一种CD132基因缺失的免疫缺陷动物模型的制备方法及应用转让专利
申请号 : CN201810215804.1
文献号 : CN108467873B
文献日 : 2020-03-13
发明人 : 沈月雷 , 白阳 , 张美玲 , 姚佳维 , 黄蕤 , 郭雅南
申请人 : 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司 , 北京百奥赛图基因生物技术有限公司
摘要 :
本发明公开了一种基于CRISPR/Cas9技术获得能够特异的靶向CD132基因的sgRNA、CD132基因缺失的免疫缺陷动物模型的制备方法及应用。本发明还保护一种特异靶向敲除CD132基因的CRISPR/Cas9系统、一种制备获得免疫缺陷动物模型的sgRNA质粒的方法、一种免疫缺陷动物模型的制备方法以及相关应用。本发明提供了一种适合人源细胞或组织移植的工具小鼠，一种新的人源化动物模型制备方法，有利于相关疾病的研究，为生物医学实验的开展提供了有效的技术手段。
权利要求 :
1.一种免疫缺陷动物模型构建的方法，其特征在于，使用sgRNA敲除免疫相关基因CD132的第1-8外显子，获得缺少T、B和NK细胞，并且表达CD3+ CD4+、CD3+ CD8+、CD3- CD19+表面标记分子的白细胞比例低于0.5%，表达CD3+、CD3- CD49b+表面标记分子的白细胞比例低于2%的免疫缺陷动物模型，其中，使用的sgRNA序列如SEQ ID NO：1-4任一序列，和SEQ ID NO：5-8任一序列所示。
2.根据权利要求1所述的免疫缺陷动物模型构建的方法，其特征在于，所述SEQ ID NO：
1-4识别靶基因上的5’端靶位点，SEQ ID NO：5-8识别靶基因上的3’端靶位点；5’端靶位点位于免疫相关基因的第1外显子上游或1号外显子上，3’端靶位点位于第8外显子上。
3.根据权利要求1所述的免疫缺陷动物模型构建的方法，其特征在于，所述sgRNA序列如SEQ ID NO：3 和SEQ ID NO：6所示。
4.根据权利要求1所述的免疫缺陷动物模型构建的方法，其特征在于，所述免疫相关基因为CD132基因，Gene ID: 16186。
5.根据权利要求1-4任一所述的免疫缺陷动物模型构建的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）提供一种细胞，所述细胞包含一种或多种sgRNA载体或sgRNA载体的体外转录产物；
（2）将所述细胞在培养液中进行培养；
（3）将培养后细胞移植至受体雌性非人类哺乳动物的输卵管内，允许所述细胞在所述雌性非人类哺乳动物的子宫中发育；
（4）鉴定步骤（3）的怀孕雌性的后代基因改造人源化非人类哺乳动物中的种系传递。
6.根据权利要求1-4任一所述的免疫缺陷动物模型构建的方法，其特征在于，制备获得免疫缺陷动物模型的sgRNA载体的方法，包括以下步骤：（1）提供一种sgRNA序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列，所述sgRNA序列靶向非人动物CD132基因，同时所述sgRNA在待改变的非人动物CD132基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则；
（2）合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，并将所述片段DNA通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；
（3）将步骤（1）获得的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤（2）所述的pT7-sgRNA载体的双链；
（4）将步骤（3）中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。
7.根据权利要求6所述的免疫缺陷动物模型构建的方法，其特征在于，所述制备获得免疫缺陷动物模型的sgRNA载体的方法，包括如下步骤：（1）将序列如SEQ ID NO：1-4所示的任一项sgRNA靶序列和SEQ ID NO：5-8所示的任一项sgRNA靶序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；
（2）合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，其中含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA如SEQ ID NO：13所示，将上述片段依次通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体pHSG299上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；
（3）分别合成步骤（1）中所述的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤（2）所述的pT7-sgRNA载体的双链；
（4）将步骤（3）中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体：pT7-IL-3质粒和pT7-IL-6质粒。
8.根据权利要求7所述的免疫缺陷动物模型构建的方法，其特征在于，所述的步骤（1）为将序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6所示的sgRNA，去除3’端AGG三个碱基，在其5’端加上CACC或CACCG得到正向寡核苷酸；根据选择的sgRNA，去除3’端AGG三个碱基，获得对应DNA的互补链，并且在其5’端加上AAAC，3’端可选的加上C得到反向寡核苷酸；所述的正向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11所示；所述的反向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12所示，其中SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10为A组，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12为B组。
9.根据权利要求7或8所述的免疫缺陷动物模型构建的方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步：按照权利要求6-8任一所述的步骤（1）-（4），获得pT7-IL-3质粒和pT7-IL-6质粒；
第二步：将pT7-IL-3、pT7-IL-6质粒的体外转录产物和Cas9 mRNA进行混合，将混合液注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中，将注射后的受精卵转移至培养液中进行培养，挑选发育良好的细胞期胚胎移植至受体母鼠的输卵管中继续发育，得到F0代小鼠；
第三步：将F0代小鼠剪尾提取基因组利用PCR技术进行检验，验证细胞中的CD132基因是否被成功敲除，从而获得免疫缺陷小鼠。
10.根据权利要求9所述的免疫缺陷动物模型构建的方法，其特征在于，所述第三步中使用的PCR技术的检测引物对序列如SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示。
11.根据权利要求1-4、7、8和10任一所述的方法，其特征在于，所述免疫缺陷动物为非人类哺乳动物，所述免疫缺陷动物为啮齿类动物，所述免疫缺陷动物为大鼠或小鼠。
12.一种能够特异的靶向CD132基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA序列靶向非人动物CD132基因，同时所述sgRNA在待改变的非人动物CD132基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则，所述的sgRNA序列如SEQ ID NO：
1-8所示；其中，SEQ ID NO：1-4识别靶基因上的5’端靶位点，SEQ ID NO：5-8识别靶基因上的3’端靶位点。
13.根据权利要求12所述的能够特异的靶向CD132基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA序列的5’端靶位点位于免疫相关基因的第1外显子上游或1号外显子上，3’端靶位点位于第8外显子上。
14.根据权利要求12或13所述的能够特异的靶向CD132基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA序列如SEQ ID NO：3 和SEQ ID NO：6所示。
15.一种编码权利要求12-14任一所述sgRNA的DNA分子。
16.根据权利要求15所述的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子的双链序列分别如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10，或SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示。
17.一种包含权利要求12-14任一所述的sgRNA序列的载体。
18.一种构建免疫缺陷动物模型的含有权利要求12-14任一所述sgRNA序列的载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）提供一种sgRNA序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列，所述sgRNA序列靶向非人动物CD132基因，同时所述sgRNA在待改变的非人动物CD132基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则；
（2）合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，并将所述片段DNA通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；
（3）将步骤（1）获得的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤（2）所述的pT7-sgRNA载体的双链；
（4）将步骤（3）中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。
19.根据权利要求18所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将序列如SEQ ID NO：1-4所示的任一项sgRNA靶序列和SEQ ID NO：5-8所示的任一项sgRNA靶序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；
（2）合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，其中含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA如SEQ ID NO：13所示，将上述片段通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；
（3）分别合成步骤（1）中所述的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤（2）所述的pT7-sgRNA载体的双链；
（4）将步骤（3）中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。
20.根据权利要求19所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）为将序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6所示的sgRNA，去除3’端AGG三个碱基，在其5’端加上CACC或CACCG得到正向寡核苷酸；根据选择的sgRNA，去除3’端AGG三个碱基，获得对应DNA的互补链，并且在其
5’端加上AAAC，3’端可选的加上C得到反向寡核苷酸；所述正向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：
9或SEQ ID NO：11所示，反向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12所示，其中SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10为A组，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12为B组。
21.一种细胞，其特征在于，所述细胞包含一种或多种权利要求12-14任一所述的sgRNA，权利要求15-16任一所述的DNA分子，权利要求17所述的sgRNA序列的载体，和/或权利要求17所述的sgRNA序列的载体的体外转录产物。
22.权利要求12-14任一所述的sgRNA、权利要求15-16任一所述的DNA分子、权利要求17所述的sgRNA序列的载体或权利要求21所述的细胞在敲除CD132基因中的应用或在构建CD132基因缺失的免疫缺陷动物模型中的应用。
23.一种CD132基因缺失细胞株，其特征在于，使用权利要求12-14任一所述的能够特异的靶向CD132基因的sgRNA、权利要求15-16任一所述的DNA分子、权利要求17所述的sgRNA序列的载体或权利要求21所述的细胞制备获得。
24.一种制备免疫缺陷型人源化动物模型的方法，其特征在于，
(a) 利用权利要求1-11任一所述的方法构建免疫缺陷动物模型；
(b) 将步骤(a)获得的免疫缺陷动物模型与其它基因人源化动物交配、体外授精，基于步骤(a)获得的免疫缺陷动物模型进一步进行基因编辑，或将人组织、细胞移植至步骤（a）获得的免疫缺陷动物模型中，并进行筛选，得到免疫缺陷型人源化动物模型。
25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述其它基因人源化动物选自基因CD137、LAG-3、CTLA-4、TIM-3、BTLA、4-1BB、CD27、CD28、CD47、TIGIT、GITR、OX40或PD-L1人源化的基因人源化动物。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，将步骤(a)获得的免疫缺陷型动物模型与多基因人源化动物交配或基于步骤(a)获得的免疫缺陷动物模型进一步进行基因编辑得到免疫缺陷型多基因人源化动物模型。
27.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，所述多基因人源化动物是双基因人源化动物、三基因人源化动物、四基因人源化动物、五基因人源化动物、六基因人源化动物、七基因人源化动物、八基因人源化动物或九基因人源化动物。
28.根据权利要求24、25和27任一所述的方法，其特征在于，所述免疫缺陷型人源化动物模型表达人源化CD137和/或人源化PD-1基因编码的蛋白质；同时，CD132基因的第1-8外显子被敲除；获得缺少T、B和NK细胞，并且表达CD3+ CD4+、CD3+ CD8+、CD3- CD19+表面标记分子的白细胞比例低于0.5%，表达CD3+、CD3- CD49b+表面标记分子的白细胞比例低于2%的免疫缺陷动物模型。
29.一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，其特征在于，所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于权利要求1-11任一所述的方法构建的免疫缺陷动物模型、权利要求24-28任一所述的方法制备的免疫缺陷型人源化动物模型。
30.一种组织或器官或其培养物，其特征在于，所述组织或器官或其培养物来源于权利要求1-11任一所述的方法构建的免疫缺陷动物模型、权利要求24-28任一所述的方法制备的免疫缺陷型人源化动物模型。
31.根据权利要求30所述的组织或器官或其培养物，其特征在于，所述的组织或器官或其培养物为脾脏、肿瘤或其培养物。
32.一种荷瘤后的瘤组织，其特征在于，所述的荷瘤后的瘤组织来源于权利要求1-11任一所述的方法构建的免疫缺陷动物模型、权利要求24-28任一所述的方法制备的免疫缺陷型人源化动物模型。
33.一种特异靶向敲除CD132基因的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，使用含有权利要求
12-14任一所述的能够特异的靶向CD132基因的sgRNA的DNA序列。
34.一种能够特异的靶向CD132基因的核酸分子试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求12-14任一所述的sgRNA。
35.如权利要求34所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Cas9 mRNA。
36.来源于权利要求1-11任一所述的方法构建的免疫缺陷动物模型或权利要求24-28任一所述的方法制备的免疫缺陷型人源化动物模型在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用。
37.来源于权利要求1-11任一所述的方法构建的免疫缺陷动物模型或权利要求24-28任一所述的方法制备的免疫缺陷型人源化动物模型在生产和利用动物疾病模型，用于人源细胞移植、免疫系统重建、病原学研究，和/或，用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用。
38.来源于权利要求1-11任一所述的方法构建的免疫缺陷动物模型或权利要求24-28任一所述的方法制备的免疫缺陷型人源化动物模型在筛选、验证、评价或研究免疫缺陷药物、组合药物药效研究，免疫缺陷相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的应用。
39.根据权利要求36-38任一所述的应用，其特征在于，所述应用包括使用人PBMC进行免疫系统重建后，对抗人单抗、双抗或联合用药的药效评价、药物筛选，或人CAR-T体内评估、筛选。
40.一种人用药剂筛选或评价的方法，其特征在于，包括将人肿瘤细胞移入已有人PMBC重建的权利要求1-11和24-28任一所述的方法获得的动物模型体内，向移入人肿瘤细胞的动物模型给予候选药剂，对给予药剂的动物模型进行药效检测和比较。
41.根据权利要求40所述的方法，其特征在于，所述候选药剂为单抗、双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。
42.根据权利要求40或41所述的方法，其特征在于，所述检测包括测定肿瘤细胞的存活力和/或增殖速率；所述检测的方法为流式细胞检测和/或动物活体成像检测。
43.一种权利要求1-11和24-28任一所述的方法制备的动物模型的应用，其特征在于，包括利用基因编辑、交配或体外授精的方式敲除权利要求1-11和24-28任一所述的方法制备的动物模型体内的B2m基因，并对其后代进行筛选。
44.一种权利要求1-11和24-28任一所述的方法制备的动物模型的应用，其特征在于，利用基因编辑方法先敲除NOD/scid小鼠体内的Foxn1基因得到NOD/scid nude小鼠后，再与权利要求1-11和24-28任一所述的方法制备的动物模型进行交配或体外授精，并对其后代进行筛选。
说明书 :
一种CD132基因缺失的免疫缺陷动物模型的制备方法及应用
技术领域
[0001] 本申请属于动物基因工程领域，涉及CRISPR/Cas9技术，具体涉及一种基于CRISPR/Cas9基因敲除技术获得免疫缺陷动物模型的方法以及用于特异性靶向CD132基因的sgRNA。
背景技术
[0002] CRISPR/Cas9是近几年发现的由RNA向导的Cas9核酸酶靶向目的基因进行编辑的新兴技术。在CRISPR/Cas9系统中，crRNA(CRISPR-derived RNA)通过DNA碱基配对原理与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成双链RNA，指导Cas9蛋白在crRNA向导的DNA序列靶向目的位点切断双链DNA。CRISPR/Cas9系统可以实现在真核细胞中高度灵活且特异的基因组编辑，是目前基因组编辑领域最受欢迎的新一代基因组编辑技术，目前该技术已被用于构建各类基因敲除细胞系和基因敲除动物模型。
[0003] 基于CRISPR/Cas9系统介导的第三代基因组编辑技术，已成功应用于动物、植物和微生物等诸多物种的基因组改造。在基因组编辑技术中，sgRNA指导Cas9蛋白在目的基因的PAM(保守碱基序列为NGG)上游切割，产生DNA双链断裂(Double strands break，DSB)。DSB产生以后，细胞主要通过两种方式进行修复：同源重组(Homologous recombination,HR)和非同源末端连接(Nonhomologous end joining，NHEJ)。多细胞真核生物主要通过NHEJ的方式修复DSB。由于NHEJ只是将断裂的DNA片段进行简单的加工之后连接起来，常常会在断裂位点产生碱基的缺失或插入，造成基因突变。如何提高CRISPR/Cas9技术的基因组编辑效率和最大限度降低脱靶风险一直是本领域的研究热点，而使用高效且特异的sgRNA(Small guide RNA)是基因组改造成功的关键性因素之一。
[0004] 免疫缺陷动物(immunodeficient animal)是指由于先天性遗传突变或用人工的方法造成一种或多种免疫系统组成成分缺陷的动物。以裸鼠为代表的各类免疫缺陷动物作为“活试管”，因其体内免疫系统组成成分缺陷，机体免疫功能低下，对异体或异种移植物较少发生排斥反应。因此在医学领域，特别是肿瘤研究中通过免疫缺陷动物而形成的各类人源化癌症模型已经成为一种常规、重要的研究工具。此外，有些免疫缺陷动物的临床表现、病理组织变化及实验室检查的特异指标与人类的一些免疫缺陷病极为相似，如先天性胸腺发育不全等，因此免疫缺陷动物也是免疫学研究的重要模型(田枫,张阔,郑振辉，免疫缺陷大、小鼠在肿瘤学研究中的应用及实验中常见问题分析[J]，中国免疫学杂志，2016(2):214-217.)。
[0005] 先天性遗传突变的免疫缺陷动物多为单一功能缺陷的免疫小鼠，且多数免疫缺陷程度不深，严重限制了其应用范围。一直以来，借助生物遗传工程的研究手段，通过交配的方式将不同类型的基因异常整合在同一动物体上，人工建立了许多联合免疫功能缺陷动物(combined immundeficienc model)。NOD/SCID(非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷)小鼠是在SCID(重症联合免疫缺陷)小鼠的基础上与非肥胖性糖尿病小鼠(NOD)品系经多代回交得到的免疫缺陷鼠。NOD/SCID小鼠既有先天免疫缺陷，又有T和B淋巴细胞缺乏，可用于移植多种异源肿瘤细胞，且较少发生排斥反应及移植物抗宿主病(GVHD)。但NOD/SCID鼠寿命较短，大部分小鼠8个月后出现胸腺淋巴瘤或死亡，不能进行长期追踪。已有研究表明NOD/SCID鼠仍残留一定水平的NK细胞活性，且对放射高度敏感。此外，血液学研究中还发现，NOD/SCID鼠的造血微环境主要为鼠源性，因而在一定程度上阻碍了人HSC的植活和发育(于文俊,杨文华,史哲新等，NOD/SCID小鼠在实验血液学研究中的应用[J]，中国实验血液学杂志,2008,16(4):964-968.)。
[0006] 白细胞介素2(IL-2)是一种抗原激活作用发生后产生的多效细胞因子，不仅可以驱动T细胞的增殖以及调节效应细胞的分化，而且还可以限制可能具有危险性的自身免疫反应，在免疫应答中起着重要的作用。IL-2通过与免疫细胞膜上的IL-2R结合而发挥作用。IL-2R有3个亚单元，分别为IL-2Rα链(CD25)、IL-2Rβ链(CD122)和IL-2Rγ链(CD132)。其中IL-2Rγ是IL-4、IL-7-IL-9、IL-15、IL21等多种细胞因子受体共有的功能组成单元，即共有链。IL-2Rγ链不仅为维持IL-2R复合体完整性及IL-2/IL-2R复合物内化
(internalization)所需，而且是联系胞膜表面细胞因子结合区域与下游胞内内信号传导分子之间的纽带，IL-2Rγ链的完整性对于机体免疫功能而言至关重要。
(internalization)所需，而且是联系胞膜表面细胞因子结合区域与下游胞内内信号传导分子之间的纽带，IL-2Rγ链的完整性对于机体免疫功能而言至关重要。
[0007] 编码人IL-2Rγ的基因CD132位于Xq13，NCBI编号为3561，含有8个外显子，编码含369个氨基酸的人IL-2Rγ蛋白质，其cDNA与小鼠有79％的同源性。CD132基因突变已被证实是X连锁严重联合免疫缺陷(XSCID)的病因。XSCID是一种危及儿童生命的遗传性免疫缺陷疾病，患者免疫系统异常表现为T、NK细胞缺失或显著减少、B细胞功能异常。小鼠CD132基因位于XD，NCBI编号16186。
[0008] 目前已有利用同源重组的方式制备的CD132基因突变小鼠，经研究发现该小鼠胸腺发育不全，T细胞和NK细胞大量缺乏，同时B细胞也大量缺乏，这一点与人XSCID不同，因为小鼠体内B细胞的发育需要IL-7。此外，该小鼠缺乏可见的肠相关淋巴组织，基本上不存在外周淋巴结。尽管缺乏IL-2Rγ的人和小鼠存在差异，但上述小鼠的研究结果明确了IL-2Rγ在淋巴发育中的重要性，IL-2Rγ链功能的损失对小鼠的免疫系统有显著影响(DiSanto JP,Proc Natl Acad Sci USA.1995；92:377–381；Cao X,.Immunity.1995；2:223–238；Ohno K,.Blood.1996；87:956–969)。因此我们预计，在NOD/SCID背景小鼠中对该基因进行完全敲除处理，可进一步提升NOD/SCID小鼠的免疫缺陷程度。
[0009] 目前国际上类似的重度免疫缺陷鼠有美国杰克逊实验室(Jackson Laboratory，以下简称JAX)和日本中央实验动物研究所(Central Institute for Experimental Animals，以下简称CIEA)各自独立地将自发I型糖尿病NOD小鼠、重症联合免疫缺陷CB17-SCID小鼠、以及129或C57BL/6背景的IL-2Rγ基因突变的小鼠杂交，得到缺少成熟T、B和NK细胞的、适合异种组织移植的重度免疫缺陷鼠，分别命名为NSG小鼠和NOG小鼠。利用遗传交配及多代回交纯化方法构建免疫缺陷小鼠品系存在周期漫长(需要与NOD-SCID小鼠回交至少10代以上，至少2年时间)、背景不纯(多背景小鼠杂交、回交)、实验结果可重复性差等缺陷。已有文献表明，基因敲除小鼠的表型具有遗传背景依赖性(Laboratory Animal Science.1999Apr；49(2):137-43.)，而NOG小鼠因其制备过程使用的IL-2Rγ基因突变的小鼠中CD132基因并未完全缺失，仍可能结合多种细胞因子而影响实验结果(Nat Rev Immunol.2007Feb；7(2):118-30.；Blood.2010Jul 15；116(2):193-200)。此外，有关文献和资料也指出，NSG和NOG小鼠均存在一定程度的功能性T、B、NK细胞残留。
[0010] 综上所述，本领域仍需一种更为简便的方法建立遗传背景清晰、免疫缺陷程度更高、实验周期更短、实验结果更稳定一致的免疫缺陷动物模型。
[0011] 由于免疫缺陷模式动物是肿瘤临床治疗研究重要的工具和保障，本发明旨在克服现有不足，提供一种小鼠细胞中与免疫相关的CD132基因ORF区全部敲除的、免疫缺陷程度更高的小鼠。该小鼠是目前免疫缺陷程度最高，遗传背景单一，实验结果稳定可靠，寿命长(＞1.5年)等优点。本方法制备的免疫缺陷小鼠几乎没有成熟T细胞、B细胞和功能性NK细胞，细胞因子信号传递能力缺失，非常适合人造血干细胞、外周血单核细胞、人肿瘤细胞和组织等的移植和生长。而且对人源细胞和组织几乎没有排斥反应，少量细胞即可成瘤(依赖于细胞系或细胞类型)，同时也没有B淋巴细胞泄漏。除可用于人源细胞移植生长以外，还可与多种细胞因子基因人源化小鼠配合用于新的人源化动物模型研发与药效检测应用等方面。
发明内容
[0012] 首先，本发明的第一方面，涉及一种免疫缺陷动物模型构建的方法，包括敲除免疫相关基因CD132的第1外显子全部或部分、第2外显子或第1-2外显子，获得缺少T、B和NK细胞，并且表达CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD19+表面标记分子的白细胞比例低于0.5％，表达CD3+、CD3-CD49b+表面标记分子的白细胞比例低于2％的免疫缺陷动物模型。
[0013] 优选的，所述的免疫缺陷动物模型构建的方法，敲除的免疫相关基因还包括CD132基因的第3外显子、第4外显子、第5外显子、第6外显子、第7外显子或第8外显子中的一种或两种以上的组合；获得缺少T、B和NK细胞，并且表达CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD19+表面标记分子的白细胞比例低于0.5％，表达CD3+、CD3-CD49b+表面标记分子的白细胞比例低于2％的免疫缺陷动物模型。
[0014] 在本发明的一个具体实施方式中，使用sgRNA敲除免疫相关基因CD132的第1-8位外显子；获得缺少T、B和NK细胞，并且表达CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD19+表面标记分子的白细胞比例低于0.5％，表达CD3+、CD3-CD49b+表面标记分子的白细胞比例低于2％的免疫缺陷动物模型。
[0015] 在一个具体实施例中，可以使用的sgRNA序列如SEQ ID NO：1-4和/或SEQ ID NO：5-8所示，其中SEQ ID NO：1-4识别靶基因上的5’端靶位点，SEQ ID NO：5-8识别靶基因上的
3’端靶位点；5’端靶位点位于免疫相关基因的第1外显子上游或1号外显子上，3’端靶位点位于第8外显子上。
3’端靶位点；5’端靶位点位于免疫相关基因的第1外显子上游或1号外显子上，3’端靶位点位于第8外显子上。
[0016] 在一个优选的实施例中，所述sgRNA序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：6所示。
[0017] 优选的，本发明涉及的免疫相关基因为CD132基因，Gene ID:16186。
[0018] 优选的，所述的免疫缺陷动物模型构建的方法，包括如下步骤：
[0019] (1)提供一种细胞，所述细胞包含一种或多种sgRNA载体或sgRNA载体的体外转录产物；
[0020] (2)将所述细胞在培养液中进行培养；
[0021] (3)将培养后细胞移植至受体雌性非人类哺乳动物的输卵管内，允许所述细胞在所述雌性非人类哺乳动物的子宫中发育；
[0022] (4)鉴定步骤(3)的怀孕雌性的后代基因改造人源化非人类哺乳动物中的种系传递。优选的，上述用于制备获得免疫缺陷动物模型的sgRNA载体的方法，具体包括以下步骤：
[0023] (1)提供一种sgRNA序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列，所述sgRNA序列靶向非人动物CD132基因，同时所述sgRNA在待改变的非人动物CD132基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则；
[0024] (2)合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，并将所述片段DNA通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；
[0025] (3)将步骤(1)获得的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤(2)所述的pT7-sgRNA载体的双链；
[0026] (4)将步骤(3)中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。
[0027] 进一步优选的，所述制备获得免疫缺陷动物模型的sgRNA载体的方法，包括如下步骤：
[0028] (1)将序列如SEQ ID NO：1-4所示的任一项sgRNA靶序列和/或SEQ ID NO：5-8所示的任一项sgRNA靶序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；
[0029] 优选的，将序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：6所示的sgRNA，去除3’端AGG三个碱基，在其5’端加上CACC或CACCG得到正向寡核苷酸；根据选择的sgRNA，去除3’端AGG三个碱基，获得对应DNA的互补链，并且在其5’加上AAAC，3’端可选的加上C得到反向寡核苷酸，上述正向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11所示；反向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12所示，其中SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10为A组，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12为B组；
[0030] (2)合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，其中含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA如SEQ ID NO：13所示，将上述片段依次通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体pHSG299上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；
[0031] (3)分别合成步骤(1)中所述的A组和B组中的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤(2)所述的pT7-sgRNA载体的双链；
[0032] (4)将步骤(3)中A组或B组中的退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体：pT7-IL-3质粒和pT7-IL-6质粒。
[0033] 进一步优选的，一种免疫缺陷动物模型构建的方法，包括以下步骤：
[0034] 第一步：按照本发明记载的制备获得免疫缺陷动物模型的sgRNA载体的方法所述的步骤(1)-(4)，获得pT7-IL-3质粒和pT7-IL-6质粒；
[0035] 第二步：将pT7-IL-3、pT7-IL-6质粒的体外转录产物和Cas9mRNA进行混合，将混合液注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中，将注射后的受精卵转移至培养液中进行培养，挑选发育良好的细胞期胚胎移植至受体母鼠的输卵管中继续发育，得到F0代小鼠；
[0036] 第三步：将F0代小鼠剪尾提取基因组利用PCR技术进行检验，验证细胞中的CD132基因是否被成功敲除，从而获得免疫缺陷小鼠。
[0037] 其中，所述第三步中使用的PCR检测引物对序列如SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示。
[0038] 在本发明中，免疫缺陷动物可以为非人类哺乳动物。
[0039] 优选的，所述免疫缺陷动物为啮齿类动物。
[0040] 更优选的，所述免疫缺陷动物为大鼠或小鼠。
[0041] 本发明所述的免疫缺陷动物模型，所述动物基因组中CD132基因的5’端剩余不超过50bp，3’端剩余不超过3326bp。
[0042] 优选的，所述动物基因组中CD132基因的5’端剩余不超过50bp，3’端剩余不超过400bp。
[0043] 本发明的第二方面，涉及一种通过上述方法构建获得的免疫缺陷动物模型，所述免疫缺陷动物不表达内源CD132蛋白；优选的，所述免疫缺陷动物IL2受体缺失。
[0044] 本发明的第三方面，涉及一种能够特异的靶向CD132基因的sgRNA，所述sgRNA序列靶向非人动物CD132基因，同时所述sgRNA在待改变的非人动物CD132基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则；
[0045] 优选的，所述靶序列如SEQ ID NO：1-8任一所示；或
[0046] 使用的sgRNA序列如SEQ ID NO：1-8所示，其中，SEQ ID NO：1-4识别靶基因上的5’端靶位点，SEQ ID NO：5-8识别靶基因上的3’端靶位点。
[0047] 进一步优选的，5’端靶位点位于免疫相关基因的第1外显子上游或1号外显子上，3’端靶位点位于第8外显子上。最优选的，所述sgRNA序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：6所示。
[0048] 本发明的第四方面，涉及一种编码本发明所述sgRNA的DNA分子。
[0049] 优选的，所述DNA分子的DNA双链序列分别如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10，或SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示。
[0050] 本发明的第五方面，涉及一种包含上述任一sgRNA序列的载体。
[0051] 本发明的第六方面，涉及一种构建免疫缺陷动物模型的含有sgRNA序列的载体的制备方法，包括如下步骤：
[0052] (1)提供一种sgRNA序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列，所述sgRNA序列靶向非人动物CD132基因，同时所述sgRNA在待改变的非人动物CD132基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则；
[0053] (2)合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，并将所述片段DNA通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；
[0054] (3)将步骤(1)获得的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤(2)所述的pT7-sgRNA载体的双链；
[0055] (4)将步骤(3)中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。
[0056] 优选的，包括如下步骤：
[0057] (1)将序列如SEQ ID NO：1-4所示的任一项sgRNA靶序列和/或SEQ ID NO：5-8所示的任一项sgRNA靶序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；
[0058] 优选的，将序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：6所示的sgRNA，去除3’端AGG三个碱基，在其5’端加上CACC或CACCG得到正向寡核苷酸；根据选择的sgRNA，去除3’端AGG三个碱基，获得对应DNA的互补链，并且在其5’加上AAAC，3’端可选的加上C得到反向寡核苷酸，上述正向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11所示；反向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12所示，其中SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10为A组，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12为B组；
[0059] (2)合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，其中含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA如SEQ ID NO：13所示，将上述片段通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；
[0060] (3)分别合成步骤(1)中所述的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，优选为A组和B组中的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤(2)所述的pT7-sgRNA载体的双链；
[0061] (4)将步骤(3)中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。
[0062] 所述载体能够产生本发明公开的sgRNA，用于敲除免疫相关的CD132基因的第1-8位外显子。
[0063] 本发明的第七方面，涉及一种细胞，所述细胞包含一种或多种上述的sgRNA，上述DNA分子，上述的sgRNA载体，和/或上述的sgRNA载体的体外转录产物。
[0064] 本发明的第八方面，涉及上述的sgRNA、上述的DNA分子、上述的sgRNA载体或上述的细胞在敲除CD132基因中的应用或在构建CD132基因缺失的免疫缺陷动物模型中的应用。
[0065] 本发明的第九方面，涉及一种CD132基因缺失细胞株，使用本发明公开的能够特异的靶向CD132基因的sgRNA、或相应的DNA分子、或相应的载体或上述细胞制备获得。
[0066] 本发明的第十方面，涉及一种制备免疫缺陷型人源化动物模型的方法，包括如下步骤：
[0067] (a)利用本发明中的方法获得免疫缺陷型动物；
[0068] (b)将步骤(a)获得的免疫缺陷动物模型与其它基因人源化动物交配或体外授精或基于步骤(a)获得的免疫缺陷动物模型进一步进行基因编辑，并进行筛选，得到免疫缺陷型人源化动物模型。
[0069] 优选的，所述其它基因人源化动物选自基因CD137、LAG-3、CTLA-4、TIM-3、BTLA、4-1BB、CD27、CD28、CD47、TIGIT、GITR、OX40或PD-L1人源化的基因人源化动物。
[0070] 优选的，步骤(b)中，将步骤(a)获得的免疫缺陷型动物与多基因人源化动物交配或基于步骤(a)获得的免疫缺陷动物模型进一步进行基因编辑得到免疫缺陷型多基因人源化动物模型。
[0071] 更优选的，所述多基因人源化动物可以是单基因人源化动物、双基因人源化动物、三基因人源化动物、四基因人源化动物、五基因人源化动物、六基因人源化动物、七基因人源化动物、八基因人源化动物或九基因人源化动物。
[0072] 本发明的第十一方面，涉及使用本发明所述方法制备获得的免疫缺陷型人源化动物模型。
[0073] 优选的，所述动物模型为非人类哺乳动物。
[0074] 更优选的，所述动物模型为啮齿动物。
[0075] 更优选的，所述动物模型为小鼠或大鼠。
[0076] 优选的，本发明所述的免疫缺陷型人源化动物模型，
[0077] 表达人源化CD137和/或人源化PD-1基因编码的蛋白质；
[0078] 同时，CD132基因的第1外显子全部或部分、第2外显子或第1-2外显子被敲除；
[0079] 并且，缺少T、B和NK细胞，并且表达CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD19+表面标记分子的白细胞比例低于0.5％；表达CD3+、CD3-CD49b+表面标记分子的白细胞比例低于2％。
[0080] 优选的，CD132基因的敲除还包括第3外显子、第4外显子、第5外显子、第6外显子、第7外显子或第8外显子中的一种或两种以上的组合；进一步优选的，CD132基因的第1-8位外显子被敲除；获得缺少T、B和NK细胞，并且表达CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD19+表面标记分子的白细胞比例低于0.5％，表达CD3+、CD3-CD49b+表面标记分子的白细胞比例低于2％的免疫缺陷动物模型。
[0081] 本发明的第十二方面，涉及免疫缺陷型人源化动物模型的后代。
[0082] 本发明的第十三方面，涉及一种荷瘤免疫缺陷动物模型，免疫缺陷型动物模型是通过本发明所述的方法制备获得的。
[0083] 优选的，荷瘤免疫缺陷型动物是啮齿动物。
[0084] 更优选的，荷瘤免疫缺陷型动物是小鼠或大鼠。
[0085] 优选的，涉及荷瘤免疫缺陷型动物的细胞或细胞系或原代细胞培养物，以及荷瘤免疫缺陷型动物的组织或器官或其培养物，以及荷瘤免疫缺陷型动物的荷瘤后的瘤组织。
[0086] 本发明的第十四方面，涉及一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，其来源于上述的免疫缺陷动物模型、上述的免疫缺陷型人源化动物模型、上述的免疫缺陷型人源化动物模型的后代或上述的荷瘤免疫缺陷动物模型。
[0087] 本发明的第十五方面，涉及一种组织或器官或其培养物，其来源于上述的免疫缺陷动物模型、上述的免疫缺陷型人源化动物模型、上述的免疫缺陷型人源化动物模型的后代或上述的荷瘤免疫缺陷动物模型。
[0088] 优选的，所述的组织或器官或其培养物为脾脏、肿瘤或其培养物。
[0089] 本发明的第十六方面，涉及一种荷瘤后的瘤组织，其来源于上述的免疫缺陷动物模型、上述的免疫缺陷型人源化动物模型、上述的免疫缺陷型人源化动物模型的后代或上述的荷瘤免疫缺陷型动物模型。
[0090] 本发明的第十七方面，涉及一种特异靶向敲除CD132基因的CRISPR/Cas9系统，包括使用能够特异的靶向CD132基因的sgRNA的DNA序列。
[0091] 本发明的第十八方面，涉及一种能够特异的靶向CD132基因的核酸分子试剂盒，包括本发明所述的sgRNA。
[0092] 本发明的第十九方面，涉及一种能够特异的靶向CD132基因的成套核酸分子，包括本发明中的sgRNA和Cas9mRNA。
[0093] 此外，本发明还涉及一种能够特异的靶向CD132基因的sgRNA序列在敲除CD132基因中的应用。
[0094] 本发明的第二十方面，涉及本发明公开的免疫缺陷动物模型、免疫缺陷型人源化动物模型、后代或荷瘤免疫缺陷动物模型在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用。
[0095] 本发明的第二十一方面，涉及本发明公开的免疫缺陷动物模型、免疫缺陷型人源化动物模型、后代或荷瘤免疫缺陷动物模型在生产和利用动物疾病模型，用于病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用。
[0096] 本发明的第二十二方面，涉及本发明公开的免疫缺陷动物模型、免疫缺陷型人源化动物模型、后代或荷瘤免疫缺陷动物模型在筛选、验证、评价或研究免疫缺陷药物或组合药物、药效研究，免疫缺陷相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的应用。
[0097] 优选的，所述应用包括使用人PBMC进行免疫系统重建后，对抗人单抗、双抗或联合用药的药效评价、药物筛选，或人CAR-T体内评估或筛选。
[0098] 本发明的第二十三方面，涉及一种人用药剂筛选或评价的方法，包括将人肿瘤细胞移入已有人PMBC重建的本发明所述的动物模型体内，向移入人肿瘤细胞的动物给予候选药剂，对给予药剂的动物进行药效检测和比较。
[0099] 优选的，所述候选药剂为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。
[0100] 优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的存活力和/或增殖速率；所述检测的方法为流式细胞检测和/或动物活体成像检测。
[0101] 本发明的第二十四方面，涉及一种上述动物模型的应用，包括利用基因编辑或交配或体外授精的方式敲除上述动物模型体内的B2m基因，或利用基因编辑方法先敲除NOD/scid小鼠体内的Foxn1基因得到NOD/scid nude小鼠后，再与B-NDG进行交配或体外授精，并对其后代进行筛选。
[0102] 本发明所述“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗(treating)”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。
[0103] 在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。在一个方面，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科或鼠总科超家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
[0104] 在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠。除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：MolecularCloningALaboratoryManual，
2ndEd.，ed.BySambrook，FritschandManiatis(ColdSpringHarborLaboratoryPress：
1989)；DNACloning，VolumesIandII(D.N.Glovered.，1985)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；NucleicAcidHybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；TranscriptionAndTranslation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；CultureOfAnimalCells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；
ImmobilizedCellsAndEnzymes(IRLPress，1986)；B.Perbal，APracticalGuideToMolecularCloning(1984)；theseries，MethodsInENZYMOLOGY(J.AbelsonandM.Simon，eds.-in-chief，AcademicPress，Inc.，NewYork)，specifically，Vols.154and155(Wuetal.eds.)andVol.185，″GeneExpressionTechnology″(D.Goeddel，ed.)；GeneTransferVectorsForMammalianCells(J.H.MillerandM.P.Caloseds.，1987，ColdSpringHarborLaboratory)；ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecular Biology(MayerandWalker，eds.，
AcademicPress，London，1987)；HandbookOfExperimentalImmunology，VolumesV(D.M.WeirandC.C.Blackwell，eds.，1986)；andManipulatingtheMouseEmbryo，(ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.，1986)。
2ndEd.，ed.BySambrook，FritschandManiatis(ColdSpringHarborLaboratoryPress：
1989)；DNACloning，VolumesIandII(D.N.Glovered.，1985)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；NucleicAcidHybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；TranscriptionAndTranslation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；CultureOfAnimalCells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；
ImmobilizedCellsAndEnzymes(IRLPress，1986)；B.Perbal，APracticalGuideToMolecularCloning(1984)；theseries，MethodsInENZYMOLOGY(J.AbelsonandM.Simon，eds.-in-chief，AcademicPress，Inc.，NewYork)，specifically，Vols.154and155(Wuetal.eds.)andVol.185，″GeneExpressionTechnology″(D.Goeddel，ed.)；GeneTransferVectorsForMammalianCells(J.H.MillerandM.P.Caloseds.，1987，ColdSpringHarborLaboratory)；ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecular Biology(MayerandWalker，eds.，
AcademicPress，London，1987)；HandbookOfExperimentalImmunology，VolumesV(D.M.WeirandC.C.Blackwell，eds.，1986)；andManipulatingtheMouseEmbryo，(ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.，1986)。
[0105] 以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
[0106] 本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
附图说明
[0107] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
[0108] 图1：sgRNA活性检测结果，其中，PC-为阴性对照，PC+为阳性对照，L-为5’端靶位点阴性对照，L-1至L-4分别对应sgRNA-1至sgRNA-4，R-为3’端靶位点阴性对照，R-5至R-8分别对应sgRNA-5至sgRNA-8；
[0109] 图2：pT7-sgRNA质粒图谱示意图；
[0110] 图3：鼠尾PCR鉴定结果，其中，M为Marker，WT为野生型对照，-为阴性对照，1、2、3、4为小鼠编号；
[0111] 图4：BALB/c、NOD-scid、B-NDG小鼠脾脏细胞流式检测图；
[0112] 图5：人外周血细胞(hPBMC)在B-NDG小鼠体内的重建后小鼠脾脏细胞流式检测图；
[0113] 图6：人造血干细胞在B-NDG小鼠体内的增殖分化检测；
[0114] A.注射人CD34+细胞10周后小鼠体内人源细胞占白细胞的比例；
[0115] B.注射人CD34+细胞10周后小鼠体内人源T、B细胞占白细胞的比例；
[0116] 图7：向B-NDG、NOD-scid、BALB/c Nude小鼠尾静脉注射相同数量(5×105)的Raji细胞后，在不同的时间点记录并分析小鼠的如下各种指标；
[0117] A.细胞接种后，小鼠生存情况曲线；
[0118] B.细胞接种后，小鼠体重变化；
[0119] C.细胞接种后，小鼠外周血中人源细胞百分率变化；
[0120] 图8：接种Raji细胞后，B-NDG、NOD-scid小鼠肝脏中瘤块对比；
[0121] 图9：接种Raji细胞后，B-NDG、NOD-scid小鼠肝脏及脾脏免疫组化染色对比人线粒体数量；
[0122] 图10：B-NDG接种CD34+细胞后，再接种Raji细胞，成像观察肿瘤生长情况；图A为不同时间点对小鼠成像观察肿瘤生长情况；图B为不同分组小鼠成像下肿瘤细胞荧光强度曲线；
[0123] 图11：人B细胞淋巴瘤细胞株植入B-NDG小鼠体内，并利用三种人CD47抗体进行抗肿瘤药效试验，图为实验周期内实验小鼠体重结果；
[0124] 图12：人B细胞淋巴瘤细胞株植入B-NDG小鼠体内，并利用三种人CD47抗体进行抗肿瘤药效试验，图为实验周期内实验小鼠体重变化；
[0125] 图13：人B细胞淋巴瘤细胞株植入B-NDG小鼠体内，并利用三种人CD47抗体进行抗肿瘤药效试验，图为实验小鼠使用动物活体成像仪检测的肿瘤信号强度；
[0126] 图14：人原发性肺癌组织植入B-NDG小鼠体内，并利用化疗药物组合Paclitaxel和Cisplatin、Paclitaxel和Carboplatin或Pemetrexed和Cisplatin进行抗肿瘤药效试验，图为实验周期内实验小鼠体重结果；
[0127] 图15：人原发性肺癌组织植入B-NDG小鼠体内，并利用化疗药物组合Paclitaxel和Cisplatin、Paclitaxel和Carboplatin或Pemetrexed和Cisplatin进行抗肿瘤药效试验，图为实验周期内肿瘤体积测量结果；
[0128] 图16：人原发性肺癌组织植入B-NDG小鼠体内，并利用化疗药物或组合5-FU、Gemcitabine和5-FU或Gemcitabine和Oxaliplatin进行抗肿瘤药效试验，图为实验周期内实验小鼠体重结果；
[0129] 图17：人原发性肺癌组织植入B-NDG小鼠体内，并利用化疗药物或组合5-FU、Gemcitabine和5-FU或Gemcitabine和Oxaliplatin进行抗肿瘤药效试验，图为实验周期内肿瘤体积测量结果；
[0130] 图18：人原发性肺癌组织植入B-NDG小鼠体内，并利用化疗药物组合Gemcitabine和Cisplatin、Docetaxel和Cisplatin、Paclitaxel和Cisplatin或Paclitaxel和Carboplatin进行抗肿瘤药效试验，图为实验周期内实验小鼠体重结果；
[0131] 图19：人原发性肺癌组织植入B-NDG小鼠体内，并利用化疗药物组合Gemcitabine和Cisplatin、Docetaxel和Cisplatin、Paclitaxel和Cisplatin或Paclitaxel和Carboplatin进行抗肿瘤药效试验，图为实验周期内肿瘤体积测量结果；
[0132] 图20：人原发性胃癌组织组织植入B-NDG小鼠体内，并利用化疗药物或组合Oxaliplatin、Capecitabine或Oxaliplatin和S-1进行抗肿瘤药效试验，图为实验周期内实验小鼠体重结果；
[0133] 图21：人原发性胃癌组织组织植入B-NDG小鼠体内，并利用化疗药物或药物组合Oxaliplatin、Capecitabine或Oxaliplatin和S-1进行抗肿瘤药效试验，图为实验周期内肿瘤体积测量结果；
[0134] 图22：人原发性胃癌组织组织植入B-NDG小鼠体内，并利用化疗药物组合Oxaliplatin和Capecitabine或Paclitaxel和Cisplatin进行抗肿瘤药效试验，图为实验周期内实验小鼠体重结果；
[0135] 图23：人原发性胃癌组织组织植入B-NDG小鼠体内，并利用化疗药物组合Oxaliplatin和Capecitabine或Paclitaxel和Cisplatin进行抗肿瘤药效试验，图为实验周期内肿瘤体积测量结果；
[0136] 图24：将来自四个病人的新鲜肺癌组织样本常规操作移植入B-NDG小鼠，并随机选择抗体A、化疗药C中的1中或2中进行抗肿瘤药效试验，图为实验周期内肿瘤测量结果；
[0137] 图25：鼠尾PCR鉴定结果，其中，M为Marker，WT为野生型对照，H2O为水对照，F0-1至F0-7为小鼠编号；
[0138] 图26：B-NDG nude鼠照片。
具体实施方式
[0139] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0140] 在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：
[0141] NOD/scid小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司；
[0142] BALB/c小鼠和BALB/c Nude小鼠均购自北京维通利华实验动物技术有限公司；
[0143] Ambion体外转录试剂盒购自Ambion，货号AM1354；
[0144] Raji细胞购自ATCC；
[0145] 大肠杆菌TOP10感受态细胞购自Tiangen公司，货号为CB104-02；
[0146] EcoRI，BamHI，BbsI酶购自NEB，货号分别为；R3101M，R3136M，R0539L；
[0147] 卡那霉素购自Amresco，货号为0408；
[0148] pHSG299质粒购自Takara，货号3299；
[0149] KOD酶购自Toyobo，货号KOD-101；
[0150] Cas9mRNA来源SIGMA，货号CAS9MRNA-1EA；
[0151] UCA试剂盒来源百奥赛图公司，货号BCG-DX-001；
[0152] 鼠抗人线粒体膜蛋白抗体购自Millipore，货号为MAB1273；
[0153] 鼠CD3抗体(PerCP)购自Biolegend，货号为：100326；
[0154] 鼠CD4抗体(FITC)购自Biolegend，货号为：116003；
[0155] 鼠CD8抗体(PE)购自Biolegend，货号为：100708；
[0156] 鼠CD19抗体(FITC)购自Biolegend，货号为：115506；
[0157] 鼠CD49b抗体(APC)购自Biolegend，货号为：108909；
[0158] Gemcitabine(注射用盐酸吉西他滨)来源法国礼来有限公司(LILLY FRANCE)，规格为1g；
[0159] Cisplatin(顺铂注射液)来源澳大利亚科鼎有限公司(Hospira Australia Pty Ltd)，规格为50ml:50mg/支；
[0160] Capecitabine(卡培他滨片)来源上海罗氏制药有限公司，规格为0.5g*12片；
[0161] Docetaxel(多西他赛注射液)来源江苏恒瑞医药股份有限公司，规格为0.5ml:20mg/支；
[0162] Paclitaxel(紫杉醇注射液)来源北京双鹭药业股份有限公司，规格为5ml:30mg；
[0163] Carboplatin(卡铂)购自MCE(MedChemExpress)，货号为HY-17393；
[0164] Pemetrexed(注射用培美曲塞二钠)来源齐鲁制药有限公司，规格为0.2g/支；
[0165] 5-FU(氟尿嘧啶注射液)来源天津金耀药业有限公司，规格为0.25g*10ml*5支；
[0166] Oxaliplatin(注射用奥沙利铂)来源江苏恒瑞医药股份有限公司，规格为50mg/瓶；
[0167] S-1(替吉奥胶囊)来源山东新时代药业有限公司，规格为20mg*42粒。
[0168] 实施例1 CD132基因sgRNA的设计
[0169] 靶序列决定了sgRNA的靶向特异性和诱导Cas9切割目的基因的效率。因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgRNA表达载体的前提。
[0170] 针对小鼠免疫相关的基因设计多个sgRNA，其中，各个sgRNA靶向的靶位点序列如下：
[0171] sgRNA-1靶位点序列(SEQ ID NO：1)：5’-ccaccggaagctacgacaaaagg-3’[0172] sgRNA-2靶位点序列(SEQ ID NO：2)：5’-tctctacagcgtggtttctaagg-3’[0173] sgRNA-3靶位点序列(SEQ ID NO：3)：5’-ggcttgtgggagagtggttcagg-3’[0174] sgRNA-4靶位点序列(SEQ ID NO：4)：5’-ccacgctgtagagagaggggggg-3’[0175] sgRNA-5靶位点序列(SEQ ID NO：5)：5’-aggggaggttagcgtcacttagg-3’[0176] sgRNA-6靶位点序列(SEQ ID NO：6)：5’-gaaatcgaaacttagccccaagg-3’[0177] sgRNA-7靶位点序列(SEQ ID NO：7)：5’-gcagcctgcatagcccttactgg-3’[0178] sgRNA-8靶位点序列(SEQ ID NO：8)：5’-ccctactcaccttggcaatctgg-3’[0179] 所述sgRNA1-sgRNA4识别靶基因上的5’端靶位点，sgRNA5-sgRNA8识别靶基因上的3’端靶位点。5’端靶位点位于免疫相关基因的第1外显子上游或1号外显子上，3’端靶位点位于第8外显子上。
[0180] 本例中使用的小鼠为NOD/scid背景，所述免疫相关基因为CD132基因(Gene ID:16186)。
[0181] 实施例2 CD132基因sgRNA的筛选
[0182] 利用UCA试剂盒检测多个sgRNA的活性，从结果可见sgRNA具有不同活性，检测结果参见图1。其中sgRNA-1、sgRNA-7活性相对较低，这可能由于靶位点序列的特殊性导致，但根据我们的实验，L-1、R-7的数值仍显著高于对照组数值，仍可判断sgRNA-1、sgRNA-7是具有活性的，活性满足基因打靶实验要求。根据活性检测结果，从中优选sgRNA3(活性相对值为16.1±1.2)和sgRNA6(活性相对值为21.7±1.5)进行后续实验。去除sgRNA序列的3’端NGG三个碱基得上、下游单链如下：
[0183] sgRNA3：上游：5’-ggcttgtgggagagtggttc-3’(SEQ ID NO：18)
[0184] 下游：5’-gaaccactctcccacaagcc-3’(SEQ ID NO：19)
[0185] sgRNA6：上游：5’-gaaatcgaaacttagcccca-3’(SEQ ID NO：20)
[0186] 下游：5’-tggggctaagtttcgatttcc-3’(SEQ ID NO：21)
[0187] 在sgRNA3或sgRNA6的上、下游单链的5’端加上CACC或CACCG得到正向寡核苷酸，在其对应DNA的互补链的5’端加上AAAC得到反向寡核苷酸序列，合成的sgRNA的正、反向寡核苷酸序列，见表1。
[0188] 表1 sgRNA3和sgRNA6序列列表
[0189]
[0190] 实施例3 pT7sgRNA-G2质粒构建
[0191] 由质粒合成公司合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA并依次通过酶切(EcoRI及BamHI)连接至骨架载体pHSG299上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒：pT7sgRNA-G2质粒，pT7sgRNA-G2质粒图谱见图2。
[0192] 含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA(SEQ ID NO：13)：
[0193] gaattctaatacgactcactatagggggtcttcgagaagacctgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttaaaggatcc
[0194] 实施例4 pT7-IL-3和pT7-IL-6重组表达载体的构建
[0195] 将实施例2中获得的上、下游双链退火后，分别将退火产物连接至pT7-sgRNA质粒(质粒先用BbsI线性化)。
[0196] 连接反应体系见表2：
[0197] 表2连接反应体系
[0198]
[0199]
[0200] 反应条件：
[0201] 室温连接10-30min，转化至30μL TOP10感受态细胞中，然后取200μL涂布于Kan抗性的平板，37℃培养至少12小时后挑选2个克隆接种含有Kan抗性的LB培养基(5ml)中，37℃，250rpm摇培至少12小时。
[0202] 随机挑选克隆送测序公司进行测序验证，选择连接正确的表达载体pT7-IL-3和pT7-IL-6进行后续实验。
[0203] 实施例5显微注射、胚胎移植及繁育
[0204] 取所述小鼠的原核期受精卵，利用显微注射仪将pT7-IL-3质粒的体外转录产物和pT7-IL-6质粒的体外转录产物(使用Ambion体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录)与Cas9mRNA预混好后注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》(安德拉斯·纳吉，化学工业出版社,2006)中的方法进行受精卵的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，将获得的免疫缺陷小鼠通过杂交和自交，扩大种群数量，建立稳定的免疫缺陷小鼠品系。
[0205] 实施例6免疫缺陷小鼠的基因型鉴定
[0206] 应用本方法得到的免疫缺陷小鼠(命名为B-NDG)，可利用PCR技术检验免疫缺陷小鼠体细胞中的CD132基因是否被敲除。PCR反应体系(20μL)和扩增条件分别见表3、表4：
[0207] 表3 PCR反应体系(20μL)
[0208]10×KOD缓冲液 2μL
dNTP(2mM) 2μL
MgSO4(25mM) 0.8μL
上游引物(10μM) 0.6μL
下游引物(10μM) 0.6μL
鼠尾gDNA 200ng
KOD(200U) 0.6μL
H2O 补至20μL
dNTP(2mM) 2μL
MgSO4(25mM) 0.8μL
上游引物(10μM) 0.6μL
下游引物(10μM) 0.6μL
鼠尾gDNA 200ng
KOD(200U) 0.6μL
H2O 补至20μL
[0209] 提取小鼠的鼠尾基因组DNA进行检测，被成功敲除的小鼠PCR条带应为609bp，否则应无条带。
[0210] 表4 PCR扩增反应条件
[0211]
[0212] PCR引物序列如下，
[0213] 上游引物：
[0214] PCR-1(SEQ ID NO：14)：5’-AAGATAGCCTAGAGGGAAAAGGTGG-3’；
[0215] 下游引物：
[0216] PCR-2(SEQ ID NO：15)：5’-AGGTAGAAAAAGGGAGGGAGAATCC-3’
[0217] 鼠尾PCR鉴定结果见图3，其中，编号为2、4的小鼠为阳性小鼠。
[0218] 实施例7免疫缺陷小鼠的表达情况分析
[0219] 选取3只本方法制备的免疫缺陷小鼠B-NDG，另选BALB/c小鼠和NOD/scid小鼠品系小鼠各3只作为对照。
[0220] 执行安乐死后解剖取小鼠脾脏，研磨后过70μm细胞筛网，将过滤好的细胞悬液离心弃上清，加入红细胞裂解液，裂解5min后加入PBS溶液中和裂解反应，离心弃上清后用PBS清洗细胞1次进行FACS检测，分析免疫缺陷小鼠及对照小鼠中CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞、CD3-CD19+B细胞、CD3-CD49b+NK细胞的比例。
[0221] 表5为B-NDG小鼠与BALB/c小鼠、NOD/scid小鼠细胞中的T、B和NK细胞的流式细胞数据平均值比较。
[0222] 表5免疫缺陷小鼠的表达情况试验
[0223]
[0224] 结果表明，与免疫健全的野生型BALB/c小鼠相比，使用本方法所制备的B-NDG免疫缺陷小鼠缺少T、B和NK细胞，主要表现为流式细胞技术检测到表达对应表面标记分子的白细胞比例明显降低；与NOD/scid背景小鼠相比，B-NDG的T、B和NK细胞减少更显著。分析结果表明，通过完全敲除NOD/scid背景小鼠体内的CD132基因，达到了预期进一步提升小鼠免疫缺陷程度的目的。本方法制备的免疫缺陷小鼠几乎完全缺失T、B、NK细胞，符合高度免疫缺陷小鼠的特征。图4显示了其中一组小鼠流式细胞测量出的T、B和NK细胞比例结果。
[0225] 表6 B-NDG小鼠细胞中的T、B和NK细胞的流式细胞检测数据
[0226] 表面标记分子 B-NDG#1 B-NDG#2 B-NDG#3 平均值 SDT细胞 CD3+ 1.20％ 0.35％ 0.14％ 0.56％ 0.56％
CD4+T细胞 CD3+CD4+ 0.21％ 0.00％ 0.00％ 0.07％ 0.12％
CD8+T细胞 CD3+CD8+ 0.00％ 0.14％ 0.00％ 0.05％ 0.08％
B细胞 CD3-CD19+ 0.09％ 0.00％ 0.00％ 0.03％ 0.05％
NK细胞 CD3-CD49b+ 1.34％ 1.24％ 1.54％ 1.37％ 0.15％
CD4+T细胞 CD3+CD4+ 0.21％ 0.00％ 0.00％ 0.07％ 0.12％
CD8+T细胞 CD3+CD8+ 0.00％ 0.14％ 0.00％ 0.05％ 0.08％
B细胞 CD3-CD19+ 0.09％ 0.00％ 0.00％ 0.03％ 0.05％
NK细胞 CD3-CD49b+ 1.34％ 1.24％ 1.54％ 1.37％ 0.15％
[0227] 表6列出了B-NDG小鼠细胞中的T、B和NK细胞的流式细胞检测数据。结果表明，本方法制备的免疫缺陷小鼠，体内T、B、NK细胞缺失程度较NOD/scid背景小鼠显著提高，且个体间差异微小，实验结果一致性高，其中，表达CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD19+表面标记分子的白细胞比例低于0.5％；表达CD3+、CD3-CD49b+表面标记分子的白细胞比例低于2％。
[0228] 实施例8免疫缺陷小鼠的人免疫系统重建
[0229] 使用本发明方法获得的免疫缺陷小鼠，在移植人外周血细胞(hPBMC)后可以在小鼠体内构建人免疫系统重建的人源化小鼠模型。
[0230] 选取3只使用本方法制备的免疫缺陷小鼠，通过尾静脉注射5×106人外周血细胞(hPBMC)，24天后取血进行流式细胞检测。流式数据如图5所示，通过注射人外周血细胞(hPBMC)，可以在3只免疫缺陷小鼠体内检测到表达人白细胞表面分子标记(CD45)的细胞。
[0231] 本测试例结果表明通过移植人外周血细胞，可以初步在小鼠体内重建人免疫系统。且进一步的分析表明，外周血细胞的重建以T细胞为主。
[0232] 实施例9免疫缺陷小鼠对比分析
[0233] 通过现有文献阅读，本发明还进一步的比较了本发明获得的免疫缺陷B-NDG小鼠与现有技术中其它免疫缺陷小鼠。利用人造血干细胞重建免疫系统，在免疫缺陷小鼠经辐照后，注射人造血干细胞(CD34+)在小鼠体内重建免疫系统，B-NDG小鼠的测试结果见图6。图6A为检查人源细胞占白细胞的比例(hCD45+％)及图6B为重建后小鼠体内人源T细胞(hCD3+)和B细胞(hCD19+)占白细胞的比例。与其它免疫缺陷小鼠对比数据见表7(数据来源：
NSG：Blood,2005Sep 1；106(5):1565-73，NOG：Exp.Anim.63(3),321–330,2014)。
NSG：Blood,2005Sep 1；106(5):1565-73，NOG：Exp.Anim.63(3),321–330,2014)。
[0234] 表7免疫缺陷小鼠对比数据
[0235] B-NDG NSG NOG
hCD45+(％) 85.2％ 68.9％ 58％
hCD3+T(％) 49％ 42.8％ 39％
hCD19+B(％) 25.2％ 7.8％ 16％
hCD45+(％) 85.2％ 68.9％ 58％
hCD3+T(％) 49％ 42.8％ 39％
hCD19+B(％) 25.2％ 7.8％ 16％
[0236] 结果可以看出，本方法制备的免疫缺陷小鼠B-NDG相比其它免疫缺陷小鼠，在小鼠体内经接种人CD34+细胞重建的免疫系统，人源细胞比例最高，且分化的人T、B细胞比例也高于其它免疫缺陷小鼠，表明本发明方法制备的动物模型更适合人源细胞移植和免疫系统重建。
[0237] 实施例10免疫缺陷小鼠接种肿瘤细胞
[0238] 使用本发明方法获得的免疫缺陷小鼠B-NDG可成功接种肿瘤细胞。即以人淋巴瘤细胞(Raji细胞)为例，证明B-NDG小鼠能更好的促进移植的人源细胞的生长。
[0239] 方法：选取BALB/c Nude小鼠、NOD/scid小鼠和本方法制备的免疫缺陷小鼠各1只，分别通过尾静脉注射5x105Raji细胞，而后在不同的时间点记录并分析小鼠的如下各种指标：细胞接种后记录小鼠的生存情况，绘制Kaplan-Merier生存曲线，如图7A所示；记录并分析每周小鼠的体重(g)，如图7B所示，计算相对于接种当天的相对体重(％)变化，其中，体重下降若超过30％后应执行安乐死；接种Raji细胞后，每周通过眼眶静脉丛采取100μL全血，提取DNA，通过q-PCR技术检测小鼠外周血中人源细胞比率，记录外周血中人源细胞百分率变化，如图7C所示。
[0240] 结果表明使用本发明方法获得的免疫缺陷小鼠移植Raji细胞的成活率高、生长速度快，约18天体重下降超过20％。将体重下降超过20％的小鼠执行安乐死后解剖脏器、拍照，可见B-NDG小鼠肝脏上整体布满明显的白色瘤块，而接种细胞25天时的NOD/scid小鼠的肝脏上瘤块较少，如图8所示。进一步的将接种Raji细胞后的小鼠肝脏和脾脏进行免疫组织化学检测，一抗使用鼠抗人线粒体膜蛋白抗体，放大倍数400倍。检测结果如图9显示，B-NDG小鼠比NOD/scid小鼠脏器中存在的人线粒体数量更多，尤其是肝脏中染色结果明显更深。
[0241] 上述实验结果说明，相比于其它小鼠，Raji细胞在B-NDG小鼠上能更有效的生长并成瘤。
[0242] 实施例11免疫缺陷小鼠用于药效试验
[0243] 使用本方法获得的免疫缺陷小鼠B-NDG，在体内接种人CD34+造血干细胞重建人免疫系统后，可用于筛选抗肿瘤的抗体药物及进行药效测试。
[0244] 选取4只本方法制备的免疫缺陷B-NDG小鼠，体内接种人CD34+造血干细胞，待重建人免疫系统后，通过尾静脉注射5×105带有荧光素酶基因的人B细胞淋巴瘤细胞株(Raji细胞)，待细胞株在体内成瘤后，随机挑选2只静脉注射人PD-1抗体，使用动物活体成像仪检测肿瘤在小鼠体内生长情况。注射人PD-1抗体2天后开始检测，结果见图10，结果表明注射人PD-1抗体5天后小鼠体内肿瘤细胞明显减少，而未使用抗体的小鼠肿瘤持续生长且明显转移，表明试验组使用的抗体药物对肿瘤细胞生长有明显的抑制作用。
[0245] 已知PD-1基因主要表达于T淋巴细胞表面，而免疫缺陷小鼠体内没有T细胞，需要借助移植人CD34+细胞获得(人源化B-NDG小鼠)。上述实施例9表明，B-NDG小鼠可通过接种人CD34+造血干细胞重建免疫系统，获得人T淋巴细胞。本实施例中，注射PD-1抗体后，抑制了B-NDG小鼠体内重建的T细胞表面的PD-1抗原，进而诱导人源化小鼠肿瘤免疫反应，移植肿瘤细胞的生长。以上实验表明本方法制备的B-NDG小鼠可用于人免疫系统重建，以及抗肿瘤药物筛选及药效验证。
[0246] 实施例12免疫缺陷小鼠用于抗体药物筛选
[0247] 使用本方法获得的免疫缺陷小鼠B-NDG，在体内接种肿瘤细胞后，可用于筛选抗肿瘤的抗体药物及进行药效测试。
[0248] 取B-NDG小鼠(4-6周)，通过尾静脉注射1×106带有荧光素酶基因的人B细胞淋巴瘤细胞株，待细胞株在体内成瘤后，随机分为对照组和数个治疗组(n＝5/组)。治疗组随机选择3种人CD47单克隆抗体(AB1、AB2、AB3，均为采用常规方法免疫小鼠得到)中的1种，给药剂量均为3mg/kg，对照组注射空白溶剂(生理盐水)。给药方式：腹腔注射，每周给药2次，共给药4次。每周2次使用动物活体成像仪检测肿瘤在小鼠体内生长情况，共测量6次，接种后单只小鼠体重下降20％时执行安乐死。实验周期内小鼠体重、体重变化和肿瘤成像信号强度见图11-13。
[0249] 整体来看，各组实验过程中，动物健康状态良好。在各实验终点时，除对照组外，其余各组动物体重增长良好，且体重无明显差异，表明动物对所述3种抗体耐受良好，抗体未对动物产生明显毒性作用，安全性较好(图11-12)。但从肿瘤信号强度上看(图13)，对照组小鼠在实验周期内信号强度持续变强，表明肿瘤在实验周期内均持续生长，抗体AB1(G2)、AB2(G3)和AB3(G4)治疗组的信号强度明显低于对照组(G1)，表明这3种抗人CD47单抗在抑制肿瘤生长方面具有不同的作用，抗体AB1体内治疗肿瘤效果优于抗体AB2、AB3。
[0250] 已知NOD背景小鼠中SIRPa与人CD47的结合能力最强，CD47在人肿瘤组织中具有较高的表达量。对B-NDG小鼠施用人CD47抗体后，通过阻断CD47与SIRPa之间的相互作用可促进巨噬细胞的吞噬功能，从而对肿瘤产生有效的治疗。本研究证明了B-NDG小鼠可作为体内研究的活体替代模型，用于筛选抗人用抗体的筛选、评估和治疗及体内药效检测。
[0251] 实施例13免疫缺陷小鼠用于组合药物药效试验
[0252] 临床研究证明，化疗药对人体多种实体瘤有明显的效果，具有抗瘤谱广、作用强、与多种抗肿瘤药协同作用且无交叉耐药等特点，是治疗肿瘤的主要手段之一。目前已有几十种化疗药物，由于每个化疗药的作用机制不同，现在在临床上已经很少使用单一药物，都是使用几种化疗药物的组合，优化的多药组合可发挥协同作用。使用本方法获得的免疫缺陷小鼠B-NDG，在体内接种肿瘤细胞或组织后，可用于筛选化疗药及其组合，有助于在临床前寻找到最佳的药物组合。
[0253] 为此我们进行了多次实验，在接种不同类型人肿瘤组织或细胞后，将小鼠随机分为对照组和数个治疗组(n＝5/组)，治疗组随机给予不同的化疗药物或药物组合，定期监测肿瘤体积和小鼠体重，实验方案见表8。实验1-5的肿瘤测量结果分别如图15、17、19、21、23所示，所有对照组小鼠的肿瘤在实验周期内持续生长，而治疗组与其对照组相比，肿瘤体积均出现不同程度的缩小和/或消失，表明经过不同化疗药物或药物联用治疗后，小鼠体内肿瘤生长受到不同程度的抑制。实验1-5的小鼠体重结果分别如图14、16、18、20、22所示，从结果来看，对照组和治疗组动物体重差异不大，表明B-NDG小鼠对所给药物耐受良好，但有些治疗组每次给药后小鼠体重出现明显降低，如实验1Group-3(表8)，这种情况表明所给药物虽然具有肿瘤抑制作用，但具有一定毒性。不同化疗药物或药物组合在具体实验设计及药物组合、剂量见表8。
[0254] 表8化疗药物实验方案
[0255]
[0256]
[0257] 实施例14免疫缺陷小鼠用于PDX模型构建及药物和药物组合筛选
[0258] 使用本方法获得的免疫缺陷小鼠B-NDG，可将患者的新鲜肿瘤组织移植后，得到PDX(Patient-derived xenograft)人源肿瘤异体移植模型。这类模型因其肿瘤分化程度、形态特征、结构特点以及分子特点等与人本身的肿瘤特点更为接近，对肿瘤的个体化诊断和治疗具有极高的价值。
[0259] 例如，将来自四个病人的新鲜肺癌组织样本常规操作移植入B-NDG小鼠(4-6周)，当肿瘤体积达到500-1000mm3左右，对移植的肿瘤进行体内传代，选择稳定传代至三代或三代以上的小鼠进行实验。将每个PDX构建的模型随机分为对照组和数个治疗组(n＝5/组)。治疗组随机选择人用肺癌抗体A或化疗药C中的1种或2种组合，对照组注射空白溶剂。尽管都是肺癌PDX模型，但不同病人的PDX模型使用不同药物或药物组合治疗后，其肿瘤测量结果(图24)表现出明显的差异。
[0260] 实施例15免疫缺陷小鼠用于制备其它小鼠模型
[0261] 使用本方法获得的免疫缺陷小鼠B-NDG，还可对其进行进一步的基因编辑或通过交配或体外授精的方式，得到含有其它基因编辑的小鼠模型。如，通过基因编辑方法直接敲除B-NDG小鼠体内的B2m基因，得到免疫缺陷程度高的B2m基因敲除小鼠。利用PCR技术检验小鼠体细胞中的B2m基因是否被敲除，设计的引物对信息：
[0262] 上游引物(SEQ ID NO：16)：5’-GAATAAATGAAGGCGGTCCCAGGCT-3’；
[0263] 下游引物(SEQ ID NO：17)：5’-AAACCCATGCAGGCTGTGTAACTGA-3’。
[0264] 提取小鼠的鼠尾基因组DNA进行检测，被成功敲除的小鼠PCR条带应为～741bp，否则应无条带。小鼠鼠尾PCR鉴定结果见图25，其中编号为F0-1、F0-4、F0-5、F0-6的小鼠为阳性小鼠。
[0265] 另外，通过基因编辑方法先敲除NOD/scid小鼠体内的Foxn1基因，得到NOD/scid nude小鼠后，再与B-NDG进行交配或体外授精，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定几率得到Foxn1基因与IL-2rg基因敲除的杂合动物模型(NOD/scid背景)，再将杂合子相互交配可以得到B-NDG nude小鼠。得到的B-NDG nude鼠照片见图26。
[0266] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0267] 另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0268] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。