一种具有抗生作用的OZK1和OZK2化合物及其制备方法

摘要

本发明公开了一种具有抗生作用的OZK1和OZK2化合物及其制备方法，本发明通过将SchS10糖基转移酶基因失活，再使用干扰质粒进行抗性筛选，形成链霉菌Streptomyces sp.SCC‑2136/ΔschS10菌株，再对菌株的培养物进行提取和分离得到新化合物OZK1和OZK2；OZK1和OZK2化合物与Angucycline类抗生物同源，具有抗病毒、抗细菌、抗肿瘤、抗真菌的能力，具有巨大的市场价值。

权利要求

1.一种具有抗生作用的OZK1和OZK2化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，通过同源重组的方式，将SchS10糖基转移酶基因进行失活处理；

所述SchS10为合成Sch47554和Sch47555过程中使用的糖基转移酶基因，所述Sch47554和Sch47555是由链霉菌Streptomyces sp.SCC-2136或ATCC 55186产生的抗生物；

步骤二，使用干扰质粒进行抗性筛选，形成链霉菌Streptomyces sp.SCC-2136/ΔschS10菌株；

步骤三，对链霉菌Streptomyces sp.SCC-2136/ΔschS10菌株进行培养；

步骤四，对培养物进行破碎处理，再用提取剂对培养物进行提取，真空干燥得到提取物；

步骤五，对提取物进行初步分离，初步分离的各部分再进一步用高效液相色谱法进行分离，得到OZK1和OZK2化合物；

OZK1化合物的结构式为：

OZK2化合物的结构式为：

2.根据权利要求1所述的一种具有抗生作用的OZK1和OZK2化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，通过同源重组的方式，将SchS10糖基转移酶基因进行失活处理；

所述SchS10为合成Sch47554和Sch47555过程中使用的糖基转移酶基因，所述Sch47554和Sch47555是由链霉菌Streptomyces sp.SCC-2136或ATCC 55186产生的抗生物；

步骤二，对成功被失活的SchS10糖基转移酶基因使用干扰质粒进行抗性筛选，形成链霉菌Streptomyces sp.SCC-2136/ΔschS10菌株；

步骤三，对链霉菌Streptomyces sp.SCC-2136/ΔschS10菌株进行培养；

步骤四，提取链霉菌Streptomyces sp.SCC-2136/ΔschS10菌株的培养物中的各类基因片段进行PCR扩增，采用的引物如下所示：步骤五，对培养物进行破碎处理，再用提取剂对培养物进行提取，真空干燥得到提取物；

步骤六，对提取物进行初步分离，初步分离的各部分再进一步用高效液相色谱法进行分离，得到OZK1和OZK2化合物。

3.根据权利要求2所述的一种具有抗生作用的OZK1和OZK2化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤四中的基因提取采用真菌/细菌DNA微量提取试剂盒。

4.根据权利要求1所述的一种具有抗生作用的OZK1和OZK2化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤二中的干扰质粒为pRY10，所述pRY10携带有抗阿伯拉霉素基因；所述pRY10干扰质粒的制备过程为：aac为抗阿伯拉霉素基因，将目标片段schS10插入到原质粒的表达启动区域lacZ的插入位点之间，插入位点为HindIII和XbaI。

5.根据权利要求1所述的一种具有抗生作用的OZK1和OZK2化合物的制备方法，其特征在于，步骤三，对链霉菌Streptomyces sp.SCC-2136/ΔschS10菌株进行培养；具体培养过程为：将链霉菌Streptomyces sp.SCC-2136/ΔschS10菌株在YM平板上进行培养，添加阿伯拉霉素，28℃，10天；再将链霉菌Streptomycessp.SCC-2136/ΔschS10在YM平板上培养5天。

6.根据权利要求1所述的一种具有抗生作用的OZK1和OZK2化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤四中的提取剂的质量百分比的组份为：89％乙酸乙酯、10％甲醇，1％乙酸。

7.根据权利要求1所述的一种具有抗生作用的OZK1和OZK2化合物的制备方法，其特征在于，步骤五中的初步分离采用的方法为：使用硅胶柱在不同比例的氯仿/甲醇溶液处理下进行分离。

8.根据权利要求1所述的一种具有抗生作用的OZK1和OZK2化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，将UMW6 经过拜耳-维立格氧化反应得到SHUNT步骤二，将SHUNT 经过还原反应得到

步骤三，将步骤二得到的产物在酸性环境下经过质子化作用得到步骤四，将步骤三得到的产物经过6-还原，5、6-脱水，12-氧化，得到步骤五，将步骤四得到的产物经过SchS7糖基转移酶将 通过糖基化作用连接至其结构上，得到3'-Deoxyaquayamycin步骤六，将步骤五得到的产物经过SchS9糖基转移酶将 或 通过糖基化作用连接至其结构上，得到：OZK1 和OZK2

说明书

一种具有抗生作用的OZK1和OZK2化合物及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及抗生物领域，特别是Angucycline类抗生物的结构和制备方法。

背景技术

[0002] Angucycline类抗生物是一类由II型聚酮糖合成酶通过一系列连续反应合成的具有生物活性的天然产物。Angucyclines具有多种生物活性，例如抗病毒、抗细菌、抗肿瘤、抗真菌等。

[0003] Sch47554和Sch47555是由Streptomyces sp.SCC-2136(ATCC 55186)产生的，具有抗酵母及皮肤癣菌等多种真菌的能力。对于其完整生物合成的基因信息已有科学家进行研究报道(D.B.Basnet,T.-J.Oh,T.T.H.Vu,B.Sthapit,K.Liou,H.C.Lee,J.-C.Yoo,J.K.Sohng,Mol.Cells 2006,22,154–162)。其生物合成关键基因簇信息(NCBI accession号码为AJ628018)可以借助NCBI、UCSC、Ensembl等科研工具进行查询，使得我们能够分析这两种化合物在合成过程中各阶段关键酶的作用。

[0004] Sch47554和Sch47555的合成过程包含酶SchP6-8用于聚酮糖核心骨架的搭建、酶SchS1-6用于糖基的核苷酸活化。还包括一些剪切修饰酶，例如SchP4(芳香酶)、SchP5(酮还原酶)、SchP9(环化酶)、SchP10(氧合酶)以及剩余三种SchS7、SchS9和SchS10均为糖基转移酶。

[0005] 糖基转移酶能够将活化的糖基转移到受体分子上，通常是一些具有重要药用价值天然产物的合成和修饰步骤。区域和立体特异性连接的糖基在药物与生物靶标的结合以及许多天然产物的生物活性中起重要作用。例如，与具有三糖侧链的衍生物地霉素E相比，具有六糖侧链的地洛霉素A显示出强得多的抗肿瘤活性。糖基转移酶在药物与化学酶结合法或体内转化方面具有重要作用。

[0006] 在利用组合生物学方式研究解析基因功能的过程中，通过使schS9和schS10失活的方式，发现了两种新化合物OZK1和OZK2。

发明内容

[0007] 为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有抗生作用的OZK1和OZK2化合物及其制备方法，该化合物是在研究schS9及schS10基因功能时，发现的新化合物；与Angucycline类抗生物同源，具有抗病毒、抗细菌、抗肿瘤、抗真菌的能力，具有巨大的市场价值。

[0008] 为了实现所述目标，本发明采用如下的技术方案：

[0009] 一种具有抗生作用的OZK1和OZK2化合物，

[0010] OZK1化合物的结构式为：

[0011] OZK1化合物的结构式为：

[0012] 前述的一种具有抗生作用的OZK1和OZK2化合物的制备方法，

[0013] 包括如下步骤：

[0014] 步骤一，通过同源重组的方式，将SchS10糖基转移酶基因进行失活处理；

[0015] SchS10为合成Sch47554和Sch47555过程中使用的糖基转移酶基因，[0016] Sch47554和Sch47555是由链霉菌Streptomyces sp.SCC-2136或ATCC 55186产生的抗生物；

[0017] 步骤二，对成功被失活的SchS10糖基转移酶基因使用干扰质粒进行抗性筛选，形成链霉菌Streptomyces sp.SCC-2136/ΔschS10菌株；

[0018] 步骤三，对链霉菌Streptomyces sp.SCC-2136/ΔschS10菌株进行培养；

[0019] 步骤四，对培养物进行破碎处理，再用提取剂对培养物进行提取，真空干燥得到提取物。

[0020] 步骤五，对提取物进行初步分离，初步分离的各部分再进一步用高效液相色谱法进行分离，得到OZK1和OZK2化合物。

[0021] 前述的一种具有抗生作用的OZK1和OZK2化合物的制备方法，

[0022] 包括如下步骤：

[0023] 步骤一，通过同源重组的方式，将SchS10糖基转移酶基因进行失活处理；

[0024] SchS10为合成Sch47554和Sch47555过程中使用的糖基转移酶基因，[0025] Sch47554和Sch47555是由链霉菌Streptomyces sp.SCC-2136或ATCC 55186产生的抗生物；

[0026] 步骤二，对成功被失活的SchS10糖基转移酶基因使用干扰质粒进行抗性筛选，形成链霉菌Streptomyces sp.SCC-2136/ΔschS10菌株；

[0027] 步骤三，对链霉菌Streptomyces sp.SCC-2136/ΔschS10菌株进行培养；

[0028] 步骤四，提取链霉菌Streptomyces sp.SCC-2136/ΔschS10菌株的培养物中的各类基因片段进行PCR扩增，采用的引物如下所示：

[0029]

[0030] 步骤五，对培养物进行破碎处理，再用提取剂对培养物进行提取，真空干燥得到提取物。

[0031] 步骤六，对提取物进行初步分离，初步分离的各部分再进一步用高效液相色谱法进行分离，得到OZK1和OZK2化合物。

[0032] 前述的一种具有抗生作用的OZK1和OZK2化合物的制备方法，步骤四中的基因提取采用艾德科技-真菌/细菌DNA微量提取试剂盒。

[0033] 前述的一种具有抗生作用的OZK1和OZK2化合物的制备方法，步骤一，通过同源重组的方式，在SchS10的原始基因序列中选取一个763bp的片段，利用DNA连接酶与限制性内切酶将其与大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒相结合，最终导入链霉菌Streptomyces sp.SCC-2136中，将SchS10糖基转移酶基因进行失活处理；

[0034] SchS10为合成Sch47554和Sch47555过程中使用的糖基转移酶基因，[0035] Sch47554和Sch47555是由链霉菌Streptomyces sp.SCC-2136或ATCC 55186产生的抗生物。

[0036] 前述的一种具有抗生作用的OZK1和OZK2化合物的制备方法，步骤二中的干扰质粒为pRY10，所述pRY10携带有抗阿伯拉霉素基因；pRY10干扰质粒的制备过程为：aac为抗阿伯拉霉素基因，将目标片段schS10插入到原质粒的表达启动区域lacZ的插入位点之间，插入位点为HindIII和XbaI。

[0037] 前述的一种具有抗生作用的OZK1和OZK2化合物的制备方法，步骤三，对链霉菌Streptomyces sp.SCC-2136/ΔschS10菌株进行培养；所述具体培养过程为：将链霉菌Streptomyces sp.SCC-2136/ΔschS10菌株在YM平板上进行培养，添加阿伯拉霉素，28℃，10天；再将链霉菌Streptomyces sp.SCC-2136/ΔschS10在YM平板上培养5天，用于基因提取。

[0038] 前述的一种具有抗生作用的OZK1和OZK2化合物的制备方法，步骤四中的提取剂的质量百分比的组份为：89％乙酸乙酯、10％甲醇，1％乙酸。

[0039] 前述的一种具有抗生作用的OZK1和OZK2化合物的制备方法，步骤五中的初步分离采用的方法为：使用硅胶柱在不同比例的氯仿/甲醇溶液处理下进行分离。

[0040] 前述的一种具有抗生作用的OZK1和OZK2化合物的制备方法，包括如下步骤：

[0041] 步骤一，将UMW6 经过拜耳-维立格氧化反应得到SHUNT

[0042] 步骤二，将SHUNT 经过还原反应得到

[0043]

[0044] 步骤三，将步骤二得到的产物在酸性环境下经过质子化作用得到

[0045]

[0046] 步骤四，将步骤三得到的产物经过6-还原，5、6-脱水，12-氧化，得到[0047]

[0048] 步骤五，将步骤四得到的产物经过SchS7糖基转移酶将 通过糖基化作用连接至其结构上，得到3'-Deoxyaquayamycin

[0049] 步骤六，将步骤五得到的产物经过SchS9糖基转移酶将通过糖基化作用连接至其结构上，得到：

[0050] OZK1 和OZK2

[0051] 本发明的有益之处在于：

[0052] 本发明发现的OZK1和OZK2化合物是在研究schS9及schS10基因功能时，发现的新化合物；

[0053] 该化合物与Angucycline类抗生物同源，具有抗病毒、抗细菌、抗肿瘤、抗真菌的能力，具有巨大的市场价值。

附图说明

[0054] 图1是本发明化合物的合成流程图；

[0055] 图2是本发明化合物的生物合成路径图；

[0056] 图3是本发明制备方法得到的提取物中OZK1高解析度质谱图；

[0057] 图4是本发明制备方法得到的提取物中OZK2高解析度质谱图；

[0058] 图5是本发明的制备方法最后分离得到OZK1氢谱图；

[0059] 图6是本发明的制备方法最后分离得到的OZK2氢谱图；

[0060] 图7是本发明制备方法得到的OZK1和OZK2及其他关联化合物核磁数据；

[0061] 图8是pRY09干扰质粒构建图谱；

[0062] 图9是pRY10干扰质粒构建图谱；

[0063] 图10是本发明采用pRY09干扰质粒进行SchS9基因失活原理图；

[0064] 图11是本发明采用pRY10干扰质粒进行SchS10基因失活原理图；

[0065] 图12是Streptomyces ps.SCC-2136/ΔschS9和Streptomyces ps.SCC-2136/ΔschS10两个菌株的培养物进行高效液相色谱图。

具体实施方式

[0066] 以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

[0067] 一种具有抗生作用的OZK1和OZK2化合物，

[0068] OZK1化合物的结构式为：

[0069] OZK1化合物的结构式为：

[0070] 合成的方法如下所示：

[0071] 一种具有抗生作用的OZK1和OZK2化合物的制备方法，

[0072] 包括如下步骤：

[0073] 步骤一，通过同源重组的方式，在SchS10的原始基因序列中选取一个763bp的片段，利用DNA连接酶与限制性内切酶将其与大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒相结合，最终导入链霉菌Streptomyces sp.SCC-2136中，将SchS10糖基转移酶基因进行失活处理；

[0074] SchS10为合成Sch47554和Sch47555过程中使用的糖基转移酶；

[0075] Sch47554和Sch47555是由链霉菌Streptomyces sp.SCC-2136或ATCC 55186产生的抗生物。

[0076] 步骤二，对成功被失活的SchS10糖基转移酶基因使用干扰质粒进行抗性筛选，形成链霉菌Streptomyces sp.SCC-2136/ΔschS10菌株；

[0077] 如图9所示，作为一种实施例，干扰质粒为pRY10，pRY10自带抗阿伯拉霉素基因；pRY10干扰质粒的制备过程为：aac为抗阿伯拉霉素基因，将目标片段schS10插入到原质粒的表达启动区域lacZ的插入位点之间，插入位点为HindIII和XbaI。

[0078] 步骤三，对链霉菌Streptomyces sp.SCC-2136/ΔschS10菌株进行培养；具体培养过程为：将链霉菌Streptomyces sp.SCC-2136/ΔschS10菌株在YM平板上进行培养，添加阿伯拉霉素，28℃，10天；再将链霉菌Streptomyces sp.SCC-2136/ΔschS10在YM平板上培养5天，用于基因提取。

[0079] 步骤四，提取链霉菌Streptomyces sp.SCC-2136/ΔschS10菌株的培养物中的各类基因片段进行PCR扩增；作为一种实施例，基因提取采用艾德科技-真菌/细菌DNA微量提取试剂盒，需要说明的是，用其他品牌的试剂盒也可以；引物序列可参考文献为：D.B.Basnet,T.-J.Oh,T.T.H.Vu,B.Sthapit,K.Liou,H.C.Lee,J.-C.Yoo,J.K.Sohng,Mol.Cells 2006,22,154–162；采用的引物如下所示：

[0080]

[0081] 步骤五，对培养物进行破碎处理，再用提取剂对培养物进行提取，真空干燥得到提取物；作为一种实施例，提取剂的质量百分比的组分为：89％乙酸乙酯、10％甲醇，1％乙酸；需要说明的是：本发明对提取剂的组分不做限定，只要能够将培养物提取出来都在本发明的保护范围之内；步骤五得到的提取物用甲醇重溶后用于LC-MS质谱分析，得到如图3所示，OZK1的质谱分析图，如图4所示，OZK2的质谱分析图。

[0082] 步骤六，对提取物进行初步分离，初步分离的各部分再进一步用高效液相色谱法进行分离，得到OZK1和OZK2化合物；作为一种实施例，高效液相色谱法采用型号为Agilent Eclipse XDB-C18column，5μm,250mm×4.6mm的高效液相色谱仪，作为一种优选，硅胶采用60目的硅胶柱。作为一种实施例，初步分离的具体方法为：使用硅胶柱在不同比例的氯仿/甲醇溶液处理下进行分离。

[0083] 作为一种实施例，采用步骤六的方法，用60目的硅胶柱在不同比例氯仿/甲醇溶液处理下进行分离，分离的各部分进一步用高效液相色谱法(Agilent Eclipse XDB-C18column，5μm,250mm×4.6mm)进行分离，得到如图5所示，OZK1的色谱图，如图6所示，OZK2的色谱图。

[0084] 最后，核磁分析采用JEOL ECX-300以及Bruker AvanceIII HD Ascend-500NMR仪器，得到如图7所示的核磁分析图。

[0085] 如图2所示，确定其生物合成路径如下所示，

[0086] 一种具有抗生作用的OZK1和OZK2化合物的制备方法，包括如下步骤：

[0087] 步骤一，将UMW6 经过拜耳-维立格氧化反应得到SHUNT

[0088] 步骤二，将SHUNT 经过还原反应得到

[0089]

[0090] 步骤三，将步骤二得到的产物在酸性环境下经过质子化作用得到

[0091]

[0092] 步骤四，将步骤三得到的产物经过6-还原，5、6-脱水，12-氧化，得到[0093]

[0094] 步骤五，将步骤四得到的产物经过SchS7糖基转移酶将 通过糖基化作用连接至其结构上，得到3'-Deoxyaquayamycin

[0095] 步骤六，将步骤五得到的产物经过SchS9糖基转移酶将通过糖基化作用连接至其结构上，得到：OZK1
和OZK2

[0096] 为了更好的描述化合物的合成原理，OZK1和OZK2化合物的发现过程为：

[0097] SchS7、SchS9和SchS10这3个糖基转移酶在化合物Sch47554和Sch47555合成中扮演重要角色；为了了解schS7基因功能，通过组合生物学方式进行了解析，而通过使schS9和schS10失活的方式，我们不仅确定了它们各自的功能，还借此发现了两种新化合物。

[0098] sch基因簇包含3个糖基化转移酶的基因信息(schS7、schS9、schS10)。通过氨基酸序列进行同源性对比分析(使用Clustal Omega)我们确认SchS7是一种C-糖基转移酶、SchS9和SchS10分别是一种O-糖基转移酶。

[0099] 之前的序列分析(D.B.Basnet,T.-J.Oh,T.T.H.Vu,B.Sthapit,K.Liou,H.C.Lee,J.-C.Yoo,J.K.Sohng,Mol.Cells 2006,22,154–162)推测SchS9和SchS10是化合物Sch47554和Sch47555合成过程中分别对3-OH和4’-OH进行O-糖基修饰的O-糖基转移酶。通过同源重组的方式，我们将SchS9和SchS10基因进行失活处理，从而达到合成过程中相应O-糖基转移酶缺失的效果。

[0100] 如图8、9所示，构建干扰质粒的过程为：aac为抗阿伯拉霉素基因基因，将目标片段schS9或schS10插入到原质粒的表达启动区域lacZ的插入位点之间，插入位点为XbaI和HindIII；得到pRY09干扰质粒、pRY10干扰质粒。

[0101] 如图10、11所示，分别用pRY09、pRY10作为干扰质粒，这样成功被失活的SchS9和SchS10基因可以通过pRY09和pRY10自带的抗阿伯拉霉素基因进行抗性筛选。最终分别形成Streptomyces sp.SCC-2136/ΔschS9和Streptomyces sp.SCC-2136/ΔschS10两个菌株。如图12所示，对这两个菌株的培养物进行高效液相色谱法分析，发现这两个菌株均能合成urdamycin X和3'-deoxyaquayamycin(图12中的5和6)。不同的是，Streptomyces sp.SCC-
2136/ΔschS10菌株还产生了OZK1和OZK2两种新化合物(图12中的7和8)。

[0102] 结合图2和发现过程可知，schS9基因功能正常，schS10基因失活的情况下，可以得到OZK1和OZK2两种化合物；若schS10基因功能维持正常，微生物将消耗OZK1和OZK2用于合成sch47554和sch47555，从而无法达到本发明所期望的合成新化合物OZK1和OZK2的目的。

[0103] 本发明发现的OZK1和OZK2化合物是在研究schS9及schS10基因功能时，发现的新化合物；该化合物与Angucycline类抗生物同源，具有抗病毒、抗细菌、抗肿瘤、抗真菌的能力，具有巨大的市场价值。

[0104] 以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，所述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。