短发夹RNA(SHRNA734)及其用于阳性选择和消除遗传修饰的细胞的用途

摘要

针对人类次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)的强效短发夹RNA(shRNA734)通过调节和体内选择策略来提高基因修饰的干细胞的植入速率，所述调节和体内选择策略赋予对临床可用的鸟嘌呤类似物抗代谢物6TG的抗性，以实现基因修饰干细胞的有效阳性选择。包含shRNA734的多核苷酸的用途包括用于敲除细胞中的HPRT的方法，用于在细胞中赋予鸟嘌呤类似物抗代谢物抗性的方法，用于产生可选择的遗传修饰细胞的方法，用于从多个细胞中选择用目的基因遗传修饰的细胞的方法，用于从多个细胞中去除用目的基因遗传修饰的细胞的方法，以及用于治疗感染HIV的受试者的方法。

权利要求

1.一种多核苷酸，其包含编码短发夹核糖核酸分子734(shRNA734)的核酸序列，其中所述shRNA734核酸序列是如SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述的多核苷酸，其还包含表达控制序列。

3.如权利要求2所述的多核苷酸，其为病毒载体。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其中所述表达控制序列包含所述shRNA734上游的5'长末端重复序列(LTR)和所述shRNA734下游的3'LTR。

5.如权利要求4所述的多核苷酸，其还包含位于所述5'LTR下游和所述shRNA734上游的目的基因。

6.如权利要求5所述的多核苷酸，其中所述目的基因是CCR5的抑制剂。

7. 如权利要求6所述的多核苷酸，其中所述CCR5抑制剂(CCR5shRNA)的核苷酸序列是如SEQ ID NO：2所示。

8. 如权利要求7所述的多核苷酸，其为载体，所述载体从5’末端到3’末端包括5'长末端重复序列(LTR)、人H1 RNA启动子、CCR5shRNA (SEQ ID NO: 2)、人7SK RNA启动子(SEQ ID NO：5)、shRNA734 (SEQ ID NO: 1)、人泛素启动子、绿色荧光蛋白或HIV融合抑制剂和3'长末端重复序列(LTR)。

9.一种药物组合物，其包含如权利要求2所述的多核苷酸。

10. 一种用于在细胞中敲除次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)的方法，所述方法包括在允许在所述细胞中表达SEQ ID NO：1的条件下使所述细胞与如权利要求2所述的多核苷酸接触。

11. 一种在细胞中赋予鸟嘌呤类似物抗代谢物抗性的方法，所述方法包括在允许在所述细胞中表达SEQ ID NO：1的条件下使所述细胞与如权利要求2所述的多核苷酸接触。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述鸟嘌呤类似物抗代谢物是6‑硫鸟嘌呤(6TG)。

13. 一种产生可选择的遗传修饰细胞的方法，所述方法包括在允许表达所述目的基因和SEQ ID NO：1的条件下使多个细胞与如权利要求5所述的多核苷酸接触。

14.如权利要求13所述的方法，其还包括从所述多个细胞中去除未修饰的细胞，其中所述去除包括用鸟嘌呤类似物抗代谢物处理与所述多核苷酸接触的所述多个细胞。

15.如权利要求13所述的方法，其还包括从所述多个细胞中去除所述经遗传修饰的细胞，其中所述去除包括用甲氨蝶呤(MTX)处理所述多个细胞。

16. 一种选择用目的基因遗传修饰的细胞的方法，所述方法包括：

(a)使包含遗传修饰细胞的多个细胞接触，其中在允许表达所述目的基因和SEQ ID NO：1的条件下用如权利要求5所述的多核苷酸来修饰所述经遗传修饰的细胞；和(b)从所述多个细胞中去除未修饰的细胞，其中所述去除包括用鸟嘌呤类似物抗代谢物处理与所述多核苷酸接触的所述多个细胞。

17. 一种去除用目的基因遗传修饰的细胞的方法，所述方法包括：

(a)使包含遗传修饰细胞的多个细胞接触，其中在允许表达所述目的基因和SEQ ID NO：1的条件下用如权利要求5所述的多核苷酸来修饰所述经遗传修饰的细胞；和(b)从所述多个细胞中去除所述经遗传修饰的细胞，其中所述去除包括用甲氨蝶呤(MTX)处理所述多个细胞。

18.如权利要求1‑8中任一项所述的多核苷酸在制备用于治疗感染HIV的受试者的药物中的用途，所述用途包括：(a)在允许表达所述目的基因和SEQ ID NO：1的条件下，使已经用如权利要求1‑8中任一项所述的多核苷酸修饰的多个造血干/祖细胞(HSPC)接触；

(b)用鸟嘌呤类似物抗代谢物处理与所述多核苷酸接触的所述多个细胞，以形成纯化的遗传修饰细胞群；和(c)将所述纯化的遗传修饰细胞群给予所述受试者。

说明书

短发夹RNA(SHRNA734)及其用于阳性选择和消除遗传修饰的

细胞的用途

[0001] 本申请要求2016年2月19日提交的美国临时专利申请号62/297,432的权益，其全部内容通过引用并入本申请中。

[0002] 关于联邦政府资助研究的声明

[0003] 本发明是在国立卫生研究院授予的AI028697，AI117941的政府支持下完成的。政府在本发明中具有某些权利。

[0004] 参考通过EFS‑WEB提交的序列表

[0005] 大小为3kb的名为“UCLA239WOU1_SL”的序列表的ASCII文本文件的内容于2017年2月17日创建，并通过EFS‑Web与本申请一起以电子方式提交。序列表通过引用整体并入本文。

技术领域

[0006] 本发明涉及核酸分子，包括短发夹核糖核酸分子(shRNA)和包含和/或编码其的多核苷酸，其可用于敲除(例如，沉默表达)次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)，以及使用这些核酸分子的方法。这些方法包括，例如，敲除细胞中HPRT的方法，在细胞中赋予鸟嘌呤类似物抗代谢物抗性的方法，产生可选择的遗传修饰细胞的方法，从多个细胞中选择用目的基因来遗传修饰的细胞的方法，从多个细胞中去除用目的基因来遗传修饰的细胞的方法，以及治疗患有疾病或病症的受试者，例如感染HIV的受试者的方法。

背景技术

[0007] 修饰人类干细胞的基因治疗策略对于治愈许多人类疾病具有很大的希望。然而，之前的临床研究取得了有限的成功，主要是由于基因修饰干细胞的低植入。克服这一挑战的一种策略涉及设计其中HPRT表达被敲除的干细胞，从而通过赋予对鸟嘌呤类似物抗代谢物的抗性来促进遗传修饰细胞的选择。

[0008] 虽然已经尝试破坏HPRT，但仍需要直接靶向HPRT基因的更有效的材料和方法。

发明内容

[0009] 本发明通过提供包含短发夹核糖核酸分子734(shRNA734)的多核苷酸及其使用方法满足了这些需要和其他需要。本发明提供了一种基于小RNA的化学选择策略，该策略可用于改善基于干细胞的基因治疗策略的遗传修饰细胞的植入。

[0010] 在典型的实施方案中，shRNA734核酸编码序列是SEQ ID NO：1。在一些实施方案中，多核苷酸还包含表达控制序列。在一些实施方案中，表达控制序列包含shRNA上游的5'长末端重复序列(LTR)和shRNA734下游的3'LTR。

[0011] 在一个实施方案中，多核苷酸还包含位于5'LTR下游和shRNA734上游的目的基因。在一个实施方案中，目的基因是CCR5的抑制剂。CCR5抑制剂的一个实例是SEQ ID NO：2(CCR5shRNA)。在一个实施方案中，多核苷酸是病毒载体。具有CCR5shRNA的多核苷酸的代表性实施方案是图1中所示的载体，其中H1是人H1 RNA启动子；UbC是人泛素启动子；7SK是人
7SK RNA启动子；GFP是绿色荧光蛋白；C46是HIV融合抑制剂。在一些实施方案中，GFP和/或C46被替代的目的基因，例如治疗基因来替换。还提供了包含上述多核苷酸的药物组合物。

[0012] 本发明另外提供了一种敲除细胞中次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)的方法。在一个实施方案中，该方法包括在允许在细胞中表达SEQ ID NO：1的条件下使细胞与如本文所述的多核苷酸接触。

[0013] 本发明进一步提供了一种在细胞中赋予鸟嘌呤类似物抗代谢物抗性的方法。在一个实施方案中，该方法包括在允许在细胞中表达SEQ ID NO：1的条件下使细胞与本发明的多核苷酸接触。在一个实施方案中，鸟嘌呤类似物抗代谢物是6‑硫鸟嘌呤(6TG)。

[0014] 本发明提供的另一种方法是产生可选择的遗传修饰细胞的方法。在一个实施方案中，该方法包括在允许表达目的基因和SEQ ID NO：1的条件下使多个细胞与本发明的多核苷酸接触。在一个实施方案中，该方法还包括从多个细胞中去除未修饰的细胞。去除包括用鸟嘌呤类似物抗代谢物处理与多核苷酸接触的多个细胞。在另一个实施方案中，该方法还包括从多个细胞中去除遗传修饰的细胞。去除包括用甲氨蝶呤(MTX)处理多个细胞。

[0015] 本发明进一步提供了一种用于从多个细胞中选择用目的基因来遗传修饰的细胞的方法。在一个实施方案中，该方法包括使包含遗传修饰细胞的多个细胞接触，其中在允许表达目的基因和SEQ ID NO：1的条件下用本发明的多核苷酸修饰遗传修饰的细胞。该方法还包括从多个细胞中去除未修饰的细胞。去除包括用鸟嘌呤类似物抗代谢物处理与多核苷酸接触的多个细胞。

[0016] 还提供了用于从多个细胞中去除用目的基因遗传修饰的细胞的方法。在一个实施方案中，该方法包括使包含遗传修饰细胞的多个细胞接触，其中在允许表达目的基因和SEQ ID NO：1的条件下用本发明的多核苷酸修饰遗传修饰的细胞。该方法还包括从多个细胞中去除遗传修饰的细胞。去除包括用甲氨蝶呤(MTX)处理多个细胞。

[0017] 本发明还提供了治疗感染HIV的受试者的方法。在一个实施方案中，该方法包括在允许表达目的基因和SEQ ID NO：1的条件下使已经用本发明的多核苷酸修饰的多种造血干/祖细胞(HSPC)接触。该方法还包括用鸟嘌呤类似物抗代谢物处理与多核苷酸接触的多个细胞，以形成纯化的遗传修饰细胞群；将纯化的遗传修饰细胞群给予受试者。

附图说明

[0018] 图1.包含CCR5shRNA和HPRT shRNA的代表性慢病毒载体的示意图。

[0019] 图2.涉及HPRT表达和敲除的代谢途径的示意图。

[0020] 图3.通过6TG来阳性选择的HPRT缺陷细胞的示意图。

[0021] 图4.HPRT shRNA的慢病毒载体递送导致6TG有效选择HPRT敲除。通过6TG选择HPRT敲除Molt4‑CCR5、PBMC和CD34+细胞。将shRNA载体和对照载体转导的细胞与或不与6TG一起培养。

[0022] 图5.CCR5在Molt4CCR5细胞中下调。

[0023] 图6.载体转导细胞中的HPRT敲除。在指定的时间点转导后，通过蛋白质印迹分析全细胞裂解物。

[0024] 图7.为了安全性，通过MTX消除HPRT敲除基因修饰细胞的示意图。

[0025] 图8.线性图显示MTX介导的抑制二氢叶酸还原酶(DHFR)诱导HPRT敲除细胞中的细胞死亡。

[0026] 图9.使用BLT人源化小鼠模型，HPRT/CCR5shRNA载体转导的CD34+造血干/祖细胞的植入得以改进。分别用双shRNA载体(HPRT shRNA和CCR5 shRNA)或对照载体转导人胎肝来源的CD34+细胞。将双shRNA和对照载体转导的细胞以1:1的比例混合并静脉内移植到在肾包膜中具有人胸腺的NSG小鼠中。

[0027] 图10.治疗组在手术后一周注射6TG，如时间表所示。这些图显示了小鼠PBMC中人CD45+细胞中标记物(EGFP或mCherry)的百分比，其在第0周(左图)和手术后8周(右图)通过FACS测量。

[0028] 图11.图显示离体选择来自BLT小鼠的载体修饰的脾细胞。

[0029] 图12.具有突变的7SK启动子的可化学选择的抗HIV基因慢病毒载体的示意图。在7SK RNA聚合酶III启动子的远端序列元件(DSE)中引入突变以降低HPRTsh734表达。载体还表达抗CCR5 shRNA sh1005和EGFP。如图中所示，突变启动子表现出野生型7SK启动子活性的17％。

[0030] 图13.在人源化BLT小鼠中用新开发的具有7SK突变1的载体来载体修饰的人造血细胞的体内阳性选择得以改善。用CD34+HSPC重建BLT小鼠，其中载体在7SK启动子中具有突变1。小鼠每周一次用6TG治疗总共8次或不治疗。在9周后时间点分析外周血来源的人CD45+、CD3+、CD4和CD8+淋巴细胞的EGFP表达。

具体实施方式

[0031] 本文所述的针对人类次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)的新型有效短发夹RNA(shRNA734)通过使用调节和体内选择策略来赋予对临床可用的鸟嘌呤类似物抗代谢物6TG的抗性，以实现基因修饰干细胞的有效阳性选择，从而提高基因修饰的干细胞植入的速率。6TG被HPRT代谢，活性毒性代谢物被并入DNA和RNA中并导致细胞毒性。shRNA734介导的HPRT敲除可以阻止活性毒性代谢物的形成，并且能够实现shRNA734基因修饰的HPRT敲除干细胞的选择。

[0032] 例如，慢病毒载体介导的抗HIV基因和shRNA734的共同递送可以导致人类干细胞中HPRT的稳定敲除，移植6TG预处理和化学选择的这些基因修饰的干细胞可以改善HIV保护干细胞的植入，实现对HIV感染的稳定控制。基因修饰的细胞能够阻断具有R5和X4趋向性的HIV‑1。此外，除了阳性选择，shRNA734介导的HPRT敲除策略的一个新特点是它可以用作消除HPRT缺陷细胞的阴性选择，通过使用甲氨蝶呤(MTX)来抑制嘌呤从头合成途径中的二氢叶酸酶还原酶(DHFR)。因此，它可以作为安全程序开发，以在观察到意外的不良反应的情况下消除基因修饰的HSPC。

[0033] 有效且无毒的HPRT shRNA能够在体外实现6TG介导的慢病毒载体转导的人T细胞系CD34+细胞和原代外周血单核细胞(PBMC)的阳性选择。利用慢病毒载体递送sh734并稳定地敲除人T细胞系、原代外周血单核细胞和CD34+造血干/祖细胞中的HPRT。有效的HPRT敲除导致对6TG的抗性。在6TG存在下阳性选择载体转导的细胞。

[0034] 为了测试shRNA734在基于抗HIV‑1干细胞的基因治疗中的应用，来自慢病毒载体的sh734和sh1005(针对CCR5HIV辅助受体的shRNA)共表达有效地下调CCR5和HPRT表达。双sh1005/HPRT shRNA载体修饰的人HSPC的初始体内植入实验显示在人源化BLT小鼠中重建CCR5下调的人T细胞。通过6TG阳性选择来自BLT小鼠的离体分离的脾细胞。

[0035] 此外，本发明提供了组合抗HIV慢病毒载体，其表达HIV融合抑制剂C46以及用于CCR5和HPRT的shRNA。在体外用6TG阳性选择载体转导的人细胞系(K562，CCR5MT‑4)。更重要的是，原代PBMC和胎肝来源的CD34+细胞也可以用6TG阳性选择。此外，通过蛋白质印迹测量，HPRT表达在6TG选择的细胞中被有效敲除。甲氨喋呤(MTX)已被用于阴性选择转导的细胞。最后，6TG选择的抗HIV(CCR5shRNA和C46)载体转导的CCR5MT‑4细胞显示出在体外对HIV感染具有抗性。

[0036] 这些结果表明，这种新鉴定的HPRT shRNA可以在慢病毒载体中与CCR5定向shRNA(sh1005)和C46组合，用于有效的阳性选择。

[0037] 除了阳性选择策略，在体外使用MTX阴性选择表达shRNA734的人T细胞系和CD34+细胞。

[0038] 优点

[0039] 这种基于RNA的技术优于现有的体内选择策略。先前使用各种抗药性基因的体内选择策略已经测试，但是与不可接受的毒性或选择效率不足相关联。值得注意的是，这些方法通常依赖于将过表达外源性抗药性基因的HSPC移植到用骨髓清除辐照来预处理的受体中。

[0040] 迄今为止这种方法的一个成功实例是使用P140K突变体形式的人O6‑甲基鸟嘌呤‑6 6
DNA‑甲基转移酶(MGMT P140K)，其赋予对O‑苄基鸟嘌呤(OBG)和DNA损伤剂如1,3‑二(2‑氯乙基)‑1‑亚硝基脲(BCNU)的抗性。从逆转录/慢病毒载体表达的MGMT P140K能够在小鼠、非人灵长类动物中选择转导的HSPC，并且正在临床试验中针对胶质母细胞瘤患者的骨髓保护进行测试。然而，据报道高水平MGMT P140K表达本身会引起细胞毒性，更一般地说，外源性抗药性转基因蛋白产物的潜在免疫原性是一个问题。

[0041] 最近，体内MGMT选择应用于猪尾猕猴中的C46单抗HIV表达载体修饰的HSPC移植研究。然而，包含相对较大的MGMT P140K降低了额外抗HIV基因的可用载体包装能力，产生了复杂的载体基因组并可能降低载体滴度。选择还需要强力烷化剂BCNU。

[0042] 相反，对于本文所述的策略，化学抗性由小的非免疫原性shRNA赋予，其敲除内源基因的表达。由于HIV疾病的基因治疗需要多种治疗基因的组合，因此使用小RNA减小载体的大小优于大蛋白质分子。此外，它将促进载体设计和制造。化学选择需要用嘌呤类似物抗代谢物治疗，已知其比烷化剂具有更少的患者生育问题。

[0043] 定义

[0044] 除非另有说明，否则本申请中使用的所有科学和技术术语具有本领域常用的含义。如在本申请中所使用的，以下单词或短语具有指定的含义。

[0045] 术语“核酸”或“多核苷酸”或“寡核苷酸”是指单链或双链形式的核苷酸序列，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，除非另有限制，否则包括以与天然存在的核苷酸相似的方式与核酸杂交的天然核苷酸的已知类似物。

[0046] 如本文所用，术语“活性片段”是指寡核苷酸的实质部分，其能够执行与靶多核苷酸特异性杂交的相同功能。

[0047] 如本文所用，术语“剔除”或“敲除”是指遗传技术，其中通过破坏和/或灭活基因的表达使靶基因失效。

[0048] 如本文所用，“杂交(hybridizes)”、“杂交(hybridizing)”和“杂交(hybridization)”是指寡核苷酸在标准条件下与靶DNA分子形成非共价相互作用。标准杂交条件是允许寡核苷酸探针或引物与靶DNA分子杂交的那些条件。使用本领域技术人员熟知的技术可以容易地确定寡核苷酸探针或引物和靶DNA分子的这些条件。靶多核苷酸的核苷酸序列通常是与寡核苷酸引物或探针互补的序列。杂交寡核苷酸可含有不干扰形成非共价相互作用的非杂交核苷酸。寡核苷酸引物或探针的非杂交核苷酸可位于杂交寡核苷酸的末端或杂交寡核苷酸内。因此，只要在标准杂交条件下存在杂交，寡核苷酸探针或引物就不必与靶序列的所有核苷酸互补。

[0049] 本文所用的术语“互补序列”和“互补”是指两个DNA分子彼此碱基配对的能力，其中一个DNA分子上的腺嘌呤将与第二个DNA分子上的胸腺嘧啶碱基配对，并且一个DNA分子上的胞嘧啶将与第二个DNA分子上的鸟嘌呤碱基配对。当一个DNA分子中的核苷酸序列可以与第二个DNA分子中的核苷酸序列碱基配对时，两个DNA分子彼此互补。例如，两个DNA分子5'‑ATGC和5'‑TACG是互补的，DNA分子5'‑ATGC的互补序列是5'‑TACG。术语互补序列和互补物还包括以下两个DNA分子，其中一个DNA分子含有至少一个不与第二个DNA分子上存在的至少一个核苷酸碱基配对的核苷酸。例如，两个DNA分子5'‑ATTGC和5'‑TATCG中的每一个的第三个核苷酸不会碱基配对，但是这两个DNA分子如本文所定义是互补的。通常，如果两个DNA分子在上述标准条件下杂交，则它们是互补的。通常，如果两个DNA分子具有至少约80％的序列同一性，优选至少约90％的序列同一性，则它们是互补的。

[0050] 如本文所用，“表达控制序列”意指指导核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以是启动子，例如组成型或诱导型启动子，或增强子。表达控制序列与待转录的核酸序列可操作地连接。

[0051] 如本文所用，“载体”意指构建体，其能够在宿主细胞中递送并优选表达一种或多种目的基因或序列。

[0052] 除非另有明确说明，否则本文所用的“一个”表示至少一个。

[0053] 如本文所用，“预防”或“防范”病症或疾病意指阻碍、减少或延迟病症或疾病的发作或进展。

[0054] 如本文所用，术语“分离的”是指天然存在的DNA片段、DNA分子、编码序列或寡核苷酸从其天然环境中去除，或者是合成分子或克隆产物。优选地，纯化DNA片段、DNA分子、编码序列或寡核苷酸，即基本上不含任何其他DNA片段、DNA分子、编码序列或寡核苷酸和相关的细胞产物或其他杂质。

[0055] 多核苷酸及其使用方法

[0056] 本发明提供短发夹核糖核酸分子(shRNA)和包含其的多核苷酸，其可用于敲除(例如沉默表达)次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)。在一个实施方案中，本发明提供了包含编码shRNA734的核酸序列的多核苷酸，其中shRNA734核酸序列是SEQ ID NO：1：

[0057]

[0058] 在一个实施方案中，多核苷酸还包含表达控制序列。在一个实施方案中，多核苷酸是载体，例如病毒载体。在一个实施方案中，表达控制序列包含shRNA上游的5'长末端重复序列(LTR)和shRNA734下游的3'LTR。在一个实施方案中，多核苷酸还包含位于5'LTR下游和shRNA734上游的目的基因。在一个实施方案中，目的基因是CCR5的抑制剂。CCR5抑制剂的一个实例是SEQ ID NO：2(CCR5shRNA)：

[0059]

[0060] 在一个实施方案中，载体包含图1中所示的示意图中表示的元件，其中：

[0061] H1是人H1RNA启动子(NCBI GenBank|S68670|H1RNA基因{启动子}人，基因组，497nt)；

[0062] UbC是人泛素启动子(用于多聚泛素的智人UbC基因，外显子1‑2，部分cds.登录号D63791)，其可用于驱动目的基因的表达；

[0063] 7SK是人7SK RNA启动子(智人细胞系HEK‑293 7SK RNA启动子区，完整序列登录号AY578685，SEQ ID NO：3；或者，SEQ ID NO：4或5的新变体7SK RNA启动子)；

[0064] GFP是绿色荧光蛋白(NCBI GenBank|L29345|维多利亚多管发光水母绿色荧光蛋白(GFP)mRNA，完整的cds.)；和

[0065] C46是HIV融合抑制剂(Egelhofer M,Brandenburg G,Martinius H等人Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 entry in cells expressing gp41‑derived peptides.J Virol 2004；78(2):568‑575。)

[0066] 表达CCR5和C46的载体提供两种抗HIV基因，其可以与HPRT敲除和6TG介导的选择一起提供。本领域技术人员将理解，替代的目的基因，例如治疗基因，可以代替载体中的GFP和/或C46。在一个实施方案中，目的基因长度高达12kb。在另一个实施方案中，目的基因包含至多3个或4个串联基因。在典型的实施方案中，裂解肽位于目的基因之间。

[0067] 治疗基因可以针对HIV或其他疾病或病症。例如，可设计治疗基因以纠正遗传性基因缺陷，改变正常骨髓对细胞毒性药物的药物敏感性，赋予对影响淋巴造血细胞的感染性微生物的抗性，替代或重新设定内源性免疫系统，或通过替代内源性骨髓和诱导移植物抗白血病/淋巴瘤作用来对抗淋巴造血系统恶性肿瘤。

[0068] 更具体地，遗传性基因缺陷可包括但不限于造血功能障碍，包括血红蛋白病，例如镰状细胞性贫血，地中海贫血，遗传性球形红细胞增多症，G6PD缺乏等，免疫或抗微生物功能障碍，例如严重联合免疫缺陷(SCID)，慢性肉芽肿病(CGD)，导致凝血缺陷的血栓形成障碍，如Wiscott‑Aldrich综合征(WAS)，以及可通过对行进至组织损伤部位的造血细胞进行遗传工程改造来改善的其他遗传结构或代谢紊乱，如各种形式的大疱性表皮松解症(EB)和粘多糖贮积症。

[0069] 骨髓对于化学毒性药物的药物敏感性的改变将是有利的疾病包括但不限于通过化学治疗剂治疗的恶性疾病，其最大耐受剂量受到骨髓毒性的限制。这些恶性疾病包括肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、头颈癌、肾细胞癌、膀胱癌、宫颈癌、卵巢癌、皮肤癌、肉瘤和神经胶质瘤。

[0070] 使用骨髓或造血干细胞移植来代替或重置内源性免疫系统的疾病包括但不限于炎性肠病，硬皮病和红斑狼疮。

[0071] 赋予对感染性微生物的抗性将是有利的疾病包括但不限于HIV感染和AIDS，HTLV感染和细小病毒B19感染。

[0072] 通过骨髓或造血干细胞移植治疗的淋巴造血细胞的恶性或恶变前疾病包括但不限于急性髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、淋巴瘤和骨髓增生异常综合征。

[0073] 该技术的治疗应用的另一个实例是在由辐射损伤和化学毒素引起的内源性淋巴造血细胞的获得性损伤后改善骨髓或造血干细胞移植的结果。

[0074] 该技术的非治疗性但商业上有用的应用是其用于产生人源化动物模型，其中它们的内源性淋巴造血细胞几乎完全被来自人类供体的细胞取代。一旦产生，这些动物可用于例如测试被考虑用于人类疾病的新药的骨髓毒性。这是有利的，因为造血作用对各种药物的敏感性可以根据动物的种类而不同，因此最理想的是在人源化动物模型中测试这些药物。

[0075] 在一个实施方案中，7SK是SEQ ID NO：3(智人细胞系HEK‑293 7SK RNA启动子区，完整序列登录号AY578685)：

[0076]

[0077] 在另一个实施方案中，7SK是SEQ ID NO：3的突变体(SEQ ID NO：4)，其在人源化BLT小鼠中改善体内GFP表达载体修饰细胞的植入：

[0078]

[0079] 在另一个实施方案中，7SK是SEQ ID NO：3的突变体，其改善人源化BLT小鼠体内GFP表达载体修饰细胞的植入，通过使用SEQ ID NO：4中所示的一些或所有突变来提供SEQ ID NO：5：

[0080]

[0081] 本发明另外提供药物组合物，其包含如本文所述的多核苷酸或其活性片段。在一些实施方案中，多核苷酸或其活性片段与异源序列连接。可以选择异源序列以促进多核苷酸的使用，例如，通过添加标签以促进检测或添加促进递送或溶解的配偶体。该组合物任选地包含一种或多种附加组分，其有助于保留多核苷酸的生物活性并且不与免疫系统反应。此类药学上可接受的载体是本领域已知的。

[0082] 方法

[0083] 本发明进一步提供了在细胞中敲除次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)的方法，该方法包括在允许在细胞中表达SEQ ID NO：1的条件下使细胞与本发明的多核苷酸接触。还提供了在细胞中赋予鸟嘌呤类似物抗代谢物抗性的方法，该方法包括在允许SEQ ID NO：1在细胞中表达的条件下使细胞与根据本发明的多核苷酸接触。在一个实施方案中，鸟嘌呤类似物抗代谢物是6‑硫鸟嘌呤(6TG)、6‑巯基嘌呤(6‑MP)或硫唑嘌呤(AZA)。细胞的代表性实例包括但不限于；造血干细胞、T细胞、外周血单核细胞(PBMC)和CD34+细胞。本领域技术人员将理解适用于本文所述方法的其他细胞。

[0084] 本发明还提供了用于产生可选择的遗传修饰细胞的方法，其中所述细胞已被修饰以表达目的基因。该方法包括在允许表达目的基因和SEQ ID NO：1的条件下使多个细胞与本发明的多核苷酸接触。在一个实施方案中，该方法还包括从多个细胞中去除未修饰的细胞。去除包括用鸟嘌呤类似物抗代谢物处理与多核苷酸接触的多个细胞。在另一个实施方案中，该方法还包括从多个细胞中去除遗传修饰的细胞。在该实施方案中，去除包括用甲氨蝶呤(MTX)处理多个细胞。

[0085] 另外，本发明提供了一种用于选择用目的基因遗传修饰的细胞的方法。该方法包括：(a)使包含遗传修饰细胞的多个细胞接触，其中在允许表达目的基因和SEQ ID NO：1的条件下用本发明的多核苷酸修饰遗传修饰的细胞；(b)从多个细胞中去除未修饰的细胞。去除包括用鸟嘌呤类似物抗代谢物处理与多核苷酸接触的多个细胞。

[0086] 还提供了用于去除用目的基因遗传修饰的细胞的方法。该方法包括：(a)使包含遗传修饰细胞的多个细胞接触，其中在允许表达目的基因和SEQ ID NO：1的条件下用本发明的多核苷酸修饰遗传修饰的细胞；(b)从多个细胞中去除遗传修饰的细胞。去除包括用甲氨蝶呤(MTX)处理多个细胞。MTX介导的去除策略提供了安全程序，以在不希望的副作用或其他不良事件的情况下消除遗传修饰的细胞。MTX介导的消除策略还可用于减轻癌症免疫基因治疗的副作用，其中具有肿瘤特异性T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)的遗传修饰的T细胞在细胞输注患者中引起不希望的副作用，例如例如，细胞因子风暴综合征，或移植物抗宿主反应。MTX治疗可以消除患者中基因修饰的细胞。

[0087] 在另一个实施方案中，本发明提供了治疗感染HIV的受试者的方法。在一个实施方案中，该方法包括：(a)在允许表达目的基因和SEQ ID NO：1的条件下使已经用本发明的多核苷酸修饰的多个造血干/祖细胞(HSPC)接触；(b)用鸟嘌呤类似物抗代谢物处理与多核苷酸接触的多个细胞，以形成纯化的遗传修饰细胞群；(c)将纯化的遗传修饰细胞群给予受试者。用嘌呤类似物的选择可以滴定至所需的造血毒性水平。如有必要，可以向受试者重新给药。

[0088] 通常，受试者是哺乳动物。哺乳动物受试者可以是鼠、犬、猫、牛、马、绵羊、灵长类动物或人。在一个实施方案中，受试者是人。

[0089] 给药和剂量

[0090] 组合物以任何合适的方式给药，通常与药学上可接受的载体一起给药。可以获得在本发明的情形中向受试者施用治疗的合适方法，并且尽管可以使用多于一种途径来施用特定组合物，但是特定途径通常可以提供比另一种途径更直接和更有效的反应。

[0091] 在本发明的情形中，给予患者的剂量应足以在患者中随时间产生有益的治疗反应，或抑制疾病进展。因此，将组合物以足以引起有效反应和/或减轻、减少、治愈或至少部分地阻止疾病的症状和/或并发症的量施用于受试者。足以实现此目的的量被定义为“治疗有效剂量”。

[0092] 本文公开的治疗组合物的给药途径和给药频率以及剂量将因个体和所选药物而异，并且可以使用标准技术容易地确定。通常，药物组合物可以通过注射(例如，皮内、瘤内、肌肉内、静脉内或皮下)，鼻内(例如通过抽吸)或口服给药。替代方案可能适合个别患者。

[0093] 如本领域技术人员所理解的，剂量可以从mg/kg体重转换为mg/体表面积，后者适合用于较大的哺乳动物受试者，包括人。用于异速生长缩放的计算器在本领域中是已知的并且易于在线获得。通常，异速生长缩放使用0.75‑0.80的指数。有关更多信息，请参阅West&Brown,J Exp Bio 208,1575‑1592,2005。此外，美国食品和药物管理局出版“Guidance for Industry:Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers”，其可从以下获得：Office of Training and Communications Division of Drug Information,HFD‑240 Center for Drug Evaluation and Research Food and Drug Administration 5600 Fishers Lane Rockville,MD 20857。

[0094] 例如，对于20g小鼠，5mg/kg 6TG对应于15.08mg/m2的剂量。对于65kg人来说，这相当于0.4mg/kg。口服6TG给药后的吸收估计为30％，因此小鼠中的该i.p.剂量对应于在人中口服施用后约1.3mg/kg的吸收剂量。儿科患者和成人常规口服6TG单药化疗剂量为每天2mg/kg体重；如果在4周后没有观察到治疗反应，则剂量可以增加至3mg/kg。

[0095] 实施例

[0096] 提供以下实施例以说明本发明并帮助普通技术人员制备和使用本发明。这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。

[0097] 实施例1：遗传修饰的HIV保护的造血干/祖细胞的体内选择策略

[0098] 虽然基于HSPC的抗HIV基因治疗对HIV治愈具有很大的希望，但之前的临床研究仅取得了有限的成功，主要是由于抗HIV基因修饰的HSPC的造血重建效率低。该实施例描述了克服该限制的新型化学选择方法。

[0099] 为了改善抗HIV基因修饰的HSPC的植入，我们研究了一种体内选择策略，专门使用6‑硫鸟嘌呤(6TG)预处理和化学选择次黄嘌呤‑鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)下调抗HIV基因工程HSPC，这种策略能够充实基因工程抗HIV修饰的HSPC和子代的植入和长期重建。为了对基因修饰细胞提供6TG抗性，我们已经鉴定了HPRT短发夹RNA(shRNA)，其能够在体外实现慢病毒载体转导的HPRT敲除人T细胞系、CD34+细胞和原代外周血单核细胞(PBMC)的6TG介导阳性选择。我们的CCR5shRNA和HPRT shRNA共表达载体修饰的人HSPC的体内植入实验显示在人源化BLT小鼠中重建CCR5下调的人T细胞。通过6TG阳性选择来自BLT小鼠的离体分离的载体修饰的脾细胞。这些结果表明我们新开发的HPRT shRNA可以在慢病毒载体中与CCR5定向shRNA组合用于阳性选择。

[0100] 除了阳性选择外，目前HPRT敲除策略的一个新特点是它可以作为消除HPRT敲除基因修饰细胞的阴性选择，通过临床可用的甲氨蝶呤(MTX)抑制嘌呤从头合成途径中的二氢叶酸还原酶(DHFR)。MTX在体外针对表达HPRT shRNA的人T细胞系和CD34+细胞阴性选择。因此，可以将其开发为在观察到意外不良反应的情况下消除基因修饰的HSPC的安全程序。

[0101] 本文所述的新型体内化学选择策略提高了抗HIV基因修饰的细胞植入的效率，并提供了HIV的治疗。6‑硫鸟嘌呤(6TG)化学毒素抗性是通过慢病毒载体介导的靶向次黄嘌呤‑鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)的短发夹RNA(shRNA)的递送来实现的，所述HPRT是嘌呤类似物(如6TG)发挥它的细胞毒性作用所需的酶。shRNA很小(20‑22nt)并且可以从慢病毒载体共表达而不显着影响载体滴度。因此，与其他抗HIV基因组合以产生多管齐下的抗HIV载体是可行的。

[0102] 通过6TG对HPRT敲除细胞的阳性选择在图4‑6中示出，其显示HPRT shRNA的慢病毒载体递送导致6TG对HPRT敲除的有效选择。如图4所示，通过6TG选择HPRT敲除Molt4‑CCR5、PBMC和CD34+细胞。将shRNA载体和对照载体转导的细胞与或不与6TG一起培养。图5显示CCR5在Molt4CCR5细胞中下调。在指定的时间点转导后，通过蛋白质印迹分析全细胞裂解物。载体转导细胞中的HPRT敲除在图6中显示。

[0103] 通过MTX对HPRT敲除细胞的阴性选择在图7中示出，其给出了MTX介导的二氢叶酸还原酶(DHFR)抑制在HPRT敲除细胞中诱导细胞死亡的示意图。代谢方案显示由5'‑磷酸核糖‑1‑焦磷酸(PRPP)酰胺转移酶介导的从头嘌呤合成的第一步和限速步骤，以及由次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APRT)介导的补救途径。从头合成通过多步骤过程发生，并且需要四种氨基酸、一种PRPP、两种叶酸和三种ATP的贡献来合成肌苷一磷酸(IMP)分子。利用PRPP作为共底物，HPRT分别催化从嘌呤碱基次黄嘌呤和鸟嘌呤的肌苷一磷酸(IMP)和鸟苷一磷酸(GMP)的补救合成。HPRT缺陷导致其底物，次黄嘌呤和鸟嘌呤的积累，其通过黄嘌呤氧化酶转化为尿酸。升高的APRT活性也可能导致嘌呤过量产生。

[0104] MTX介导的HPRT/CCR5敲除基因修饰细胞的阴性选择结果如图8所示。用双shRNA载体转导Molt4CCR5(A)、PBMC(B)和CD34+(C)细胞。转导的细胞与或不与10μM MTX一起培养。监测细胞的％EGFP并每3天给予含有MTX的新鲜培养基。

[0105] HPRT敲除CD34+造血干/祖细胞的体内选择在图9和10中显示。图9显示了BLT hu小鼠模型中HPRT/CCR5shRNA载体转导的CD34+造血干/祖细胞的植入。分别用双shRNA载体(HPRT shRNA和CCR5shRNA)或对照载体转导人胎肝来源的CD34+细胞。将双shRNA和对照载体转导的细胞以1:1的比例混合并静脉内移植到在肾包膜中具有人胸腺的NSG小鼠中。

[0106] 如图10所示，根据时间表，治疗组在手术后一周注射6TG。这些图显示了小鼠PBMC中人CD45+细胞中标记物(EGFP或mCherry)的百分比，其在第0周(左图)和手术后8周(右图)通过FACS测量。

[0107] HPRT shRNA和CCR5shRNA的慢病毒载体递送导致有效的HPRT和CCR5共敲除，并赋予通过6TG阳性选择EGFP+载体转导细胞的能力。通过MTX阴性选择载体转导的HPRT敲除细胞。在人源化BLT小鼠体内，HPRT/CCR5shRNA载体转导的人胎肝CD34+HSPC的植入在6TG处理组中比未处理组增加5倍。

[0108] 来自BLT小鼠的载体修饰的脾细胞的离体选择如图11所示。CD34+的转导效率为15.6％。在有和没有0.3μM 6TG的情况下培养分离的小鼠脾细胞。

[0109] 实施例2：用于HPRT shRNA的改进的启动子

[0110] 该实施例描述了突变的7SK RNA启动子，其在人源化BLT小鼠体内改善GFP表达载体修饰细胞的稳定性。该新型启动子具有SEQ ID NO：4所示的序列。

[0111] 由于在人源化BLT小鼠中载体转导的CD34+HSPC移植后8至14周，观察到体内6TG选择的载体标记的EGFP+人CD45+淋巴样细胞在外周血中轻微下降，我们开发了更稳定的6TG可选抗HIV‑1慢病毒载体。我们假设同时两个短发夹RNA(CCR5sh1005和HPRTsh734)表达可能对人源化BLT小鼠中移植的载体转导的CD34+HSPC和子代细胞的细胞生长产生负面影响。该假设基于我们之前的经验，即来自强RNA聚合酶启动子III(例如U6)的shRNA过表达可导致人T淋巴细胞的细胞毒性并且使用较弱的启动子(H1)降低shRNA表达可最小化细胞毒性作用(An.DS.等人Molecular Therapy 2006)。其他可能性可能是有效的HPRT下调本身可能对细胞生长产生负面影响。

[0112] 为了提高载体修饰细胞的稳定性，我们假设降低HPRT shRNA表达水平可能会减轻这些负面影响。为了验证我们的假设，我们开发了三种慢病毒载体，其从在远端序列元件(DSE)中具有突变的减弱7SK启动子来表达HPRTshRNA 734(突变体1、突变体2和突变体3)(图12)。基于以前的研究，突变体1、突变体2和突变体3预计在HeLa细胞中转染时，分别使HPRTsh734的表达降低17％、49％和67％(Boyd DC等人J Mol Biol.1995Nov 10；253(5):677‑90)。目前通过定量siRNA PCR测定法测量HPRT shRNA734的水平。基于我们的结果和文献(Boyd DC，等人)，具有突变体1的载体预期以最低水平表达HPRTshRNA 734。目前尚不清楚突变1是否可以降低人类HSPC和T淋巴细胞中sh734的表达。因此，我们进一步在体外和
6TG介导的选择中测试了载体。在体外用6TG有效选择载体转导的人CCRT MT4细胞系。

[0113] 我们观察到在人源化BLT小鼠中用新开发的具有7SK突变1的载体改善了载体修饰的人造血细胞的体内阳性选择。用CD34+HSPC重建BLT小鼠，其中载体在7SK启动子中具有突变1。小鼠每周一次用6TG治疗总共8次或不治疗。在9周后时间点分析外周血来源的人CD45+、CD3+、CD4和CD8+淋巴细胞的EGFP表达。

[0114] 该实验的结果显示，与先前的载体相比，使用新开发的载体，在外周血中显着更高(p值<0.05)载体标记的EGFP+人CD45+、CD3+和CD4+淋巴细胞(图13)。

[0115] 在整个申请中，引用了各种出版物。这些出版物的全部公开内容通过引用并入本申请中，以便更全面地描述本发明所属领域的目前发展水平。

[0116] 本领域技术人员将理解，前述说明书中公开的概念和具体实施方案可以容易地用作修改或设计用于实现本发明相同目的的其他实施方案的基础。本领域技术人员还将理解，这些等同的实施方案不脱离所附权利要求中阐述的本发明的精神和范围。