螺环化蒽醌类化合物及其制备方法和在制备钙通道激动剂中的应用转让专利
申请号 : CN201810373255.0
文献号 : CN108484626B
文献日 : 2020-06-12
发明人 : 漆淑华 , 徐新亚 , 潘冬艳
申请人 : 中国科学院南海海洋研究所
摘要 :
本发明公开了一个螺环化蒽醌类化合物Anthrininone A及其制备方法和在制备钙通道激动剂药物中的应用。所述的化合物Anthrininone A，其结构如式(Ⅰ)所示。本发明从一株海洋真菌Alternaria tenuissma JX156349 GDMCC No：60345的发酵液中分离得到新的具有可持续提高胞内钙流水平的蒽醌类化合物Anthrininone A，可用于钙通道激动剂药物先导化合物的研究。
权利要求 :
1.化合物Anthrininone A，其结构式如式(Ⅰ)所示，
2.一种权利要求1中所述的化合物Anthrininone A的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)制备真菌Alternaria tenuissma JX156349 GDMCC No：60345的发酵液；
(b)将步骤(a)得到的发酵液用大孔树脂吸附，接着用水冲洗大孔树脂去掉培养基成分，再用甲醇或乙醇冲洗大孔树脂得到甲醇或乙醇提取物；或将步骤(a)得到的发酵液用乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿溶剂萃取，浓缩得到乙酸乙酯提取物、二氯甲烷提取物或氯仿提取物；
(c)将步骤(b)所述甲醇提取物、乙醇提取物、乙酸乙酯提取物、二氯甲烷提取物或氯仿提取物经过正相硅胶柱层析，依次用二氯甲烷与甲醇体积比例分别为100:0,90:10,80:20,
70:30,60:40,50:50，0:100的二氯甲烷-甲醇系统梯度洗脱，收集用二氯甲烷与甲醇体积比例90:10冲洗下来的组份，该组分分别经过硅胶柱和凝胶柱层析得到粗品，经HPLC纯化，得到化合物Anthrininone A。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)中所述的发酵液是通过以下方法制备：将真菌Alternaria tenuissma JX156349 GDMCC No：60345在真菌适用的平板培养基中生长，待真菌长出孢子后，将真菌接种到发酵培养基中，于室温静置培养30天，得到发酵液，所述的发酵培养基为：每升含10g葡萄糖、20g甘露醇、20g麦芽糖、0.5g玉米淀粉、
10g味精、0.5gKH2PO4、3g酵母膏、30g海盐，余量为水，pH 6.5。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(b)所述的浓缩采用减压浓缩。
5.权利要求1中所述的化合物Anthrininone A或其药用盐在制备钙通道激动剂中的应用。
6.一种钙通道激动剂，其特征在于，含有权利要求1中所述的化合物Anthrininone A或其药用盐作为活性成分。
7.真菌Alternaria tenuissma JX156349 GDMCC No：60345在制备权利要求1中所述的化合物Anthrininone A中的应用。
说明书 :
螺环化蒽醌类化合物及其制备方法和在制备钙通道激动剂中
的应用
技术领域：
[0001] 本发明属于海洋生物领域，具体涉及一个螺环化蒽醌类化合物及其制备方法和在制备钙通道激动剂中的应用。背景技术：
[0002] 海洋真菌是研究和开发海洋新颖活性天然产物的重要资源。从海洋真菌中分离出的次级代谢产物被发现有许多重要的生物活性，如抗肿瘤、抗菌、抗氧化、抗病毒、抗附着等。链格孢属真菌有250多种，前人已从中发现许多生物活性显著的化合物。钙流信号涉及广泛的生理和病理过程。许多临床疾病如心律失常、心绞痛、心肌梗塞、高血压、肥厚性心肌病、动脉硬化、糖尿病、老年病、胆囊炎、关节炎、支气管炎、胃十二指肠球部溃疡等均与Ca2+的活动密切相关。钙流生物活性检测法被广泛用于测量细胞内钙流信号激动剂和拮抗剂。发明内容：
[0003] 本发明的第一个目的是提供具有可持续提高胞内钙流水平活性的一个新螺环化蒽醌类化合物Anthrininone A。
[0004] 本发明的一个化合物Anthrininone A或其药用盐，其结构式如式(Ⅰ)所示，[0005]
[0006] 本发明的第二个目的是提供一种化合物Anthrininone A的制备方法，其是从真菌Alternaria tenuissma JX156349 GDMCC No：60345的发酵液中分离得到的。
[0007] 优选，具体步骤如下：
[0008] (a)制备真菌Alternaria tenuissma JX156349 GDMCC No：60345的发酵液；
[0009] (b)将步骤(a)得到的发酵液用大孔树脂吸附，接着用水冲洗大孔树脂去掉培养基成分，再用甲醇或乙醇冲洗大孔树脂得到甲醇或乙醇提取物；或将步骤(a)得到的发酵液用乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿溶剂萃取，浓缩得到乙酸乙酯提取物、二氯甲烷提取物或氯仿提取物；
[0010] (c)将步骤(b)所述甲醇提取物、乙醇提取物、乙酸乙酯提取物、二氯甲烷提取物或氯仿提取物经过正相硅胶柱层析，依次用二氯甲烷与甲醇体积比例分别为100:0,90:10,80:20,70:30,60:40,50:50，0:100的二氯甲烷-甲醇系统梯度洗脱，收集用二氯甲烷与甲醇体积比例90:10冲洗下来的组份，该组分分别经过硅胶柱和凝胶柱层析得到粗品，经HPLC纯化，得到化合物Anthrininone A。
[0011] 进一步优选，步骤(a)中所述的发酵液是通过以下方法制备：将真菌Alternaria tenuissma JX156349 GDMCC No：60345在真菌适用的平板培养基中生长，待真菌长出孢子后，将真菌接种到发酵培养基中，于室温静置培养30天，得到发酵液，所述的培养基为：每升含10g葡萄糖、20g甘露醇、20g麦芽糖、0.5g玉米淀粉、10g味精、0.5gKH2PO4、3g酵母膏、30g海盐，余量为水，pH 6.5。
[0012] 进一步优选，步骤(b)所述的浓缩采用减压浓缩。
[0013] 本发明的螺环化蒽醌类化合物Anthrininone A经实验发现，在10μM浓度下具有可持续提高胞内钙流水平的功能。
[0014] 因此，本发明的第三目的是提供所述的化合物Anthrininone A或其药用盐在制备钙通道激动剂中的应用。
[0015] 本发明的第四个目的是提供一种钙通道激动剂，其含有所述的化合物Anthrininone A或其药用盐作为活性成分。
[0016] 本发明的第五个目的是提供真菌Alternaria tenuissma JX156349 GDMCC No：60345在制备化合物Anthrininone A中的应用。
[0017] 本发明从一株海洋真菌A.tenuissma JX156349 GDMCC No：60345的发酵液中分离得到1个新的具有可持续提高胞内钙流水平的化合物Anthrininone A，该化合物可以开发成钙通道激动剂药物的先导化合物。
[0018] 本发明的Alternaria tenuissma JX156349 GDMCC No：60345，于2018年4月3日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：中国广州广东省微生物研究所，其保藏编号为：GDMCC No：60345。附图说明：
[0019] 图1是各测试样品对胞内钙流水平的影响图，图中的各代号分别表示(见下图标注)。具体实施方式：
[0020] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0021] 实施例1：
[0022] 将葡萄糖10g，甘露醇20g，麦芽糖20g，玉米淀粉0.5g、味精10g，KH2PO40.5g，酵母膏3g，海盐30g混合，用水定容到1L，调节pH至6.5，得到1L培养基，按照此方式配置培养基。将该培养基装入约200个1000mL的三角烧瓶中，每瓶约300mL，在115℃高压蒸汽灭菌25分钟。
[0023] 将A.tenuissma JX156349 GDMCC No：60345在真菌适用的平板培养基中生长，待真菌长出孢子后，用竹签将真菌从平板上移至盛有水的三角瓶中，用移液枪将真菌接种到培养基中(1L三角瓶中盛有300ml培养基)，于室温(26℃)静置培养30天后，收取发酵液。
[0024] 将经上述培养基培养得到的发酵液60L用大孔树脂吸附，接着用水冲洗大孔树脂去掉培养基成分，再用乙醇(也可用甲醇)冲洗大孔树脂得到乙醇提取物，(发酵液也可用乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿萃取)，减压浓缩得到乙醇粗提物，将乙醇粗提物用正相硅胶(100-200目)干法拌样后，装入玻璃层析柱(H细硅胶)，常温减压柱层析，依次用二氯甲烷与甲醇体积比例分别为100:0,90:10,80:20,70:30,60:40,50:50，0:100的二氯甲烷-甲醇系统梯度洗脱，收集用二氯甲烷与甲醇体积比例90:10冲洗下来的组份，根据薄层层析情况合并各个流分，回收洗脱溶剂，蒸干流分用甲醇转移。收集用二氯甲烷体积分数为90％(二氯甲烷与甲醇体积比例为90:10)的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂冲洗下来的组份A。组分A经常压硅胶柱层析分离(直径3cm，柱长60cm，含H细硅胶填料)，用二氯甲烷/甲醇(v/v 100:0-50:50)为洗脱溶剂系统，梯度洗脱得到5个小组分，其中用二氯甲烷/甲醇(v/v 90:10)洗脱得到的组分经反相硅胶干法拌样后，装入玻璃层析柱(直径5cm，柱长50cm，含反相Rp-18填料)，常温减压柱层析，依次用甲醇体积分数为20％、30％、40％、50％、60％、70％和100％的水-甲醇系统梯度洗脱(甲醇比例不断加大)，收集甲醇体积分数为40％和50％的组分，将两组分合并后经过凝胶(直径10mm，柱长1600mm，凝胶为sephedexLH-20，流动相为体积比1:1的甲醇-氯仿)柱层析，得粗品，粗品采用高效液相制备分离，检测波长为280nm，流速为5mL/min，流动相为甲醇-水(v/v 46:54，含0.03％三氟乙酸)，色谱柱为phenomenex Gemini 10mm×
250mm，得到化合物1(tR＝6.7min)。该化合物在薄层层析中用二氯甲烷/甲醇(v/v 9:1)展开时Rf值约为0.27，紫外灯下显红色，稀硫酸显色为青色。
250mm，得到化合物1(tR＝6.7min)。该化合物在薄层层析中用二氯甲烷/甲醇(v/v 9:1)展开时Rf值约为0.27，紫外灯下显红色，稀硫酸显色为青色。
[0025] 结构推定：
[0026] 化合物1，1H和13C NMR谱数据如表1所示，通过高分辨质谱(HRESIMS)在m/z处给出准分子离子峰489.1754[M+H]+，结合NMR波谱数据，得知化合物的分子式为C25H29O10。1H NMR谱显示一个可交换的氢δH 12.51,一个氧甲基δH 3.84,一个甲基δH 1.19。13C NMR显示25个碳，包括2个羰基(δC 212.1,189.8),10个季碳(δC 179.8,153.2,138.3,133.1,128.9,122.0,109.8,101.9,69.0,43.2),5个次甲基(δC 99.0,70.6,66.2,64.7,47.6),6个亚甲基(δC 65.0,55.0,39.1,35.9,34.0,29.0),一个甲基(δC 25.4),一个甲氧基(δC 57.1)。这些数据表明该化合物有一个类似化合物dihydroaltersolanolA和altersolanol L的四氢蒽醌骨架。
[0027] HMBC谱显示以下相关：H-2和C-1,C-3,C-4,C-9a相关，H-5和C-6,C-8a,C-10,C-10a,C-21相关，H-7和C-8,C-8a相关，H-8和C-6,C-7,C-8a,C-9,C-10a相关，证明该化合物中含有四氢蒽醌骨架。此外，HMBC谱还显示H-11和C-4,C-12,C-13相关，H-13和C-4,C-14,C-15相关，H-14和C-4,C-12,C-13,C-15,C-16相关，H-16和C-14,C-15,C-17,C-18相关，H-17和C-
15,C-16,C-18,C-19相关，H-19和C-15,C-17,C-18相关，COSY谱显示H-13和H-14相关，H-17和H-16,H-18相关，H-18和H-17,H-19相关，表明存在如图所示的螺环融合的D/E/F-三环片段结构。HMBC谱显示H-11和C-3,C-4and C-4a相关，H-13和C-4相关，H-14和C-3,C-4,C-15相关，暗示四氢蒽醌骨架和螺环融合的D/E/F-三环片段结构通过C-4和C-10结合起来。
15,C-16,C-18,C-19相关，H-19和C-15,C-17,C-18相关，COSY谱显示H-13和H-14相关，H-17和H-16,H-18相关，H-18和H-17,H-19相关，表明存在如图所示的螺环融合的D/E/F-三环片段结构。HMBC谱显示H-11和C-3,C-4and C-4a相关，H-13和C-4相关，H-14和C-3,C-4,C-15相关，暗示四氢蒽醌骨架和螺环融合的D/E/F-三环片段结构通过C-4和C-10结合起来。
[0028] NOESY谱显示CH3-20和H-7,H-14,H-17,H-18相关，说明CH3-20,H-7,H-14,H-17,H-18在同侧。该化合物1的相对构型和绝对构型进一步通过X-单晶衍射得到确定，其中手性碳的绝对构型被确定为4R,6S,7R,14R,15R,17S,18R。因此该化合物1的结构被鉴定为如式(Ⅰ)所示，命名为化合物Anthrininone A。
[0029]
[0030] 表1：化合物1的1H和13C数据(500,125MHz,DMSO-d6,δppm)
[0031]
[0032]
[0033] 实施例2：化合物Anthrininone A钙流活性测试
[0034] 首先，细胞内游离钙离子进行Fluo-4/AM染色：从细胞培养箱中取出HEK293细胞(96孔板)。在显微镜下观察细胞形态，细胞分布状况，细胞健康程度。对生长状态良好的细胞进行染色。染色工作液配制：5μM Fluo-4/AM(Pluronic F127浓度为0.16％，现用现配)。轻轻吸去培养基，加入HBSS溶液清洗3次。吸出HBSS，每孔加入50μl染色工作液(可以覆盖细胞表面即可)，避光，在培养箱中孵育60分钟。从培养箱中取出96孔板，染色的孔用HBSS清洗
3次，每孔加入90μl，要尽量缓慢的轻轻加入溶液(放置2min)，然后轻轻吸去液体后，按此方法洗涤3次，充分洗去细胞外未负载的荧光染料。经过染色清洗后，每孔细胞中分别加入50μl HBSS溶液，37℃孵育10min。然后，FlexStation 3进行扫描：含有染色细胞的96孔板，实验设计如表2：
3次，每孔加入90μl，要尽量缓慢的轻轻加入溶液(放置2min)，然后轻轻吸去液体后，按此方法洗涤3次，充分洗去细胞外未负载的荧光染料。经过染色清洗后，每孔细胞中分别加入50μl HBSS溶液，37℃孵育10min。然后，FlexStation 3进行扫描：含有染色细胞的96孔板，实验设计如表2：
[0035] 表2
[0036] 试剂、样品 来源 工作液浓度 使用量 终浓度(100μL体系中)HEK293细胞 ATCC
对照物：Calciumionophore 合成化合物 20μM 50μl 10μM
化合物AnthrininoneA 送样筛选 20μM 50μl 10μM
Fluo-4/AM 1mM 5μM
F127 20％ 0.16％
对照物：Calciumionophore 合成化合物 20μM 50μl 10μM
化合物AnthrininoneA 送样筛选 20μM 50μl 10μM
Fluo-4/AM 1mM 5μM
F127 20％ 0.16％
[0037] 在加入化合物之前，预先检测基线约30s，共检测300s。
[0038] 实验结果如图1所示，从图1可以看出化合物Anthrininone A(即图1中编号DP-25)在10μM浓度下具有可持续提高胞内钙流水平的功能。由此可见化合物Anthrininone A可作为钙通道激动剂药物的先导化合物。