一种酞菁-壳寡糖偶联物及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种酞菁‑壳寡糖偶联物及其制备方法与应用，属于药物制备领域。该酞菁‑壳寡糖偶联物为单取代羧基类锌酞菁与壳寡糖的偶联物或其偶联物的季铵化衍生物，其可应用于光动力抗菌、光动力抗癌、光动力诊断及光动力消毒。本发明酞菁‑壳寡糖偶联物由于具有酞菁和壳寡糖或壳寡糖季铵盐的双功能基，在光动力抗菌时能够达到协同治疗的作用；同时壳寡糖具有优良的水溶性和生物相容性，能够有效改善酞菁的两亲性和生物相容性，并降低酞菁的毒性，提高酞菁的临床应用价值。

权利要求

1.一种用作光动力药物的酞菁-壳寡糖偶联物，其特征在于：其结构式为下列式（I）~（IV）中的任意一种：

，

，

，

；

所述光动力药物包括光动力抗癌药物、光动力抗菌药物、光动力诊断剂和光动力消毒剂。

2.一种制备如权利要求1所述的酞菁-壳寡糖偶联物的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）以酞菁化合物 或

和壳寡糖为反应原料，二甲亚砜为溶剂，1-羟基苯并三唑、二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶的混合物为缩合试剂，在冰水浴和氮气保护下升温至室温 35℃，反应16 24h，然后采用柱层析和排阻色谱法分离纯化，得到式（I）或~ ~（III）的偶联物；

2）以式（I）或（III）的偶联物为原料，异丙醇为溶剂，在氮气保护下升温至65 80℃，滴~加2,3-环氧丙基三甲基氯化铵的异丙醇溶液，反应6～10 h，然后采用排阻色谱法分离纯化，得到季铵化的式（Ⅱ）或（IV）的偶联物；

所用壳寡糖的分子量为0.3 10kDa；

~

步骤1）中酞菁化合物与壳寡糖重复单元的摩尔比为1:10 30。

~

3.根据权利要求2所述的酞菁-壳寡糖偶联物的制备方法，其特征在于：步骤1）中所用

1-羟基苯并三唑、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶与壳寡糖重复单元的摩尔比均为0.5

1.5mmol；

~

步骤2）中2,3-环氧丙基三甲基氯化铵与偶联物中游离氨基的摩尔比为1 2:1。

~

说明书

一种酞菁-壳寡糖偶联物及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明属于药物制备领域，具体涉及一种酞菁-壳寡糖偶联物及其制备方法与应用。

背景技术

[0002] 光动力治疗（或称光动力疗法），本质上是光敏剂（或称光敏类药物）的光敏化反应在医学领域的应用。其一般作用过程是，光敏剂先被注入到机体，一段时间后（药物在靶体中相对富集），用特定波长的光照射靶体位置（体腔内目标可借助光纤等导入光源），使富集在靶体中的光敏剂在光照射下被激发，产生了一系列光物理化学反应，并产生能够破坏靶体（例如染菌部位和癌细胞、组织等）的物质，如：活性氧，单线态氧等。光动力治疗的关键在于光敏剂，然而自1995年美国FDA批准的第一个光敏剂Photofrin应用于临床癌症治疗至
今，获准在临床上正式使用的光敏剂却很少，主要是由于光敏剂在临床应用中暴露出很多
缺陷，如：暗毒性高、水溶性差、组织穿透力差、靶向性不足以及稳定性不足等。因此，开发新型的具有良好临床效应的光敏剂成为亟待解决的问题。

[0003] 酞菁（phthalocyanine），是四苯并四氮杂卟啉的简称，被归属为第二代光敏剂，由于其稳定性高、光物理化学性质优良、具有一定的渗透能力而一直受到高度重视。但是，目前所报道的具有生物活性的酞菁配合物仍存在不足之处，例如：缺乏两亲性、暗毒性高、生物选择性不佳、合成路线复杂等等，而限制其临床应用。人们借助各种载药工具，如多聚物、核酸和蛋白质等，试图解决酞菁在临床应用上的缺陷。

[0004] 壳聚糖是由自然界来源广泛的甲壳素降解得到的一种线性亲水性多糖，包含D-葡聚糖胺和N-乙酰基-D-葡聚糖胺两种单元。壳寡糖无毒、无免疫原性，且具有良好的生物相容性。同时，壳聚糖分子骨架上含有较多的活性基团（碳2位上的氨基和碳6位上的羟基），为进一步的修饰提供了平台，因而被广泛关注，尤其是用于作为药物载体材料。此外，壳聚糖由于自身显示正电荷性，因此能够有效地和微生物表面的负电荷残基相互作用，而显示出
一定的抗菌活性。壳寡糖是壳聚糖降解得到的低聚物，其除了具备壳聚糖优良的活性外，还彰显出许多壳聚糖没有的优良性质，例如良好的水溶性以及抗菌活性等，但目前针对性质
更加优良的壳寡糖作为载药系统的研究却很少。

发明内容

[0005] 本发明针对现有酞菁临床应用暴露出的缺点，借助具有优良特性（如水溶性好、可生物降解、无免疫原性、无毒、可修饰性和抗菌性）的壳寡糖作为药物载体，提供了一种酞菁-壳寡糖偶联物的制备方法和应用。所得酞菁-壳寡糖偶联物显示了良好的抗菌性和极高的光动力活性，作为光敏剂应用具有显著优势。

[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0007] 一种酞菁-壳寡糖偶联物，其结构式为下列式（I）（IV）中的任意一种：~

[0008] ，

[0009] ，

[0010] ，

[0011] 。

[0012] 所述酞菁-壳寡糖偶联物的制备方法包括以下步骤：

[0013] 1）以酞菁化合物 （1）或（2）和壳寡糖为反应原料，二甲亚砜为溶剂，1-羟
基苯并三唑、二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶的混合物为缩合试剂，在冰水浴和氮气
保护下升温至室温 35℃，反应16 24h，然后采用柱层析和排阻色谱法分离纯化，得到式（I）~ ~
或（III）的偶联物；

[0014] 2）将式（I）或（III）的偶联物溶于少量二甲亚砜，加入异丙醇作为反应溶剂，在氮气保护下升温至65 80℃，将2,3-环氧丙基三甲基氯化铵的异丙醇溶液在1h内滴加完，反应~6～10 h，然后采用排阻色谱法分离纯化，得到季铵化的式（Ⅱ）或（IV）偶联物。

[0015] 所用壳寡糖的分子量为0.3 10kDa。~

[0016] 步骤1）中酞菁化合物与壳寡糖重复单元数的摩尔比为1:10 30；所用1-羟基苯并~
三唑、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶与壳寡糖重复单元数的摩尔比均为0.5
~
1.5mmol；步骤2）中2,3-环氧丙基三甲基氯化铵与偶联物中游离氨基的摩尔比为1 2:1。
~

[0017] 所述酞菁-壳寡糖偶联物可用于制备光动力药物，其包括光动力抗癌药物、光动力抗菌药物、光动力诊断剂和光动力消毒剂等。所述光动力治疗可以是恶性肿瘤的光动力治
疗，或是良性肿瘤的光动力治疗，或是非癌症疾病的光动力治疗。所述的非癌症疾病，可以是细菌感染，或是口腔疾病，或是黄斑变性眼病，或是动脉硬化，或是创伤感染，或是皮肤病，或是病毒感染。所述光动力消毒可以是血液或血液衍生物的光动力灭菌净化，或是水的光动力灭菌消毒，或是医用或生活用器的光动力消毒。

[0018] 其应用方法为：用水或水和其它物质的混合溶液作为溶剂，溶解酞菁-壳寡糖偶联物，配制成相应药剂（药剂中酞菁-壳寡糖偶联物的浓度不高于其饱和浓度）；制成的药剂中还可加入抗氧化剂、缓冲剂和等渗剂，以保持光敏药剂的化学稳定性和生物相容性；

[0019] 所述混合溶液中其它物质的质量分数不高于10％，所述其它物质为蓖麻油衍生物、二甲亚砜、乙醇、甘油、N,N-二甲基甲酰胺、聚乙二醇300 3000、环糊精、葡萄糖、吐温、聚~
乙二醇单硬脂酸酯中的一种或几种。

[0020] 本发明的有益效果和突出优势在于：

[0021] （1）本发明提供的酞菁-壳寡糖偶联物的制备过程简便、易操作、重现性高。

[0022] （2）本发明所用原料壳寡糖来源丰富、价格低廉。

[0023] （3）本发明所制备的酞菁-壳寡糖偶联物能降低酞菁的暗毒性，能明显改善单纯羧基酞菁在水相中的聚集行为，特别是季铵化衍生物的水溶性更加优良。

[0024] （4）本发明所制备的酞菁-壳寡糖偶联物不仅保留了单纯羧基酞菁锌的光活性，也保存了壳寡糖或其季铵盐的优良天然活性，如与菌细胞壁膜上带负电的残基相结合从而改变壁膜的渗透性而发挥抗菌效果。

[0025] （5）本发明所制备的酞菁-壳寡糖偶联物的抗菌效果显著，对白色念珠菌Candida albicans的IC90可低至5 μM，远低于单纯羧基酞菁锌的对应值（IC90>50 μM）。

[0026] （6）本发明所制备的季铵化酞菁-壳寡糖偶联物能够有效定位于真菌细胞的线粒体，即具有一定靶向性，而单纯的酞菁没有显著定位效应。

具体实施方式

[0027] 一种酞菁-壳寡糖偶联物，其制备方法包括以下步骤：

[0028] 1）以酞菁化合物 （1）或（2）和壳寡糖为反应原料（酞菁化合物与壳寡糖
重复单元数的摩尔比为1:10 30），二甲亚砜为溶剂，1-羟基苯并三唑、二环己基碳二亚胺和~
4-二甲氨基吡啶的混合物为缩合试剂（1-羟基苯并三唑、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶与壳寡糖重复单元数的摩尔比均为0.5 1.5mmol），在冰水浴和氮气保护下升温至室温
~ ~
35℃，反应16 24h，然后采用柱层析和排阻色谱法分离纯化，得到
~
或
；

[0029] 2）将式（I）或（III）的偶联物溶于少量二甲亚砜，加入异丙醇作为反应溶剂，在氮气保护下升温至65 80℃，将2,3-环氧丙基三甲基氯化铵的异丙醇溶液在1h内滴加完（2,3-~环氧丙基三甲基氯化铵与偶联物中游离氨基的摩尔比为1 2:1），反应6～10 h，然后采用排~
阻色谱法分离纯化，得到
或 。

[0030] 所述酞菁-壳寡糖偶联物可用于制备光动力药物，其包括光动力抗癌药物、光动力抗菌药物、光动力诊断剂和光动力消毒剂等。所述光动力治疗可以是恶性肿瘤的光动力治
疗，或是良性肿瘤的光动力治疗，或是非癌症疾病的光动力治疗。所述的非癌症疾病，可以是细菌感染，或是口腔疾病，或是黄斑变性眼病，或是动脉硬化，或是创伤感染，或是皮肤病，或是病毒感染。所述光动力消毒可以是血液或血液衍生物的光动力灭菌净化，或是水的光动力灭菌消毒，或是医用或生活用器的光动力消毒。

[0031] 本发明酞菁-壳寡糖偶联物在光动力治疗、光动力抗菌、光动力诊断和光动力消毒中的应用，需配套适宜的光源，所述适宜的光源可以由普通光源连接合适的滤光片来提供
或由特定波长的激光来提供，光源的波长范围为600～800nm，优选600-690nm。

[0032] 其具体应用方法为：用水或水和其它物质的混合溶液作为溶剂，溶解酞菁-壳寡糖偶联物，配制成相应药剂（药剂中酞菁-壳寡糖偶联物的浓度不高于其饱和浓度）；所述混合溶液中其它物质的质量分数不高于10％，所述其它物质为蓖麻油衍生物、二甲亚砜、乙醇、甘油、N,N-二甲基甲酰胺、聚乙二醇300 3000、环糊精、葡萄糖、吐温、聚乙二醇单硬脂酸酯~
中的一种或几种。制成的药剂中还可加入抗氧化剂、缓冲剂和等渗剂，以保持光敏药剂的化学稳定性和生物相容性。

[0033] 对于局部给药用的制剂，可以将本发明酞菁-壳寡糖偶联物溶解在渗透性溶剂中，或注入到软膏、洗液或凝胶中。所述渗透性溶剂优选0.5-35wt%的二甲亚砜水溶液。

[0034] 以下采用非限制性实施例对本发明作进一步说明。

[0035] 实施例1

[0036] 将14.5 mg 1-[4-(2-羧基乙基)苯氧基]酞菁（1，0.02 mmol）以及54 mg 1-羟基苯并三唑（0.4 mmol）和41.2mg二环己基碳二亚胺（DCC，0.4 mmol）置于25 mL两口烧瓶中，加入2 mL二甲亚砜，冰浴条件下通N2避光搅拌，10 min后加入49mg 4-二甲氨基吡啶（0.4 mmol），并将溶于1 mL DMSO的60 mg壳寡糖（MW=2kDa，0.4 mmol重复单元数）缓慢滴加到反应液中，冰浴条件下反应10 min，然后转移到室温条件下避光反应16 h。过100 200目硅胶~
柱，先用DMF：EA=1:5作为洗脱剂洗除杂质，再换用DMF：CH3COOH=50：1的洗脱剂进行洗脱，收集相应的流出液并旋干，用少量水溶解，过葡聚糖G-100凝胶，收集第一个蓝色带，浓缩，冻干，得38 mg蓝色网状物，即为酞菁（1）与平均分子量为2 kDa的壳寡糖的偶联物（Ι）。根据紫外-可见吸收光谱法测得该偶联物中酞菁的含量为2.47wt%。

[0037] 产物的表征数据：1H NMR（400 MHz，DMSO）：δ 9.40（m，Pc-Hα），8.97（s，Pc-Hα），8.36-7.92（m，Pc-Hβ），7.80（s，Pc-Hβ），7.43（m，Ar-H），7.10（bra，-NH-），6.58（s，H1），5.48-
4.13（m，H3-H6，H6`），3.65(s，-NH2），2.70（t，-CH2-），1.91（s，-COCH3）。FT-IR（KBr，cm-1）：
3644-3136（-OH and -NH2 or -NH-）；3068（-CH-，Pc）；2928，2852（-CH- and -CH2-）；1686（amide I，C=O）；1559（amide II， NH）；1446（C=C），808(Ar-H，para-position）；751（Zn-N）；
996（C-N，heterocyclic nitrogen）；1213，1073（C-O-C）。

[0038] 实施例2

[0039] 将30 mg实施例1所得酞菁-壳寡糖偶联物（Ι）(0.194 mmol的游离氨基）溶于少量二甲基亚砜中，并滴加到5 mL异丙醇中，在氮气保护下升温至65℃，然后分三次加入事先溶解于1mL异丙醇溶液中的59 mg（0.374 mmol）2,3-环氧丙基三甲基氯化铵，每次滴加间隔半个小时，反应8 h，停止反应，浓缩，过G-100葡聚糖凝胶，收集第一蓝色带，浓缩冻干，得39.8 mg蓝色网状结构固体，即为酞菁（1）与平均分子量为2 kDa的壳寡糖的偶联物（Ι）的季铵化衍生物（Ⅱ）。根据核磁共振氢谱测得该偶联物中季铵根的取代度为0.943（即1个壳聚糖重复单元上接有0.943个季铵根）。

[0040] 产物的表征数据：1H NMR（400 MHz，DMSO）： δ 8.48-7.52（m，Pc-H），7.09（br，-NH-），6.49-6.22（m，H1，Hb），5.61-3.68（m，H3-H6，H6`），3.28-3.18（m，Hc），3.15（s，N+（CH3）3），-11.90（s，-COCH3）。FT-IR（KBr，cm ）：3653-3100（-OH and -NH2 or -NH-）；3017（-CH-，Pc）；
2921，2852（-CH- and -CH2-）；1657（amide I，C=O）；1574（amide II，NH）；1478（-N（CH3）3+）；
1415(C=C），812（Ar-H）；1149，1102，1054（C-O-C）；967（C-N，heterocyclic nitrogen），764（Zn-N）。

[0041] 实施例3

[0042] 将实施例1中所用酞菁（1）替换为酞菁（2），其余步骤同实施例1，制得酞菁（2）-壳寡糖的偶联物（III），且偶联物中酞菁的含量为2.04wt%。

[0043] 产物的表征数据：1H NMR（400 MHz，DMSO） δ 9.51-9.30（m，Pc-Hα），8.96（d，J=7.6 Hz，Pc-Hα），8.22（m，Pc-Hβ），7.97（d，J=8.3 Hz，Pc-Hβ），7.53-7.33（dd，J=7.6，7.2 Hz，Ar-H），5.98（s，H1），5.52-3.57（m，H3-H6，H6ˊ），2.84（dt，J=27.5，9.5 Hz，CH2-Pc/H2），2.36（d，J=14.0 Hz，CH2-Pc），1.84（s，-COCH3），1.54-1.19（m，CH2-Pc）。FT-IR（KBr，cm-1）：3608-3049（-OH and -NH2 or -NH-）；3109（-CH-，Pc）；2936，2871（-CH- and -CH2-）；1672（amide I，C=O）；1598（amide II，NH）；1452（C=C），804(Ar-H，para-position）；754（Zn-N）；939（C-N，heterocyclic nitrogen）；1237，1091（C-O-C）。

[0044] 实施例4

[0045] 将实施例2中所用偶联物（I）替换为实施例3所得偶联物（III），其余步骤同实施例2，制得酞菁（2）-壳寡糖偶联物的季铵化衍生物（IV），最终检测到其季铵化取代度也是
0.943。

[0046] 产物的表征数据：1H NMR（400 MHz，DMSO） δ 9.48-9.30（m，Pc-Hα），8.90（d，Pc-Hα），8.28（m，Pc-Hβ），7.80（m，Pc-Hβ），7.50-7.31（m，Ar-H），6.01（m，H1，Hb），5.50-3.55（m，H3-H6，H6ˊ），3.25（d，J=6.0 Hz Hc），3.14（s，N+（CH3）3），2.34（m，CH2），1.86-1.75(m，CH2/--1COCH3），1.24，2.68（m，CH2）。FT-IR（KBr，cm ）：3647-3106（-OH and -NH2 or - NH-）；3019（-CH-，Pc）；2929，2873（-CH- and -CH2-）；1652（amide I，C=O）；1573（amide II，NH）；1474（-N（CH3）3+）；1441(C=C），821（Ar-H）；1209，1133，1097（C-O-C）；962（C-N，heterocyclic nitrogen），791（Zn-N）。

[0047] 实施例5

[0048] 利用本发明所得酞菁-壳寡糖偶联物及其季铵化衍生物制备光动力药物（即光敏药剂）的方法是：用水或水和其它物质的混合溶液（混合溶液中其它物质的含量不高于
10wt％）作为溶剂，溶解本发明酞菁-壳寡糖偶联物及其季铵化衍生物，配制成蓝色均匀的药剂（药剂中酞菁的浓度为0.1mM）；所述其它物质为蓖麻油衍生物、二甲亚砜、乙醇、甘油、N,N-二甲基甲酰胺、聚乙二醇300 3000、环糊精、葡萄糖、吐温、聚乙二醇单硬脂酸酯中的一~
种或几种。制成的药剂中还可加入抗氧化剂、缓冲剂和等渗剂，以保持光敏药剂的化学稳定性和生物相容性。

[0049] 将本发明所得酞菁-壳寡糖偶联物及其季铵化衍生物溶解在0.5-35wt%二甲亚砜的水溶液中，可作为局部给药用的制剂。

[0050] 实施例6

[0051] 本发明所制备的光动力药物、光敏药剂或光敏剂，在光动力抗癌、光动力抗菌、光动力诊断和光动力消毒中的使用方法与已有技术中运用非本发明所述的酞菁-壳寡糖偶联物及其季铵化衍生物制备的光敏药剂或光敏剂的使用方法相同，但需配套适宜的光源，所
述适宜的光源可以由普通光源连接合适的滤光片来提供或由特定波长的激光来提供，光源
的波长范围为600～800nm，优选600-690nm。

[0052] 实施例7

[0053] 将实施例1、2制备的偶联物（Ι）和季铵化偶联物（II）溶于DMSO溶液中，制成1mM（以酞菁计）的光敏药剂，测试对白色念珠菌Candida albicans的暗毒性和光动力活性。

[0054] 将上述制备的光敏药剂分别与106 CFU/mL菌悬液混合，将酞菁的含量分别稀释到5μM、10μM、20μM和50μM，在培养箱37℃培养3h，以未加偶联物及加入酞菁的菌悬液作为对照组。在≥610 nm的红光（15mW/cm2）下照射30 min，光照结束后，用移液枪定量取20 μL混合菌悬液，稀释一定倍数后，均匀涂布在SDA培养基表面，37℃恒温避光倒置培养，间隔48 h观察计数。

[0055] 上述波长大于610nm的红光是通过500W的卤素灯连接隔热水槽加大于610nm的滤光片来提供的。

[0056] 结果表明，当偶联物（Ι）的溶液浓度高达50μM时，若不进行光照，则对白色念珠菌没有杀伤和生长抑制作用；同样的，季铵化偶联物（II）的溶液浓度高达20μM也几乎无抑菌现象，表明它们没有暗毒性。在光照条件下，偶联物（Ι）和（II）的IC9（0 即杀死90％白色念珠菌所需的药物浓度）分别是9.15μM和4.63μM，而酞菁（1）的IC90却大于50μM，说明本发明所得酞菁-壳寡糖偶联物具有较高的光动力活性。

[0057] 实施例8

[0058] 按实施例7对实施例3、4制备的偶联物（III）和季铵化偶联物（IV）进行光毒性以及暗毒性实验。结果显示，当偶联物（III）的溶液浓度高达50μM时，若不进行光照，则对白色念珠菌没有杀伤和生长抑制作用；同样的，季铵化偶联物（IV）的溶液浓度高达20μM也几乎无抑菌现象，证明所得偶联物的暗毒性较低；在光照条件下，偶联物（III）和（IV）的IC90分别为38.52μM和4.79μM，而酞菁（2）的IC90却大于50μM，再次说明本发明所得酞菁-壳寡糖偶联物具有较高的光动力活性。

[0059] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。