使用金属纳米粒子的植物培养方法以及其实施用的营养培养基

摘要

本发明涉及植物培养中的生物和纳米技术领域，可用于生产高质量的农作物种植材料，用于实施生物技术研究，从而改善农产品的质量。本发明能用于气雾栽培法和水培法，还能用于在长期太空飞行条件下为宇航员创造生命维持系统。所提出的植物培养方法包括在无菌琼脂营养培养基上使种子发芽并随后培养植物，该营养培养基含有一组植物生长必需的有机和无机成分，包括：铁、锌和铜，其中铁、锌或铜或其组合为电中性金属的纳米粒子形式。此外，所述营养培养基可以包括壳聚糖。本发明能够改善种子发芽并提高植物的生理和形态指标，例如根长度和根活性、叶片的叶绿素含量、发芽长度和绿色部分生物量产率。

权利要求

1.一种植物的培养方法，该方法包括：在无菌条件下，在含有纳米粒子的琼脂营养培养基上使种子发芽并随后培养植物，其中，所述纳米粒子为电中性铁纳米粒子，或电中性锌纳米粒子，或电中性铜纳米粒子，或它们的组合；该营养培养基含有包括在Murashing-Skoog培养基组合物中的成分：维生素РР、В6和В1，甘氨酸，蔗糖，内消旋肌醇，琼脂，螯合剂Na2EDTA×2H2O，无机盐NH4NO3、KNO3、CaCl2×2H2O、MgSO4×7H2O、KH2PO4、KI、H3BO3、MnSO4×

7H2O、NaMoO4×2H2O和CoCl2×6H2O，以及铁、锌和铜，其中，铁、锌或铜或其组合分别以铁纳米粒子、锌纳米粒子或铜纳米粒子，或它们的组合的形式包含在所述营养培养基中。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述营养培养基还含有壳聚糖。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述营养培养基含有浓度为10.0-0.06mg/L的电中性铁纳米粒子。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述营养培养基含有浓度为3.0-0.016mg/L的电中性锌纳米粒子。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述营养培养基含有0.04-0.00016mg/L的电中性铜纳米粒子。

6.用于实施根据权利要求1所述方法的营养培养基，该营养培养基含有包括在Murashing-Skoog培养基组合物中的成分：维生素РР、В6和В1，甘氨酸，蔗糖，内消旋肌醇，琼脂，螯合剂Na2EDTA×2H2O，无机盐NH4NO3、KNO3、CaCl2×2H2O、MgSO4×7H2O、KH2PO4、KI、H3BO3、MnSO4×7H2O、NaMoO4×2H2O和CoCl2×6H2O，以及铁、锌和铜，其中，铁、锌或铜或其组合分别以铁纳米粒子、锌纳米粒子或铜纳米粒子，或它们的组合的形式包含在所述营养培养基中。

7.根据权利要求6所述的营养培养基，其中，所述营养培养基还含有壳聚糖。

8.根据权利要求6或7所述的营养培养基，其中，所述营养培养基含有浓度为10.0-

0.06mg/L的电中性铁纳米粒子。

9.根据权利要求6或7所述的营养培养基，其中，所述营养培养基含有浓度为3.0-

0.016mg/L的电中性锌纳米粒子。

10.根据权利要求6或7所述的营养培养基，其中，所述营养培养基含有浓度为0.04-

0.00016mg/L的电中性铜纳米粒子。

说明书

使用金属纳米粒子的植物培养方法以及其实施用的营养培

养基

技术领域

[0001] 本发明涉及植物培养中的生物和纳米技术领域，可用于生产高品质的农作物种植材料，以指导生物技术研究，从而改善农产品的质量。本发明能用于气雾栽培法和水培法，还能用于在长期太空飞行条件下为宇航员创造生命维持系统。

背景技术

[0002] 纳米材料应用为植物保护剂和肥料有助于提高植物对不利天气条件和疾病的抵抗力，提高农作物的产量和质量。纳米技术制剂(例如，NanoGro、GreenLift、AgBion等)是已知的，但对于新制剂的开发领域以及利用纳米技术提高农产品生产效率的方法的研究还在继续。在综述文章中特别总结了该领域的最新进展(Azamal,Husen Khwaja Salahuddin Siddiqi."Phytosynthesis  of nanoparticles:concept,controversy and application",Nanoscale Res.Lett.,2014,V.9,№1,p.229；L.R.Khot et al."
Applications of nanomaterials in agricultural production and crop protection:
A review",Crop Protection,V.35,May 2012,p.64)。

[0003] 在申请WO2013121244A1(2013年08月22日公开)中描述了被具有微营养添加剂或它们前体的物质涂覆的金属纳米粒子(NP)形式的纳米肥料。根据该发明，广泛物质中的至少一种成分(包括碳化合物、磷、氮、硼以及植物的营养和发育所必要的其它元素；还包括盐、螯合物和金属氧化物或其它化合物)能够用作涂层。在该技术方案中，金属纳米粒子(例如贵金属、铁、铜等)用作微肥进入植物组织和细胞的“运载工具”，但无法估计其自身作为营养成分的独立作用。

[0004] 已描述了种子的处理方法(UA 33863，2008年07月10日公开)和谷物与蔬菜作物的培养方法(UA 92875，2010年12月10日公开，和UA 92876，2010年12月10日公开)包括：使用生物微量元素(锌、锰、铁、铜、钼、钴)的纳米粒子共混物与化学药品(已知其生物学作用)组合的胶体溶液。与之前的情况类似，在这些技术方案中，还未发现纳米粒子作为营养成分的单独作用。此外，其引入到有机产品组合物中可能会造成环境压力，并对该产品的质量产生不利影响。

[0005] 通常，已知的纳米制剂旨在刺激植物在开放与受保护土壤中的生长。同时，现代生物技术的发展与利用人工培养基(media)(具有植物适当生长和发育必需的平衡营养成分)种植植物和培养组织培养物是密不可分的。

[0006] 随着对克隆植物的快速繁殖和在植物常见条件形式下大量生产硬繁殖(hard propagated)植物后代的需要，以及随着对种植材料品质的现代需求(需要对其进行改进和测试)，使生物技术的广泛使用与对珍贵物种收集物的创造和维护有关。

[0007] 此外，在自发生命维持系统(例如，用于长期太空飞行)的开发中，人工营养培养基的使用是非常重要的。

[0008] 假设所有这些任务的解决方案使用了先进技术，改进植物栽培技术以获得不含病毒、真菌和细菌疾病、螨虫和线虫的植物材料。

[0009] 在这方面，在不同技术中使用纳米结构用以改善和培养种植材料以及可能用于植物的克隆繁殖是很有前途的路线。由于培养因素和条件对植物的生长是重要的，使用纳米结构就更为重要。除了光和温度，营养培养基的成分对于植物的培养也是非常重要的因素；因此，由引入纳米结构形式引起的培养基变化应该会影响植物生长的质量参数。

[0010] 已知将二氧化钛纳米颗粒(纳米锐钛矿)以10-40mg/L的浓度加入到Murashing-Skoog培养基(以下称为MS培养基)中可用于增加欧芹的种子发芽并改善幼苗质量(Dehkourdi E H.Mosavi M.Biol Trace Elem Res.2013,Nov.,155(2),p.283)。浓度为
30mg/L的TiO2纳米粒子显示出最好的效果：提高了种子的发芽指数和存活潜力，增加了根和芽的长度，提高了绿色部分生物量(green mass)以及其它参数。然而，由于依然怀疑二氧化钛纳米粒子对于活生物体的安全性，仍不可能考虑将其视为农作物生产中植物生长的可接受刺激物。例如，已显示，吸入二氧化钛粉末增加了大鼠发展癌症的可能性，是人类潜在的致癌因素(http://www.neboleem.net/dioksid-titana.php)。

[0011] 根据一组必要特征，以发明EP 2499107A1(2012年09月19公开)作为所声明的使用纳米粒子作为活性因子培养植物的方法原型。该发明显示，将多层碳纳米管以有效浓度0.01-0.2pg/mL引入到MS培养基中，加速了番茄种子的发芽并提高了发芽百分比。与对照组相比，种植在含有碳纳米管的营养培养基上的番茄植物具有较大的生物质体积，同时在根长度上与对照组没有差异。作者将此效果与碳纳米管辅助提高了种子吸水的过程相关联。
然而，已知的是，碳纳米管经过皮肤，通过吸入或口服渗透到人体中，会像石棉一样破坏细胞。纳米管深入组织而不留下机会给免疫系统摧毁它们的能力会引起癌变效应(Shvedova A.A.,Kisin E.R.,Yanamala N.,Tkach A.V.et.all."MDSC and TGFβare required for facilitation of tumor growth in the lungs of mice exposed to carbon 
nanotubes",Cancer Research,2015,V.75(8),pp.1-9)。因此，需要一些特殊研究来控制植物中的碳管分布、积聚和去除，并将其应用到植物培养的实践中。这使得在农业中使用碳纳米管不会在短期内实现。

[0012] 已知营养基(例如，Murashing-Skoog、Gamborg、Heller等)含有植物发育所必需的必要成分的平衡营养复合物，这包括有机物(维生素、碳水化合物、氨基酸和/或蛋白水解产物)和无机盐(包括氮、磷、硼、钾、钙、镁、硫、铁以及微量元素，例如锰、锌、铜、钼等)。用于实施所声明的方法的营养培养基原型是应用广泛的Murashing-Skoog营养培养基(MS培养基)(Murashing T.,Skoog F."A received medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue culture".Physiol.Plant.1962.V.15,pp.473-497)。表1显示了所述原型的琼脂营养培养基的已知组成。

[0013] 表1：Murashing-Skoog培养基组合物

[0014]

[0015] 作为辅酶的一部分，诸如铁、铜和锌这样的金属在参与植物的调节和氧化还原过程中是必要的元素。MS培养基含有以盐离子形式存在的这些金属。

发明内容

[0016] 本发明的一个目的是提供一种在营养培养基上培养植物的方法，所述营养培养基含有必要元素的纳米粒子，该纳米粒子能够改善种子发芽，且能够改善植物的形态和/或生理参数，目的是获得改善的高质量种植材料。

[0017] 该任务通过所提出的植物培养方法来解决，该方法包括：在无菌条件下，在含有纳米粒子的琼脂营养培养基上使种子发芽并随后培养植物，其中，所述纳米粒子为铁纳米粒子、或锌纳米粒子、或铜纳米粒子，或它们的组合。

[0018] 本发明的另一个目的在于提出用于实施所要求保护的方法的营养培养基组合物。

[0019] 该任务通过提出的琼脂营养培养基的替代品来解决，所述替代品含有Murashing-Skoog培养基组合物中所含的成分，即，维生素：РР、В6和В1，甘氨酸，蔗糖，内消旋肌醇，螯合剂Na2EDTA×2H2O，无机盐：NH4NO3、KNO3、CaCl2×2H2O、MgSO4×7H2O、KH2PO4、KI、H3BO3、MnSO4×7H2O、NaMoO4×2H2O和CoCl2×6H2O，以及铁、锌和铜，其中，铁、或锌、或铜、或它们的组合分别以铁纳米粒子、或锌纳米粒子、或铜纳米粒子，或它们的组合的形式包含在所述营养培养基中。

[0020] 此外，所述营养培养基可以包含壳聚糖。

[0021] 所述营养培养基中，电中性铁的纳米粒子的浓度为10.0-0.06mg/L。

[0022] 所述营养培养基中，电中性锌的纳米粒子的浓度为3.0-0.016mg/L。

[0023] 所述营养培养基中，电中性铜的纳米粒子的浓度为0.04-0.00016mg/L。

[0024] 本发明的技术效果是刺激种子发芽并改善种植植物的形态和/或生理参数。

[0025] 本发明的本质实际上是在传统营养培养基上培养植物，除了以这种方式改进：将必要金属的盐，尤其是硫酸铁、或硫酸锌、或硫酸铜，或硫酸铁、硫酸锌和硫酸铜同时用这些金属电中性态的纳米粒子来代替，同时营养培养基的其它成分保持不变，与在未改进的营养培养基上种植的植物相比，本发明导致种植在这些培养基上的植物的种子能更好得发芽，并改善该植物的形态和/或生理参数。

[0026] 本发明是以作者关于金属纳米粒子对各种生物系统的结构和功能的影响的研究结果为基础的。(Glushchenko N.N.,BogoslovskayаO.A.,OlhovskayаI.P."Physical and chemical regularities of biological effect of high-disperse powders of metals"，Chemical physics.2002,V.21,№4,P.79-85；Publications on the website:http://nanobiology.narod.ru)。

[0027] 已经证明，电中性的金属纳米粒子的特征在于多功能和长效作用、低毒性(比相应的离子形式的金属低7-50倍)，并能够以生物剂量(即，比最大耐受剂量低10-50倍的剂量)积极地通过植物的器官和组织，从而刺激生命过程。

[0028] 进一步地，已知的作为植物和微生物群落生长代谢产物的吸收剂以及作为植物生长刺激因子的壳聚糖可以掺入要求保护的营养培养基中。已知壳聚糖对细菌具有高吸附活性，表现出生长促进作用，提高植物的适应能力，保护植物免受感染，提升更高的作物产量(Nyanikova G.G.,Mametnabiev T.E.,Kalinkin I.P.,Gepetskaya M.V.,Komissarchik S.M.,Eldinova E.Y."Applications of chitosan"http://science.spb.ru/)。本文使用的是壳聚糖Taynshi(中国)，该壳聚糖作为麻醉剂广泛用于中药中。一旦将壳聚糖补充到营养培养基中，就不会发生任何细菌菌群、真菌或霉菌污染。在某些情况下(如下所示)，记录了在营养培养基中共同作用的壳聚糖和金属纳米粒子的协同效应，导致进一步改善了在这些条件下种植的植物的种子发芽和生理及形态学参数。

附图说明

[0029] 以下列出解释本发明本质的附图及其简要说明。

[0030] 图1A-1C示出了铁纳米粒子、锌纳米粒子、铜纳米粒子的电子显微镜图像以及金属粒子尺寸分布的柱状图：1A-铁纳米粒子；1B-铜纳米粒子；1C-锌纳米粒子。

[0031] 图2A-2D示出了不同浓度的金属纳米粒子和壳聚糖(100mg/L)对Venice番茄种子发芽的影响：2A-含有铁纳米粒子的营养培养基；2B-含有锌纳米粒子的营养培养基；2C-含有铜纳米粒子的营养培养基；2D-含有铁纳米粒子、锌纳米粒子和铜纳米粒子的组合的营养培养基。

[0032] 图3A-3D显示了不同浓度的金属纳米粒子和壳聚糖(100mg/L)对LJ-king胡椒根长度的影响：3A-含有铁纳米粒子的营养培养基；3B-含有锌纳米粒子的营养培养基；3C-含有铜纳米粒子的营养培养基；3D-含有铁纳米粒子、锌纳米粒子和铜纳米粒子的组合的营养培养基。

[0033] 图4示出了在含有锌纳米粒子和壳聚糖的营养培养基上种植的LJ-king胡椒植物的照片：Zn-b0：对照物；Zn-b2：含有浓度为0.08mg/L的锌纳米粒子的营养培养基；Zn-b3：含有浓度为0.016mg/L的锌纳米粒子的营养培养基；Zn-b4：含有浓度为0.4mg/L的锌纳米粒子的营养培养基。

[0034] 图5A-5D示出了不同浓度的金属纳米粒子和壳聚糖(100mg/L)对HY-2番茄根长度的影响：5A-含有铁纳米粒子的营养培养基；5B-含有锌纳米粒子的营养培养基；5C-含有铜纳米粒子的营养培养基；5D-含有铁纳米粒子、锌纳米粒子和铜纳米粒子的组合的营养培养基。

[0035] 图6A-6D示出了不同浓度的金属纳米粒子和壳聚糖(100mg/L)对LJ-king胡椒、HY-2番茄和Venice番茄的根活性的影响：6A-含具有铁纳米粒子的营养培养基；6B-含有锌纳米粒子的营养培养基；6C-含有铜纳米粒子的营养培养基；6D-含有铁纳米粒子、锌纳米粒子和铜纳米粒子的组合的营养培养基。

[0036] 图7A-7C示出了不同浓度的金属纳米粒子和壳聚糖(100mg/L)对植物叶片中叶绿素含量的影响：7A-用于LJ-king胡椒的含有铁纳米粒子的营养培养基；7B-用于HY-2番茄的含有锌纳米粒子的营养培养基；7C-用于LJ-king胡椒的含有铜纳米粒子的营养培养基。

具体实施方式

[0037] 电中性的铁、锌和铜的纳米粒子使用装置Migen-3(记载于Jigatch A.N.,Leipunskii I.O.,Kuskov M.L.,Stoenko N.I.,Storozhev V.B."An apparatus for the production and study of metal nanoparticles",Instrum.Exp.Tech.43(2000)839-
845)按文献所描述的方法制备(AS SSSR№814432,Bull.inventions.1981,№11,С.25)。

[0038] 纳米粒子形状和尺寸的估算通过使用LEO 912AB OMEGA装置的透射电子显微镜(TEM)法进行。

[0039] 纳米粒子相组成的分析通过使用ADP-1衍射仪(俄罗斯)的X射线衍射分析(XRD)法进行。

[0040] 为了确定纳米粒子的平均直径，TEM图像通过采用计算机Micran 25程序处理(以测量至少一千个粒子直径为基础)。基于所获得的数据，根据金属纳米粒子的尺寸绘制其分布曲线，并且计算粒子的平均直径。

[0041] 金属纳米粒子的TEM图像和尺寸分布曲线示于图1A-1C中。铁纳米粒子的尺寸分布曲线位于5-80nm的区域中。铁粒子的平均直径为27.0±0.51nm。锌纳米粒子的尺寸分布曲线位于10-200nm的区域中。锌粒子的平均直径为54.0±2.8nm。铜纳米粒子的尺寸分布曲线位于5-225nm的区域内。铜粒子的平均直径为79.0±1.24nm。

[0042] 根据图1A-1C，铁纳米粒子、锌纳米粒子和铜纳米粒子是由半透明氧化物膜覆盖的具有圆形规则形状的单晶结构。

[0043] XRD分析结果表明铁纳米粒子的晶相含量如下：铁金属相等于53.6％，氧化铁相(Fe3O4)等于46.4％，氧化物膜的厚度为3.5nm。锌纳米粒子和铜纳米粒子由具有1.0-0.5nm厚度氧化物膜的晶体金属相组成。

[0044] 关于根据本发明的营养培养基的制备，任何已知的平衡营养培养基(含有对植物至关重要的所有有机和无机的常量营养素和微量营养素)制剂可以作为基础使用。因此，为了制备根据本发明的营养培养基，用电中性铁纳米粒子、电中性锌纳米粒子或电中性铜纳米粒子，或它们的组合分别代替铁盐、锌盐或铜盐或这些盐的组合而引入到培养基中，同时用作基础的营养培养基的其它组分保持不变。

[0045] 为了证明本发明实施的可能性，本文使用琼脂Murashing-Skoog营养培养基制剂(参见表1)为基础来制备根据本发明实施方式的营养培养基组合物。

[0046] 在本发明的实施方式中，铁纳米粒子、锌纳米粒子和铜纳米粒子浓度范围的选择考虑到在作为基础的培养基中离子形式的这些金属的含量。因此，以金属计，基础MS培养基中铁离子的浓度为5.6mg/L，本发明的实施方式中，营养培养基中电中性铁纳米粒子的浓度为10.0-0.06mg/L；在基础MS培养基中以金属计的锌离子的浓度为1.96mg/L，在本发明的实施方式中，营养培养基中的电中性锌纳米粒子的浓度为3.0-0.016mg/L；基础MS培养基中以金属计的铜离子的浓度为0.0064mg/L，在本发明的实施方式中，营养培养基中的电中性铜纳米粒子的浓度为0.04-0.00016mg/L。

[0047] 基础MS营养培养基储备液(对照组)和根据本发明实施方式的营养培养基的制备方法如下所述。

[0048] 1、制备MS营养培养基(对照组)

[0049] 根据表1给出的配方制备MS营养培养基。

[0050] 1.1、制备主要盐(常量营养素)的储备溶液。

[0051] 将以mg计的称重部分：NH4NO3 33000，KNO3 38000，CaCl2×2H2O 8800，MgSO4×7H2O 7400，KH2PO4 3400溶解在1升水中，在磁力搅拌器“IKA RH basic 2”(德国)上搅拌5分钟。

[0052] 1.2、制备微量盐(微量营养素)的储备溶液。

[0053] 将以mg计的称重部分：KJ 166，H3BO3 1240，MnSO4×7H2O 4460，ZnSO4×7H2O 1720，Na2MoO4×2H2O 50，CuSO4×5H2О5，CoCl2×6H2O 5溶解在1升水中，在磁力搅拌器上搅拌5分钟。

[0054] 1.3、制备铁螯合物的储备溶液。

[0055] 将以mg计的称重部分：Na2EDTA×2H2O 37.3和FeSO4×7H2O 27.8溶解在1升水中，在磁力搅拌器上搅拌5分钟。

[0056] 1.4、制备维生素和有机物的储备溶液。

[0057] 将以mg计的称重部分：肌醇100000，烟酸(PP)-500，吡哆醇-HCl(B6)-500，硫胺素-HCl(B1)500，甘氨酸2000溶解在1升水中，在磁力搅拌器上搅拌5分钟。

[0058] 准备以mg计的称重部分：粉末形式的蔗糖30000，琼脂7000。

[0059] 1.5、制备MS营养培养基。

[0060] 为了制备1L培养基，将50mL常量营养素的储备溶液，5mL微量营养素的储备溶液和5mL螯合铁的储备溶液以及1mL维生素和有机物的储备溶液溶解在800mL水中，核磁搅拌器搅拌5分钟。然后，加入蔗糖和琼脂的称重部分，并将体积调节至1000mL。

[0061] 在高压灭菌器“Hirayama，HVE-50”(日本)中，将营养培养基在120℃温度、0.1MPa压力下灭菌20分钟。

[0062] 将上述制备的Murashing-Skoog营养培养基作为对照组。

[0063] 2、制备添加有壳聚糖的营养培养基。

[0064] 将100mg壳聚糖Tyanshi(中国)加入到1L上述制备的无菌冷却至45℃的MS营养培养基中，并通过在磁力搅拌器上搅拌2分钟混合。

[0065] 3、制备含有金属纳米粒子的营养培养基。

[0066] 3.1、制备螯合剂溶液。

[0067] 将称重部分37.3mg Na2EDTA·2H2O溶于1L水中，同时在磁力搅拌器上搅拌5分钟。

[0068] 3.2、制备铁纳米粒子的水悬浮液。

[0069] 为了制备铁纳米粒子的储备水悬浮液，将2000mg含有电中性铁纳米粒子的粉末放入烧瓶中，并加入200mL无菌蒸馏水。然后，通过“Scientz JY 92-IIN”分散器(中国)以99％的功率将样品分散30秒，将该悬浮液在冰浴中冷却30秒，使温度为10-15℃。该分散过程重复三次。

[0070] 将9.0mL无菌蒸馏水加入到1.0mL制备的悬浮液中，并按以上描述进行分散和冷却。

[0071] 为了制备较小浓度的铁纳米粒子悬浮液，用无菌蒸馏水将该储备铁纳米粒子悬浮液稀释至所需的浓度，随后按照以上描述进行分散和冷却阶段。

[0072] 3.3、制备含有铁纳米粒子的营养培养基。

[0073] 将10mL铁纳米粒子的储备水悬浮液或其适当的稀释液(参见3.2)加入到1L第1部分描述所制备的无菌、冷却至45℃的营养培养基中，但不添加铁螯合物的储备溶液(参见1.3)，然后将5mL螯合剂(参见3.1)加入到溶液中代替铁螯合物的储备溶液。将该混合物在磁力搅拌器上搅拌2分钟。

[0074] 3.4、制备锌纳米粒子的水悬浮液。

[0075] 为了制备锌纳米粒子的储备水悬浮液，将600mg含有电中性锌纳米粒子的粉末放入烧瓶中，并加入200mL的蒸馏无菌水。然后，将样品以99％的功率分散30秒，并将悬浮液在冰浴中冷却30秒，使温度为10-15℃。该分散过程重复三次。

[0076] 将9.0mL无菌蒸馏水加入到1.0mL制备的悬浮液中，并按照对铁粉末所描述地进行分散和冷却过程(参见3.2)。

[0077] 为了制备较小浓度的锌纳米粒子悬浮液，用无菌蒸馏水将储备锌纳米粒子悬浮液稀释至所需的浓度，随后按照以上描述进行分散和冷却阶段。

[0078] 3.5、制备含有锌纳米粒子的营养培养基。

[0079] 将10mL锌纳米粒子的储备水悬浮液或其适当的稀释液(参见3.4)加入到1L按照第1部分制备的无菌、冷却至45℃的营养培养基中，但不添加硫酸锌。将该混合物在磁力搅拌器上搅拌2分钟。

[0080] 3.6、制备铜纳米粒子的水悬浮液。

[0081] 为了制备铜纳米粒子的储备水悬浮液，将8mg含有电中性铜纳米粒子的粉末放入烧瓶，并加入200mL无菌蒸馏水。然后，将样品以99％的功率分散30秒，该悬浮液在冰浴中冷却30秒，使温度为10-15℃。该分散过程重复3次。

[0082] 将9.0mL无菌蒸馏水加入到1.0mL制备的悬浮液中，并按照对铁粉末所描述地进行分散和冷却过程(见3.2)。

[0083] 为了制备较小浓度的铜纳米粒子悬浮液，用无菌蒸馏水将铜纳米粒子的储备水悬浮液稀释到必要的浓度，随后按以上描述进行分散和冷却阶段。

[0084] 3.7、制备含有铜纳米粒子的营养培养基。

[0085] 将10mL铜纳米粒子的储备水悬浮液或其适当的稀释液(参见3.6)加入到1L按照第1部分的描述制备的无菌、冷却至45℃的营养培养基中，但不添加硫酸铜。将该混合物在磁力搅拌器上搅拌2分钟。

[0086] 3.8、制备含有铁、锌和铜纳米粒子的水悬浮液。

[0087] 为了制备含有不同比例的铁纳米粒子、锌纳米粒子和铜纳米粒子的水悬浮液，将上述制备的所需浓度的水悬浮液(参见3.2、3.4和3.6)以每种2mL混合，并将样品用无菌蒸馏水调整至10mL，然后按照以上对铁纳米粒子所描述地进行分散并冷却(参见3.2)。

[0088] 3.9、制备含有铁纳米粒子、锌纳米粒子和铜纳米粒子的营养培养基。

[0089] 将10mL上述制备的金属纳米粒子悬浮液(参见3.8)加入到1L按照第1部分描述所制备的无菌、冷却至45℃的营养培养基中，但不添加铁螯合物(参见1.3)、硫酸锌(ZnSO4×7H2O)和硫酸铜(CuSO4×5H2O)的储备溶液。然后加入5mL螯合剂溶液(参见3.1)。将该混合物在磁力搅拌器上搅拌2分钟。

[0090] 将50mL上述制备的营养培养基(参见3.3、3.5、3.7和3.9)立即分装到200mL无菌瓶中，用聚乙烯膜或聚丙烯盖密封，并留在无菌室中冷却。

[0091] 根据所描述方法制备的营养培养基进一步用于种子发芽和植物培养。

[0092] 添加有浓度为100mg/L Tyanshi壳聚糖的含有金属纳米粒子的营养培养基样品的制备方法与第2部分描述的添加有壳聚糖的Murashing-Skoog营养培养基类似。

[0093] 本发明实现如下：

[0094] 将植物的种子置于无菌培养容器中，每个容器3颗种子，根据本发明，琼脂营养培养基的表面含有铁纳米粒子、锌纳米粒子或铜纳米粒子，或这些纳米粒子不同比例的组合。

[0095] 将该容器放在气候室(22-25℃、湿度为36％)的架子上，以每日3500-3000勒克斯12/12小时进行照明。使用标准MS培养基(对照组)和使用含有Tyanshi壳聚糖和/或金属纳米粒子的营养培养基(测试组)进行独立的每组实验。

[0096] 在第15天估计种子的发芽能力，种植植物的形态和生理参数在植物培养开始后第40天测定。

[0097] 重复7-10次获得的实验结果用Microsoft Excel Statistica 6.0计算机程序进行统计处理。结果的可靠性(p)采用Mann-Whitney的U-标准评估(Mann H.B.,Whitney D.R.Ann.Math.Statist.1947,V.18,№1,pp.50-60)。两种样品之间的差异在0.001≤p≤0.1时是统计显著的。

[0098] 以下是胡椒和番茄植物在根据本发明实施方式的营养培养基上发芽和生长的实施例，所述营养培养基含有不同浓度的铁纳米粒子、锌纳米粒子或铜纳米粒子，或它们的组合。这些实施例仅说明了本发明实施的可能性，但并不限制其实现的所有可能变型。

[0099] 实施例1：营养培养基组合物中的金属纳米粒子和壳聚糖对番茄种子发芽的影响。

[0100] 种子发芽以发芽指数的数值进行表征，发芽指数定义为发芽种子的数量相对于所取种子总数的百分比。种子发芽指数在植物培养开始后第15天测定。

[0101] 图2A-2D示出了在营养培养基组合物中，用金属纳米粒子代替金属盐，以及壳聚糖的补充(100mg/L)对Venice番茄种子发芽的影响。

[0102] 图2A显示在含有浓度为0.6-10.0mg/L的铁纳米粒子的营养培养基上，番茄种子的发芽指数提高13-27％(与对照组相比)。向含有铁纳米粒子的营养培养基中添加壳聚糖，显示发芽指数额外提高23-33％。

[0103] 如图2B所示，与对照组相比，在营养培养基中补充浓度为0.2-3.0mg/L的锌纳米粒子使种子的发芽指数增加了2-3倍。向含有1.0mg/L锌纳米粒子的营养培养基中添加壳聚糖，使发芽指数进一步提高13％。

[0104] 如图2C所示，与对照组相比，营养培养基中浓度为0.0008-0.04mg/L的铜纳米粒子使番茄种子发芽提高了2.0-2.8倍。将壳聚糖加入到含有浓度为0.0008mg/L和0.04mg/L的铜纳米粒子的营养培养基中，使种子发芽额外提高20％。

[0105] 如图2D所示，与对照组相比，将铁纳米粒子、锌纳米粒子和铜纳米粒子的混合物掺入到营养培养基中来代替这些金属的盐，也使番茄种子发芽得到改善，此外，培养基中纳米粒子的浓度越高，番茄种子的发芽指数越高。例如，与对照组相比，组合：铁纳米粒子(10.0mg/L)+锌纳米粒子(3.0mg/L)+铜纳米粒子(0.04mg/L)使番茄种子的发芽提高至2.7倍。壳聚糖添加到含有组合：铁纳米粒子(3.0mg/L)+锌纳米粒子(1.0mg/L)+铜纳米粒子(0.004mg/L))的营养培养基中，导致番茄种子的发芽指数进一步提高13％。

[0106] 实施例2：营养培养基组合物中的金属纳米粒子对胡椒和番茄植物形态指标的影响。

[0107] 植物的形态指标(发芽长度、根长度和绿色部分生物量产率)从植物在含有金属纳米粒子的营养培养基上培养(在上述条件下)开始后第40天测定。结果以在实验(测试组)和在对照组中获得的指数之间的百分比大小来表示。

[0108] 图3A-3D示出了营养培养基组合物中的金属纳米粒子对LJ-king胡椒的根长度的影响。

[0109] 从图3A中可以看出，与对照组相比，在含有浓度为0.06mg/L、0.3mg/L和3.0mg/L的铁纳米粒子代替离子形式的铁(以金属计为5.6mg/L)的营养培养基上培养胡椒，导致根长度分别增加了54％、118％和102％。培养基中铁纳米粒子的浓度比离子形式的铁几乎低两个数量级时，观察到这种积极的效果。

[0110] 图3B显示，与对照组相比，若胡椒在含有浓度为0.4mg/L、0.008mg/L和0.016mg/L的锌纳米粒子粒代替锌离子(以金属计为1.96mg/L)的营养培养基上培养，胡椒的根长度分别增加了71％、80％和62％。因此，锌纳米粒子的最佳浓度似乎比MS营养培养基中的锌离子的浓度低5-122倍。

[0111] 将壳聚糖补充到含有0.4mg/L锌纳米粒子的营养培养基中导致根长度额外增加了30％。

[0112] 图3C说明，与对照组相比，当胡椒种植在分别含有浓度为0.00016mg/L、0.0008mg/L和0.004mg/L的铜纳米粒子代替铜离子(以金属计为0.0064mg/L)的营养培养基上时，胡椒的根长度增加了34％、57％和54％。因此，铜纳米粒子的浓度比MS营养培养基中铜离子的浓度低1.6-40倍时，观察到积极的效果。

[0113] 图3D显示，与对照组相比，当在含有不同比例的Fe纳米粒子、Zn纳米粒子和Cu纳米粒子的组合代替铁离子、锌离子和铜离子的营养培养基上培养胡椒时，胡椒的根长度增加7-58％。其中纳米粒子为测试组的最小浓度(铁0.06mg/L，锌0.016mg/L和铜0.00016mg/L)的实验是例外。

[0114] 但图3D显示出低浓度金属纳米粒子和壳聚糖共同作用具有显著的协同效应，导致胡椒的根长度与对照组相比增加了40％。

[0115] 在含有壳聚糖和组合：铁纳米粒子(0.3mg/L)+锌纳米粒子(0.08mg/L)+铜纳米粒子(0.0008mg/L)的营养培养基的情况下也获得了类似的协同效应。

[0116] 作为说明，图4显示了种植在营养培养基上的LJ-king胡椒的发芽照片，其中，营养培养基中的锌盐被壳聚糖和锌纳米粒子的组合代替。很明显，与对照组相比，在营养培养基中存在浓度为0.016-0.4mg/L锌纳米粒子和壳聚糖有助于胡椒根系更积极地发育：根长度增加了1.6-1.8倍。将壳聚糖补充到含有浓度为0.4mg/L的锌纳米粒子的营养培养基中，使根长度额外增加了30％。

[0117] 图5A-5D示出了营养培养基组合物中的金属纳米粒子和壳聚糖对HY-2番茄根长度的影响。种植在含有浓度为0.06mg/L、0.3mg/L和3.0mg/L铁纳米粒子代替离子形式铁的营养培养基中的番茄表现出根长度分别增加了58％、31％和3％(参见图5A)。

[0118] 当番茄种植在分别含有浓度为0.016mg/L、0.08mg/L和0.4mg/L锌纳米粒子代替离子形式锌的营养培养基中时，根长度分别增加了1％、17％和38％。随着壳聚糖的补充，该结果分别增加了17％、2％和15％(参见图5B)。

[0119] 用浓度为0.0008mg/L的铜纳米粒子替代浓度为0.0064mg/L的铜离子导致番茄的根长度增加了24％(参见图5C)。

[0120] 当番茄种植在含有金属纳米粒子的组合(0.3mg/L铁+0.08mg/L锌+0.0008mg/L铜)和(3.0mg/L铁+0.4mg/L锌+0.004mg/L铜)而非离子形式金属的营养培养基中时，与对照组相比，番茄的根长度分别增加了7％和10％。在某些实验中，壳聚糖的添加促进了番茄根长度的进一步增加。例如，与对照组相比，在营养培养基中组合使用铁纳米粒子(3.0mg/L)、锌纳米粒子(0.4mg/L)、铜纳米粒子(0.004mg/L)和壳聚糖使番茄的根长度增加了70％。

[0121] 在培养基中包含金属纳米粒子对胡椒和番茄植物的发芽长度和绿色部分生物量具有积极影响。因此，将锌纳米粒子以0.08mg/L的浓度引入营养培养基中促使HY-2番茄发芽长度增加了1.2倍。壳聚糖补充到营养培养基中进一步将该指数增加了17％。

[0122] 将铁纳米粒子以3.0mg/L的浓度引入营养培养基中促使LJ-king胡椒发芽长度增加了4.7％。壳聚糖补充到营养培养基中进一步使该指数增加了8.9％。

[0123] 将锌纳米粒子以0.2mg/L的浓度引入营养培养基中促使Venice番茄发芽长度增加了15.5％。

[0124] 种植在含有锌纳米粒子(0.4mg/L)和壳聚糖的营养培养基上的LJ-king胡椒的绿色部分生物量比对照组中高出42％。与对照组相比，使用含有浓度为0.08mg/L的锌纳米粒子的营养培养基用于种植Venice番茄使其绿色部分生物量增加了80％。含有纳米粒子的组合(3.0mg/L铁+0.4mg/L锌+0.004mg/L铜)的营养培养基使Venice番茄的绿色部分生物量产量比对照组高出1.3倍。

[0125] 实施例3：营养培养基组合物中的金属纳米粒子对胡椒和番茄植物生理指标的影响。

[0126] 种植植物的生理指标(根活性和叶片的叶绿素含量)从植物培养(在上述条件下)开始后第40天记录。

[0127] 该结果以测试指数值与对照组指数值的百分比表示。测试值从含有金属纳米粒子的营养培养基获得，对照值从Murashing-Skoog营养培养基上获得。

[0128] 根活性通过所描述的氯化3-苯基四唑的还原来测定[Adebusoye O.Onanuga,Ping’an Jiang,Sina Adl."Effect of phytohormones,phosphorus and potassium on cotton varieties(Gossypium hirsutum)root growth and root activity grown in hydroponic nutrient solution",Journal of Agricultural Science.2012,Vol.4,N 3,pp.93-110]。

[0129] 图6A-6D显示了引入到营养培养基中代替相应的金属盐的金属纳米粒子对LJ-king胡椒和Venice番茄根活性的影响。

[0130] 从图6A明显可知，分别在含有浓度为0.06mg/L和0.3mg/L的铁纳米粒子的营养培养基上培养胡椒时，LJ-king胡椒的根活性提高了59％和58％。与对照组相比，在含有浓度为0.06mg/L、0.3mg/L和3.0mg/L的铁纳米粒子的营养培养基中培养的HY-2番茄植物，其根活性分别提高了37％、34％和48％。

[0131] 与对照组相比，在含有浓度为0.6mg/L、3.0mg/L和10.0mg/L的铁纳米粒子的培养基中培养Venice番茄植物，导致其根活性分别提高了112％、125％和76％。

[0132] 用锌纳米粒子代替营养培养基中的锌离子时，观察到类似的效果(参见图6B)。与对照组相比，LJ-king胡椒植物种植在含有浓度为0.016mg/L、0.08mg/L和0.4mg/L的锌纳米粒子的营养培养基中时，其根活性分别提高了31％、56％和38％。在这些情况下，与对照组相比，HY-2番茄的根活性分别提高了86％、8％和29％。

[0133] 与对照组相比，Venice番茄植物种植在含有浓度为0.2mg/L、1.0mg/L和3.0mg/L的营养培养基中时，其根活性分别提高了25％、15％和42％。

[0134] 图6C表明，种植在含有铜纳米粒子的营养培养基上的胡椒和番茄植物的根活性提高。

[0135] 在含有浓度为0.00016mg/L、0.0008mg/L和0.004mg/L的铜纳米粒子代替铜离子的营养培养基上培养胡椒，导致LJ-king胡椒的根活性分别提高了18％、61％和21％。与对照组相比，HY-2番茄的根活性分别提高了43％、151％和149％。

[0136] 与对照组相比，在含有浓度为0.0008mg/L、0.004mg/L和0.04mg/L的铜纳米粒子的营养培养基上培养Venice番茄，使其根活性分别提高了65％、10％和12％。

[0137] 大多数实验表明，在营养培养基中，这些金属纳米粒子的组合替代铁离子、锌离子和铜离子，提升了对根活性的积极影响(参见图6D)。

[0138] 在含有纳米粒子的组合：(0.06mg/L铁+0.016mg/L锌+0.00016mg/L铜)和(0.3mg/L铁+0.08mg/L的锌+0.0008mg/L的铜)和(3.0mg/L铁+0.4mg/L锌+0.004mg/L铜)代替离子形式的这些金属的营养培养基中培养胡椒，导致胡椒的根活性分别提高了98％、51％和91％。

[0139] 与对照组相比，在含有纳米粒子的组合：(0.06mg/L铁+0.016mg/L锌+0.00016mg/L铜)和(0.3mg/L铁+0.08mg/L锌+0.0008mg/L铜)代替离子形式的这些金属的营养培养基中培养HY-2番茄，导致HY-2番茄的根活性分别提高了33％和46％。

[0140] 与对照组相比，在含有纳米粒子的组合：(0.6mg/L铁+0.2mg/L锌+0.0008mg/L铜)和(3.0mg/L铁+1.0mg/L锌+0.004mg/L铜)代替离子形式的这些金属的营养培养基中培养Venice番茄，导致Venice番茄的根活性分别提高了43％和48％。

[0141] 在大多数情况下，将壳聚糖补充到含有金属纳米粒子的营养培养基中促使植物的根活性额外提高。

[0142] 叶片的叶绿素含量按照所描述地进行评估("Measurement  and Characterization by UV-VIS Spectroscopy UNIT F4.3",Current Protocols in Food Analytical Chemistry,2001,F4.3.1-F4.3.8)。所接收的结果由图7A-7C表示。

[0143] 图7A示出了将铁纳米粒子添加到营养培养基中代替硫酸亚铁对LJ-king胡椒植物的叶片的叶绿素含量的影响。已表明，与对照组相比，培养基中浓度为0.3mg/L和3.0mg/L的铁纳米粒子使叶绿素含量分别增加了5％和27％。将壳聚糖添加到营养培养基，与浓度为0.06mg/L和0.3mg/L铁纳米粒子一起导致胡椒叶片的叶绿素含量分别进一步增加了6％和
10％。

[0144] 图7B示出了将锌纳米粒子添加到营养培养基中代替硫酸锌对HY-2番茄叶片中叶绿素含量的影响。培养基中浓度为0.08mg/L和0.4mg/L的锌纳米粒子使HY-2番茄叶片的叶绿素含量分别增加了56％和108％。将壳聚糖额外引入到营养培养基中，若锌纳米粒子的浓度为0.016mg/L和0.08mg/L，该指数分别增加了48％和20％。

[0145] 图7C示出了将铜纳米粒子补充到营养培养基中代替硫酸铜对LJ-king胡椒叶片中叶绿素含量的影响。铜纳米粒子添加到营养培养基中，增加了LJ-king胡椒叶片的叶绿素含量。在铜的最低测试浓度0.00016mg/L下观察到最大效果，其中叶绿素的含量比对照组中高出59％。

[0146] 在含有0.0008mg/L铜纳米粒子的营养培养基中引入壳聚糖，胡椒叶片的叶绿素含量增加了75％。

[0147] 需重点注意地是，在营养培养基中，将离子形式的铁、锌和铜用这些金属的电中性金属纳米粒子代替，不会对植物的发育造成任何干扰：植物保持直立，具有发育良好的叶板(leaf plates)并保持了叶片更替和其它的物种特有特征。此外，植物对细菌、霉菌和真菌感染具有抵抗力。

[0148] 因此，要求保护以使用营养培养基为基础的植物种植方法，其中，营养培养基中的铁、锌和铜的盐部分或完全由这些金属的电中性纳米粒子代替。该方法能够生产具有致密茎的健康植物，该植物具有发达且有活性的根系，可以用作高质量的种植材料。

[0149] 所提出的营养培养基可用于生物技术研究，用于改善农产品的质量，用于气雾栽培技术和水培技术。所提出的在含有铁、铜和锌纳米粒子的营养培养基上种植植物的方法能用于在长期太空飞行的条件下为宇航员创造生命维持系统。