苦木内酯类化合物在防止海洋生物污损中的应用

摘要

本发明提供苦木内酯类化合物在防止海洋生物污损中的应用，涉及生物技术领域。所述苦木内酯类化合物的结构式为式Ⅰ，在式Ⅰ中，R1,R2,R3,R4分别选自“‑H”或“‑OH”或“‑CH3”或“‑COOR'”或“‑OOCR″”,其中R'为“‑H”或“‑CH3”，R″为碳原子数为3～7的脂肪链。所述苦木内酯类化合物对海洋污损生物尤其是藤壶类生物具有较强的抑制作用，且为无毒的天然活性化合物，在水体环境中能有效降解，不会造成环境污染，具有环境友好，安全性高的特点。

权利要求

1.苦木内酯类化合物在防止海洋生物污损中的应用，其特征在于，所述苦木内酯类化合物为鸦胆苦醇、鸦胆苦素J、鸦胆苦素D中的一种或两种以上，所述鸦胆苦醇、鸦胆苦素J、鸦胆苦素D的结构式见式Ⅱ-式Ⅳ：

2.根据权利要求1所述的苦木内酯类化合物在防止海洋生物污损中的应用,其特征在于，利用所述苦木内酯类化合物制备防污涂料。

3.根据权利要求2所述的苦木内酯类化合物在防止海洋生物污损中的应用,其特征在于，所述防污涂料包括抗污活性成分与成膜成分，所述抗污活性成分的加入量是成膜成分的重量的0.5％～25％；所述抗污活性成分为结构式为式Ⅱ-式Ⅳ的苦木内酯类化合物；所述成膜成分为可水解树脂、可溶性树脂或不溶性树脂。

4.根据权利要求3所述的苦木内酯类化合物在防止海洋生物污损中的应用,其特征在于，所述成膜成分为丙烯酸树脂、环氧树脂、聚酯树脂、聚氨酯树脂的一种或两种以上。

说明书

苦木内酯类化合物在防止海洋生物污损中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及苦木内酯类化合物在防止海洋生物污损中的应用。

背景技术

[0002] 海洋污损生物是对生长在船舶以及各种海洋人工设施表面的海洋动物、植物和微生物的总称，具有严重附着影响的代表性品种有细菌、硅藻、浒苔、石莼、藤壶、贻贝、苔藓虫等。污损生物的大量繁殖，会对船舶及其他海洋人工设施造成极大的危害，比如增加船舶航行阻力、堵塞管道、加速金属腐蚀、使海洋中仪表和机件失灵、威胁水产养殖等，对人类海洋经济活动带来诸多不利。海洋污损生物带来的危害给海洋运输、水产养殖等行业酿成巨大的经济损失，全球每年由海洋生物污损所造成的经济损失高达近百亿美元。

[0003] 自上世纪80年代发现天然防污剂(natural product antifoulants，NPAs)以来，天然产物一直是发现新型抗污损剂(或活性先导化合物)的重要来源，具有化学结构多样，作用机制多环节、毒副作用少的优势。目前，已从海洋和陆地生物中发现的NPAs主要包括有萜烯类、甾体、酚类、卤化物、皂苷类、以氨基酸衍生物为主的含氮化合物等。因海洋生物所产生的海洋天然产物具有其特定的生态功能，科研人员曾倾向于寻找海洋来源的抗污损活性天然产物，但由于海洋生物的取材不便或受培养技术的限制、活性物质成分含量极低且难以实现商业化大量供应，最终导致后期的商业化开发利用举步维艰。开发新型防污剂最大的挑战就是长期、可持续地提供大量的天然抗污损活性物质，而目前真正实现商业化发展的海洋天然产物防污剂极少，远远无法满足当前市场对价格低廉的新型抗污损剂的迫切需求。因此，在满足可持续发展的要求下，发现更多广谱高效、性质稳定、产量高的环境友好型NPAs具有特殊的重要性和迫切性，而来源丰富的陆生植物由于其特有的生物功能和酶功能，亦可作为开发NPAs的重要来源。

[0004] 我国有丰富的植物资源，常用的杀虫植物也有将近500种，为寻找无毒或低毒的NPAs提供了丰富的物质基础。鸦胆子(Bruceajavanica)是苦木科鸦胆子属植物，一种具有显著抗肿瘤和杀虫作用的常见植物，在广西地区经济林下有大面积种植，每年有上万吨鸦胆子因滞销而仅作为绿肥回馈经济林下，当地丰富的鸦胆子资源得不到充分的应用。申请人经过研究发现鸦胆子中的特征成分为苦木内酯，是一类降三萜类化合物，通常以五环或四环C20型母核结构最为常见，因其结构的多变性赋予鸦胆子苦木内酯成分的生物活性多样性，表现出抑制对海洋污损生物附着的效果，对藤壶类生物的附着抑制尤其明显。申请号为CN201610950469.0的中国专利，公开日2016.10.27，公开了一种鸦胆子提取物、提取方法及应用，指出鸦胆子提取物对线虫的抑制作用，从而具有较高的抗肿瘤活性。申请号为CN02139390.7的中国专利，公开日20030416，公开了一种水产动物寄生虫防治剂，指出鸦胆子提取物对车轮虫、小瓜虫、环虫和三代虫等具有较好的抑制作用。但是，均未指出对藤壶类生物的抑制作用，且未明确提取物中具体的有效活性成分。

发明内容

[0005] 本发明的发明目的是，针对上述问题，提供苦木内酯类化合物在防止海洋生物污损中的应用，苦木内酯类化合物有较强的抑制海洋污损生物的作用，尤其是对藤壶类生物具有较好的抑制作用，且为天然安全的无毒化合物，在水体环境中能有效降解，不会造成环境污染，具有环境友好，安全性高的特点。

[0006] 为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

[0007] 苦木内酯类化合物在防止海洋生物污损中的应用，所述苦木内酯类化合物的结构式为式Ⅰ：

[0008]

[0009] 在式Ⅰ中，R1,R2,R3,R4分别选自“-H”或“-OH”或“-CH3”或“-COOR'”或“-OOCR””,其中R'为“-H”或“-CH3”，R”为碳原子数为3～7的脂肪链。

[0010] 优选的，所述苦木内酯类化合物为鸦胆苦醇、鸦胆苦素J、鸦胆苦素D中的一种或两种以上，所述鸦胆苦醇、鸦胆苦素J、鸦胆苦素D的结构式见式Ⅱ-式Ⅳ：

[0011]

[0012] 优选的，所述苦木内酯类化合物从鸦胆子属植物中提取。

[0013] 优选的，所述苦木内酯类化合物从鸦胆子的根、茎、叶或果实中提取。

[0014] 优选的，所述苦木内酯类化合物的提取方法包括以下步骤：

[0015] S1.选取鸦胆子果实并干燥、粉碎，得到果实碎粒；然后将所述果实碎粒用乙醇浸泡、提取，得提取液.

[0016] S2.将所述提取液过滤、减压浓缩得浸膏；将所述浸膏分散在水中，依次用石油醚，乙酸乙酯以及正丁醇进行萃取、真空浓缩萃取液，分别得到石油醚萃取浸膏、乙酸乙酯萃取浸膏和正丁醇萃取浸膏。

[0017] S3.将所述乙酸乙酯萃取浸膏经正相硅胶柱层析，以氯仿-甲醇梯度洗脱，经TLC薄层层析检测合并主点相同的流分，得到E1-E11共11个组分。

[0018] S4.将所述组分E5经正相硅胶柱层析，以氯仿-甲醇梯度洗脱，检测合并相同主点流分，得到E5-1～E5-6共六个亚组分；将所述亚组分E5-6重结晶，以甲醇洗脱，得到鸦胆苦醇。

[0019] S5.将所述E9经中压MCI柱层析，以30％～100％的甲醇水梯度洗脱除去叶绿素并得到E9-1～E9-10共10个亚组分，将所述亚组分E9-4经Sephadex LH-20柱层析，甲醇为洗脱剂，得鸦胆苦素J。

[0020] S6.将所述亚组分E9-8经重结晶得到鸦胆苦素D。

[0021] 优选的，步骤S2和S3中，所述正相硅胶柱采用200～300目硅胶填料。

[0022] 优选的，步骤S3中，氯仿-甲醇按体积比95:5-40:60的比例洗脱；步骤S4中，氯仿-甲醇按体积比95:5-80:20的比例洗脱。

[0023] 优选的，利用所述苦木内酯类化合物制备防污涂料。

[0024] 优选的，所述防污涂料包括抗污活性成分与成膜成分，所述抗污活性成分的加入量是成膜成分的重量的0.5％～25％；所述抗污活性成分为结构式为式Ⅰ的苦木内酯类化合物；所述成膜成分为可水解树脂、可溶性树脂或不溶性树脂。

[0025] 优选的，所述成膜成分为丙烯酸树脂、环氧树脂、聚酯树脂、聚氨酯树脂的一种或两种以上。

[0026] 由于采用上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

[0027] 1.本发明的苦木内酯类化合物在防止海洋生物污损中的应用，苦木内酯类化合物对海洋污损生物有较强的抑制作用，尤其是对藤壶类生物具有较好的抑制作用，且作为天然存在的有机化合物，为无毒化合物，在自然环境中能有效降解，不会造成水体环境污染，具有环境友好，安全性高的特点。

[0028] 2.本发明的苦木内酯类化合物在防止海洋生物污损中的应用，所述苦木内酯类化合物，是通过生物活性追踪的方法，从鸦胆子中分离鉴定出来的，是鸦胆子中的主要成分，其获取工艺简单成熟，且该植物在广西地区经济林下有大面积种植，每年有上万吨的鸦胆子因滞销而仅作为绿肥回馈经济林下，适合大规模生产，具有可靠稳定的来源，推广应用潜力大。

[0029] 3.本发明苦木内酯类化合物在防止海洋生物污损中的应用，苦木内酯类化合物展现出较强的抑制海洋生物污损活性，可为防污涂料或其他抗污损产品的开发提供先导化合物，有着很好的应用前景。

具体实施方式

[0030] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0031] 实施例1

[0032] 实验验证：鸦胆子粗提物对纹藤壶幼虫附着的抑制活性

[0033] 材料来源：鸦胆子果实采于广西靖西，经广西大学马仲辉副教授鉴定为Bruceajavanica，标本保存于广西中医药大学中医药科学实验中心。

[0034] 鸦胆子提取物的制备：将干燥的鸦胆子果实粉碎后用95％乙醇溶液浸泡提取四次，第一次5d，后三次3d，提取液合并后减压浓缩得无乙醇浸膏。加水成混悬液，依次用石油醚，乙酸乙酯和正丁醇萃取，减压浓缩至干得石油醚萃取浸膏，乙酸乙酯萃取浸膏，正丁醇萃取浸膏，水萃取浸膏备用。

[0035] 采用抑制纹藤壶金星幼虫附着的实验模型测试了鸦胆子属植物鸦胆子的不同部位提取物抑制藤壶幼虫附着的能力。纹藤壶(Balanus amphitrite)成虫采自广西北仑河口红树林保护区的红树树干上。

[0036] 具体培养方法如下：获取藤壶无节幼虫后在28℃下用硅藻喂养，大约4d后发育至金星幼虫阶段。将金星幼虫过滤并保存在0.22μm滤膜过滤的海水中，置于4℃冰箱中过夜待用。待测样品用DMSO配制成10mg/mL的母液，然后再配制成不同浓度待测样品使用。将24孔板中每个孔放置1mL待测样品溶液，每个待测样品溶液包括3个重复，随后将15个藤壶幼虫轻轻地转移至每个含有待测溶液的孔中进行测试。将1μL DMSO加到1mL的过滤海水中，每孔放15个幼虫作为阴性对照。处理好的24孔板放置在28℃培养箱中15h亮：9h暗培养48h。待培养结束后，将24孔板置于显微镜下观察，并记录游动、附着和死亡的幼虫数。附着的幼虫个数和总幼虫个数比值为附着率。死亡幼虫个数和总幼虫个数的比值为死亡率，比值分别用百分比表示。每个样品在每个浓度下测试3个重复。通过Probit软件分析计算EC50和LC50，结果见表1。

[0037] 表1.鸦胆子不同部位提取物对纹藤壶(B.amphitrite)的抗污损活性及毒性评价[0038]

[0039] 本实施例对鸦胆子果实醇提物及各萃取部位进行了抗海洋污损生物幼虫附着活性初步测定，结果显示，不同部位的粗提物对所选海洋污损生物代表纹藤壶幼虫具有不同程度的抑制作用，其中以乙酸乙酯部位的抗污损活性最好。由表1结果可知，有机相部位的EC50值大部分都小于美国海军定的天然防污剂标准(EC50≤25μg/mL)，并且EC50值都低于LC50值，表明提取物中含有低毒或者无毒的抗纹藤壶幼虫附着活性物质，揭示鸦胆子可作为防治海洋污损生物的有效资源做进一步的开发利用。尤其是乙酸乙酯萃取部位的抗污损活性最高。

[0040] 实施例2从鸦胆子果实中分离防止海洋生物污损的苦木内酯类化合物

[0041] 所述苦木内酯类化合物的提取方法包括以下步骤：

[0042] S1.将干燥鸦胆子果实粉碎后用95％乙醇溶液浸泡提取四次，第一次浸泡5d，后三次各浸泡3d，将4次的提取液合并。

[0043] S2.将合并后的提取液减压浓缩得浸膏。将所述浸膏加水成混悬液，依次用石油醚，乙酸乙酯和正丁醇萃取，减压浓缩至干得石油醚萃取浸膏(138.8g)，乙酸乙酯萃取浸膏(200.0g)，正丁醇萃取浸膏(189.0g)，水部分。

[0044] S3.取乙酸乙酯萃取浸膏(200.0g)经200～300目正相硅胶柱层析，以氯仿-甲醇体积比为95:5-40:60的比例梯度洗脱，经TLC薄层层析检测合并主点相同的流分，得到E1-E11共11个组分。

[0045] S4.将所述组分E5(10.0g)经200～300目正相硅胶柱层析，以氯仿-甲醇体积比为95:5-80:20)的比例梯度洗脱，检测合并相同主点流分，得到E5-1～E5-6共六个亚组分。将亚组分E5-6反复重结晶，以甲醇洗脱，得到化合物1。

[0046] S5.将所述E9经中压MCI柱层析，以30％～100％的甲醇水梯度洗脱除去叶绿素并得到E9-1～E9-10共10个亚组分，将所述亚组分E9-4经Sephadex LH-20柱层析，甲醇为洗脱剂，得化合物2；

[0047] S6.将所述亚组分E9-8经反复重结晶得到得化合物2。

[0048] 将化合物1、化合物2、化合物3的化学结构用核磁共振谱(1HNMR，13CNMR，DEPT,HSQC,HMBC,1H-1H COSY),ESI-MS等波谱图鉴定。

[0049] 化合物1的理化数据：白色无定形粉末，Mp 276-278℃,分子式为C26H32O11；ESI-MS m/z:521[M+H]+,543.3[M+Na]+,559[M+K]+,519[M–H]–555[M+Cl]-；1H NMR(400MHz,DMSO):δ7.87(1H,s,3-OH),5.62(1H,s,H-2'),4.92(1H,s,H-7),4.87(1H,d,J＝4.8Hz,11-OH),4.48(1H,d,J＝7.2Hz,H-17a),4.09(1H,d,J＝4.5Hz,H-12),3.97(1H,t,J＝4.2Hz,H-11),3.60(4H,m,H-17b,21-OCH3),3.29(1H,m,12-OH),2.89(1H,d,J＝12.9Hz,H-5),2.63(2H,s,H-
1),2.16(1H,d,J＝4.3Hz,H-9),2.10(3H,s,4'-CH3),2.07(1H,m,H-6a),1.90(3H,s,5'-CH3),1.76–1.66(4H,overlapped,H-6b,18-CH3),1.22(3H,s,19-CH3)；13C NMR(100MHz,DMSO):δ192.8(C-2),170.0(C-20),167.3(C-16),164.1(C-1'),158.3(C-3'),144.2(C-3),
128.3(C-4),114.8(C-2'),82.5(C-7),81.2(C-12),74.6(C-12),72.2(C-17),71.4(C-11),
67.2(C-15),52.1(21-OCH3),48.7(C-1),44.7(C-10),41.1(C-5),40.5(C-8),28.6(C-6),
26.9(4'-CH3),19.9(5'-CH3),15.0(19-CH3),13.2(18-CH3)。

[0050] 化合物2的理化数据：无色透明针晶，Mp 224-227℃,分子式为C25H32O11；ESI-MS m/z:509[M+H]+,531[M+Na]+,547[M+K]+,507[M–H]–,543[M+Cl]-；1H NMR(400MHz,C5D5N):δ7.94(1H,br s,3-OH),5.12(1H,overlapped,H-15),5.11(1H,overlapped,H-17b),5.05(1H,s,H-12),4.81(1H,d,J＝4.3Hz,H-11),4.03(1H,s,H-7),3.96(1H,d,J＝6.4Hz,H-17a),3.29(1H,d,J＝16.0Hz,H-5),3.02(1H,br s,H-1ax),2.60(1H,d,J＝4.2Hz,H-9),2.49(1H,d,J＝15.6Hz,H-1eq),2.34–2.25(3H,m,H-2'a,H-2'b,H-6ax),2.19(1H,dt,J＝13.7,6.8Hz,H-3'),1.94(3H,s,18-CH3),1.73(1H,t,J＝12.8Hz,H-6eq),1.63(3H,s,19-CH3),0.84(3H,d,J＝6.5Hz,4'-CH3),0.81(3H,d,J＝6.5Hz,5'-CH3)；13C NMR(100MHz,C5D5N):δ193.2(C-2),
174.1(C-20),172.0(C-1'),168.5(C-16),146.1(C-3),128.4(C-4),84.0(C-7),82.8(C-
13),76.5(C-12),73.8(C-11),73.0(C-17),68.7(C-15),50.2(C-14),49.7(C-1),46.3(C-
8),43.4(C-5),42.5(C-2'),42.4(C-9),41.5(C-10),29.7(C-6),25.7(C-3'),22.5(4'-CH3),22.5(5'-CH3),15.8(19-CH3),13.5(18-CH3)。

[0051] 化合物3的理化数据：无色透明针晶，Mp 294-296℃,分子式为C20H26O9；ESI-MS m/z:411.2[M+H]+,433.3[M+Na]+,449[M+K]+,409[M–H]–445[M+Cl]-；1H NMR(400MHz,DMSO):δ5.98(1H,s,H-3),5.35(1H,d,J＝5.1Hz,12-OH),5.34(1H,d,J＝6.1Hz,15-OH),5.25(1H,d,J＝3.2Hz,1-OH),5.12(1H,s,1H,14-OH),4.96(1H,d,J＝6.1Hz,H-15),4.92(1H,br s,H-
7),4.39(1H,t,J＝5.3Hz,H-11),4.30(1H,d,J＝6.9Hz,H-17α),4.26(1H,d,J＝3.2Hz,H-
1),3.68(1H,d,J＝5.7Hz,11-OH),3.60(1H,d,J＝6.9Hz,H-17β),3.54(1H,d,J＝5.1Hz,H-
12),2.89(1H,br d,J＝12.6Hz,H-5),2.32(1H,d,J＝4.7Hz,H-9),2.18–2.10(1H,dt,J＝
14.8,2.8Hz,H-6α),1.74–1.64(1H,ddd,J＝14.8,2.8Hz,H-6β),1.89(s,3H,18-CH3),1.24(s,3H,19-CH3),1.04(s,3H,20-CH3)；13C NMR(100MHz,DMSO):δ198.4(C-2),173.8(C-16),
163.5(C-4),124.1(C-3),83.2(C-14),81.5(C-12),80.9(C-1),79.9(C-11),78.7(C-13),
73.8(C-7),69.1(C-17),68.6(C-15),48.8(C-8),47.7(C-10),43.8(C-5),42.4(C-9),27.2(C-6),22.2(C-18),18.4(C-20),11.0(C-19)。

[0052] 根据分析化合物1～3的波谱数据，结合参考文献，分别鉴定为鸦胆苦醇，鸦胆苦素J，鸦胆苦素D。

[0053] 测定所述苦木内酯类化合物的抗藤壶幼虫附着活性：

[0054] 采用抑制纹藤壶金星幼虫附着的实验模型测试所述苦木内酯类化合物抑制藤壶幼虫附着的能力。

[0055] 纹藤壶成虫采自广西北仑河口红树林保护区的红树树干上。培养方法为：将获取的藤壶无节幼虫后在28℃下用硅藻Chaetoceros gracilis Schutt喂养，大约4d后发育至金星幼虫阶段。将金星幼虫过滤并保存在0.22μm滤膜过滤的海水中，置于4℃冰箱中过夜待用。待测样品用DMSO配制成10μM的母液，然后再配制成不同浓度待测样品使用。将24孔板中每个孔放置1mL待测样品溶液，每个待测样品溶液包括3个重复，随后将15个藤壶幼虫轻轻地转移至每个含有待测溶液的孔中进行测试。将1μL DMSO加到1mL的过滤海水中，每孔放15个幼虫作为阴性对照。处理好的24孔板放置在28℃培养箱中15h亮：9h暗培养48h。待培养结束后，将24孔板置于显微镜下观察，并记录游动、附着和死亡的幼虫数。附着的幼虫个数和总幼虫个数比值为附着率。死亡幼虫个数和总幼虫个数的比值为死亡率，比值分别用百分比表示。每个样品在每个浓度下测试3个重复。通过Probit软件分析计算EC50和LC50，结果见表2。

[0056] 表2苦木内酯类化合物对纹藤壶(B.amphitrite)金星幼虫的抗污活性评价

[0057]

[0058] 本实施例对乙酸乙酯的萃取部分进行分离，并进行测试鉴定和抗海洋污损生物幼虫附着活性测试。根据参考文献表明毒效比LC50/EC50大于15以上的抗污损活性化合物为无毒抗污损活性化合物，表2数据可以看出供试化合物对纹藤壶幼虫附着具有强抑制作用，其中鸦胆苦醇、鸦胆苦素J和鸦胆苦素D的毒效比LC50/EC50值均大于15，表明这些成分是通过非急性毒性作用抑制海洋污损生物幼虫附着的，对环境是安全无毒的。发现主要成分鸦胆苦醇、鸦胆苦素J和鸦胆苦素D对藤壶幼虫附着均具有“显著的抑制作用，EC50值均低于10μM，但其毒性作用却有所不同，说明不同取代基对苦木内酯的抗污损活性具有很大的影响作用。通过苦木内酯类成分初步的构效关系(SAR)分析发现，A环中具有一个α,β不饱和酮基结构和/或羰基C的α位上的羟基(3-OH)可以明显增强苦木内酯类的抗污活性，同时15位侧链具有不同程度亲脂性的酯基结构和21位酯羰基C结构上的不同取代均能影响苦木内酯类化合物的抗污活性。

[0059] 实施例3一种防污涂料

[0060] 一种防污涂料，包括抗污活性成分与成膜成分，所述抗污活性成分的加入量是成膜成分的重量的5％；所述抗污活性成分为质量比为1:1:1的鸦胆苦醇，鸦胆苦素J和鸦胆苦素D；所述成膜成分为聚氨酯树脂。

[0061] 制备方法：按比例将所述抗污活性成分与聚氨酯树脂混合，并加入成膜助剂、分散剂、消泡剂，然后进行分散制得所述防污涂料。

[0062] 实施例4一种防污涂料

[0063] 一种防污涂料，包括抗污活性成分与成膜成分，所述抗污活性成分的加入量是成膜成分的重量的15％；所述抗污活性成分为实施例1中制备的乙酸乙酯萃取浸膏。所述成膜成分为丙烯酸树脂。

[0064] 制备方法：按比例将所述抗污活性成分与丙烯酸树脂混合，并加入成膜助剂、分散剂、消泡剂，然后进行分散制得所述防污涂料。

[0065] 上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围。凡本发明所提示的技术构思下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。