，水提物和醇提物对C2C12细胞的 处理，使促纤维化基因Col I，Vim和α-SMA的表达相较于空白对照显著下降。

[0051] 2.2京尼平苷可以抑制C2C12肌管细胞的纤维化进程

[0052] 如图4A-D，图5A-D所示，在不同浓度、不同时间的京尼平苷标品刺激下， C2C12成肌细胞中促纤维化基因Col I，Vim和α-SMA的表达相较于空白对照显 著下降，且Col I，Vim和α-SMA的表达水平呈剂量和时间依赖性下降。

[0053] 2.3京尼平苷可以减轻骨骼肌纤维化

[0054] 我们进一步验证京尼平苷对骨骼肌损伤小鼠的治疗作用。如图6A-C可以看 出，急性骨骼肌挫伤后，细胞形态被严重破坏。如图6D-F所示，与不做处理组 相比，京尼平苷的治疗组，细胞形态更好，胶原纤维和Col Ⅰ的含量也减少地 更快，对骨骼肌损伤有明显的改善作用。从蛋白质和mRNA水平(图6G-F)也 可以看出，组织中Col I，Vim和α-SMA的表达也在京尼平苷作用下明显下降。

[0055] 2.4京尼平苷可能是通过TGF-β/Smad4信号通路在骨骼肌中发挥抗纤维化 作用[0056] 用TGF-β刺激C2C12成肌细胞，Col I，Vim和α-SMA的表达明显上升(图7A-D)，再用京尼平苷刺激后，这些促纤维化基因的表达明显下降，可见，京尼 平苷可以抑制TGF-β引起的纤维化进程。从图7E-F可以看出，TGF-β的刺激会 使其下游受体激酶Smad4的表达相较于空白对照显著增加，而京尼平苷的刺激 会使Smad4的表达下降，京尼平苷的抗纤维化作用可能与TGF-β/Samd4信号通 路相关。从图4的E-F、图5的E-F可以看出，京尼平苷刺激C2C12细胞，Smad4 在mRNA和蛋白水平上的表达均呈剂量依赖性和时间依赖性下降，此外，在体 内实验中，京尼平苷的治疗也使Smad4的表达明显下降(图6I)。紧接着，用 Smad4刺激C2C12细胞，增加了Smad4，Col I，α-SMA和Vim的蛋白质和mRNA 水平表达，同时京尼平苷的刺激可以降低细胞中Smad4，Col I，α-SMA和Vim 的表达(图8A-B)。此外，qPCR水平显示栀子苷治疗拯救了抗纤维化表型(图8B)。