一种L-高丝氨酸生产菌株及其构建方法和应用

摘要

本发明的L‑高丝氨酸生产菌株中的一个或多个与L‑高丝氨酸代谢途径相关的基因被敲除或弱化，并且/或者一个或多个与L‑高丝氨酸代谢途径相关的基因被过表达或增强，并且/或者一个或多个与L‑高丝氨酸代谢途径相关的基因被突变。本发明还提供了该生产菌株的构建方法以及其应用。本发明的L‑高丝氨酸生产菌株，具有产量高、成本低、条件温和、环境污染少等诸多优点，具有广阔的应用前景。

权利要求

1.一种L-高丝氨酸生产菌株，其特征在于，在大肠杆菌K-12野生型MG1655基础上，所述L-高丝氨酸生产菌株中的修饰由以下组成：thrB基因被弱化；thrL基因被敲除；thrA基因被突变为thrA*，且所述thrA*具有抑制产物的反馈抑制的特性；以及rhtA、thrA*、ppc、pntAB和asd基因被过表达，其中所述rhtA的过表达通过rhtA23实现，所述thrB基因的弱化通过thrB基因的氨基酸序列的R235H突变实现，所述thrA*是通过thrA基因的氨基酸序列的G433R突变实现。

2.一种权利要求1所述的L-高丝氨酸生产菌株的构建方法，其特征在于，包括任意顺序的以下步骤：

A、弱化菌株中的thrB基因；

B、过表达菌株中的rhtA基因；

C、敲除菌株中的thrL基因；

D、突变菌株中的thrA基因为thrA*，所述thrA*具有抑制产物的反馈抑制的特性；

E、将含有thrA*基因、asd基因、pcc基因和pntAB基因的重组质粒转入菌株中；

即获得了L-高丝氨酸生产菌株；

其中所述rhtA的过表达通过rhtA23实现，所述thrB基因的弱化通过thrB基因的R235H突变实现，所述thrA*是通过thrA基因的氨基酸序列的G433R突变实现。

3.权利要求1中所述的L-高丝氨酸生产菌株在生产L-高丝氨酸领域的应用。

4.一种生产L-高丝氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：取权利要求1中所述的L-高丝氨酸生产菌株，先将其接种至活化斜面培养基，培养8-

16h后，再将其接种至种子培养基，培养7-12h后，最后，将其接种至发酵培养基中，发酵即得所述L-高丝氨酸。

5.根据权利要求4中所述的生产L-高丝氨酸的方法，其特征在于，进行发酵时，维持温度在37±5℃、溶氧在30-40％，发酵液的pH值在7.0±0.5。

6.根据权利要求4或5中所述的生产L-高丝氨酸的方法，其特征在于，所述斜面培养基为LB培养基；所述种子培养基为TB培养基；所述发酵培养基包括如下成分：葡萄糖5-15g/L，玉米浆15-25g/L,糖蜜12-18g/L，甜菜碱0.1-0.5g/L,(NH4)2SO4 1-5g/L，KCl 1-5g/L，MgSO4·7H2O 0.5-3g/L，MnSO4·H2O 0.01-0.1g/L，其余为水。

说明书

一种L-高丝氨酸生产菌株及其构建方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程领域，具体涉及一种L-高丝氨酸生产菌株及其构建方法和应用。

背景技术

[0002] L-高丝氨酸是一种天然存在的非蛋白氨基酸，作为生物合成苏氨酸、蛋氨酸和赖氨酸共有的中间体而少量存在于很多物种中。由于L-高丝氨酸具有L-型-α氨基酸基本骨
架，并且其γ-羟基具有多样的化学活性，因此，L-高丝氨酸及其衍生物作为医药中间体在
药物学、生理学等方面有重要应用前景。

[0003] 目前，国内外生产L-高丝氨酸主要有以下几种方法：

[0004] (1)化学法；该方法合成L-高丝氨酸主要是采用相对昂贵的L-蛋氨酸为原料，并使用具有严重生物毒性的碘甲烷或溴甲烷作为甲基化试剂，经亲核进攻以保护氨基，再在弱
碱性条件下水解得到产物。该方法不仅成本高，并且需要使用碘化物、生成硫化物，对环境
不友好；

[0005] (2)化学手性拆分方法；该方法是利用混旋的高丝氨酸与手性试剂反应后，会形成非对应异构体的性质差异，由此分离出L-高丝氨酸。该方法产率低，试剂成本高且需使用大
量有机溶剂，对环境有较大污染威胁。

[0006] (3)生物法；目前主要见报导的是生物酶法，其工艺是利用丙酮酸和甲醛在缩醛酶和L-氨基酸脱氢酶的共同作用下生成氨基酸高丝氨酸。该工艺主要问题仍然是成本高，需
要使用有毒原料甲醛和甲酸，并需使用价格昂贵的辅酶等。

[0007] 微生物发酵法具有成本低、条件温和、环境污染少等诸多优点，近年来已经成为生产各类氨基酸的首选工艺。但是，由于高丝氨酸对于细菌生长具有较强的抑制作用(可能是
源于其对谷氨酸脱氢酶活性抑制作用，J Bacteriol.1973Nov；116(2):663-72),对L-高丝
氨酸的直接发酵生产具有挑战性。因此，目前尚未探索出合适的通过发酵获得L-高丝氨酸
的方法。

发明内容

[0008] 本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种L-高丝氨酸生产菌株。

[0009] 本发明要解决的第二个技术问题是提供一种构建L-高丝氨酸生产菌株的方法。

[0010] 本发明要解决的第三个技术问题是现有技术中的生产L-高丝氨酸的方法存在生产成本高、污染大、产率低的问题，进而提供一种可实现低成本、高产量、条件温和、环境污
染少的生产L-高丝氨酸的方法。

[0011] 本发明的L-高丝氨酸生产菌株，所述L-高丝氨酸生产菌株中的一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因被敲除或弱化，并且/或者一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径
相关的基因被过表达或增强，并且/或者一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因被
突变；

[0012] 其中，所述被敲除或弱化的基因为thrB、thrL中的一个或两个；所述被突变的基因为thrA*，且所述thrA*具有抑制产物的反馈抑制的特性；所述被过表达或增强的基因为
rhtA、thrA*、ppc、pntAB、asd中的一个或多个。

[0013] 优选地，所述thrA*为thrA*(G433R)；

[0014] 具体而言：所述thrB基因的敲除或弱化可阻断或减弱L-高丝氨酸往L-苏氨酸的转化，从而提高L-高丝氨酸的产量；

[0015] 所述thrL基因为编码前导肽基因，其敲除或弱化可去除或减弱了转录衰减调控，保证thrA基因的转录效率；

[0016] 所述thrA基因的突变可引入抑制产物的反馈抑制，解除产物的反馈抑制；所述rhtA基因的过表达或增强表达可提高L-高丝氨酸生产菌株对L-高丝氨酸的外运能力，同时
提高L-高丝氨酸生产菌株对L-高丝氨酸的耐受性；

[0017] 所述ppc、pntAB、thrA*、asd基因均属于用以糖酵解、天门冬氨酸合成以及还原性辅酶循环转化等、与天门冬氨酸或苏氨酸发酵相关的基因，其过表达或增强表达可增强从
葡萄糖到L-高丝氨酸的合成途径；

[0018] 所述thrB的R235H突变体可消除苏氨酸合成缺陷所带来的潜在的菌体生长问题。

[0019] 优选地，所述L-高丝氨酸生产菌株属于大肠杆菌种属。

[0020] 本发明还提供了所述的L-高丝氨酸生产菌株的构建方法，包括以下步骤中一步或多步：

[0021] A、L-高丝氨酸生产菌株中一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因被敲除或弱化；

[0022] B、L-高丝氨酸生产菌株中一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因被过表达或增强；

[0023] C、L-高丝氨酸生产菌株中一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因被突变；

[0024] D、将含有L-高丝氨酸代谢途径中敲除或被弱化和/或过表达或增强和/或突变关键基因的重组质粒转入菌株中，即获得了L-高丝氨酸生产菌株。

[0025] 优选地，所述步骤A中所述的被敲除或弱化的基因为thrB、thrC、thrL中的一个或多个；

[0026] 所述步骤B中所述的被突变的基因为thrA*，且所述thrA*具有抑制产物的反馈抑制的特性；

[0027] 所述步骤C中所述的被过表达或增强的基因为rhtA、thrA*、ppc、pntAB、asd中的一个或多个。

[0028] 优选地，所述步骤D中所述的菌株为大肠杆菌。

[0029] 进一步优选地，所述菌株为大肠杆菌K-12野生型MG1655。

[0030] 本发明所述的L-高丝氨酸生产菌株在生产L-高丝氨酸领域的应用。

[0031] 本发明还提供了一种生产L-高丝氨酸的方法，包括以下步骤：

[0032] 取权利要求1或2中所述的L-高丝氨酸生产菌株，先将其接种至活化斜面培养基，培养8-16h后，再将其接种至种子培养基，培养7-12h后，最后，将其接种至发酵培养基中，发
酵即得所述L-高丝氨酸。

[0033] 优选地，进行发酵时，维持温度在37±5℃、溶氧在30-40％，发酵液的pH值在7.0±0.5。

[0034] 优选地，所述斜面培养基为LB培养基；所述种子培养基为TB培养基；所述发酵培养基包括如下成分：葡萄糖5-15g/L，玉米浆15-25g/L,糖蜜12-18g/L，甜菜碱0.1-0.5g/L,
(NH4)2SO41-5g/L，KCl 1-5g/L，MgSO4·7H2O 0.5-3g/L，MnSO4·H2O 0.01-0.1g/L，其余为
水。

[0035] 本发明的上述技术方案，相比现有技术具有以下优点：

[0036] (1)本发明对于L-高丝氨酸代谢途径相关的特定基因进行改造，可实现截断苏氨酸合成途径中高丝氨酸的下游途径、增强上游相关生物合成基因、弱化分支代谢途径的技
术效果，由此得到高产的L-高丝氨酸的生产菌株；

[0037] (2)本发明的技术方案在构建L-高丝氨酸的生产菌株时，采用的手段具体包括敲除(或弱化)染色体上编码高丝氨酸激酶的天然基因thrB、过表达L-高丝氨酸产物泵出基
因，由此得到能耐受L-高丝氨酸并不代谢L-高丝氨酸的菌株；还包括通过基因工程修饰或
增强原有菌种中编码糖酵解以及天门冬氨酸、部分苏氨酸生物合成的相关基因，使得菌种
自发合成L-高丝氨酸；

[0038] (3)本发明所构建的L-高丝氨酸生产菌株在发酵过程中，仅以葡萄糖为唯一碳源，辅以低成本氮源，在不需要添加任何氨基酸的发酵条件下，就能够实现发酵过程中L-高丝
氨酸的有效积累，具有广阔的工业应用前景；

[0039] (4)本发明的L-高丝氨酸的方法，相较于化学法、化学手性拆分法、生物法生产L-高丝氨酸，具有产量高、成本低、条件温和、环境污染少等诸多优点。

具体实施方式

[0040] 实施例1-中均采用大肠杆菌MG1655构建L-高丝氨酸生产菌株，对所述大肠杆菌基因组中的基因进行敲除和编辑主要是基于Lambda-Red重组、FLP-FRT重组和CRISPR/Cas9技
术。可参考的文献Lambda Red RecombinationOne-step inactivation of chromosomal 
genes inEscherichia coli K-12 using PCR products.Proc Natl Acad Sci U S 
A.2000Jun 6；97(12):6640-5.和Development of a fast and easy method for 
Escherichia coli genome editing with CRISPR/Cas9.Microb Cell Fact.2016Dec 1；
15(1):205.。

[0041] 实施例1敲除thrB基因的菌株MG1655(ΔthrB)的构建

[0042] 本实施例构建的L-高丝氨酸生产菌株为thrB基因被敲除的菌株MG1655(ΔthrB)，其构建方法可参考文献:Proc Natl Acad Sci U S A.2000Jun 6；97(12):6640-5，具体包
括如下步骤：

[0043] (1)以pΔthrB-H1-f/pΔthrB-H2-r为引物、以包含卡纳抗性盒的质粒为模板，进行PCR扩增，并胶回收、纯化该两侧带有thrB同源臂和FRT位点的含卡纳抗性的线性DNA片
段；

[0044] 所述引物pΔthrB-H1-f具有如SEQ ID No.1所示的序列，所述引物pΔthrB-H2-r具有如SEQ ID No.2所示的序列，具体如下：

[0045] SEQ ID No.1:5’-TGGTTAAAGTTTATGCCCCGGCTTCCAGTGCCAATATGAGCGTCGGGTTTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGAAG-3’

[0046] SEQ ID No.2:5’-TTAGTTTTCCAGTACTCGTGCGCCCGCCGTATCCAGCCGGCAAATATGAACATGGGAATTAGCCATGGTCCATATG-3’

[0047] (2)取大肠杆菌MG1655，先转入Red协助质粒pKD46(即氨苄抗性)，通过诱导表达Gam、Bet以及Exo，这3种Lambda噬菌体重组酶，再转入步骤(1)中扩增纯化得到的所述线性
DNA片段；然后，将其在卡纳抗性培养基内培养，并在培养出的菌落中筛选ΔthrB的基因型
菌落；

[0048] (3)将步骤(2)中筛选确认的菌落在42℃下培养消除pKD46，将其制备感受态细胞，在该感受态细胞中转入pCP20质粒，然后在30℃下用氨苄抗性筛选目标菌，升温诱导FLP表
达并消除抗性，即得到所述菌株MG1655(ΔthrB)。

[0049] 本实施例中采用的所述包含卡纳抗性盒的质粒为pKD4，购买自http://www.biofeng.com；所述大肠杆菌K-12MG1655购买自ATCC(ATCC47076)；所述Red协助质粒
pKD46购买自http://www.biofeng.com；所述pCP20质粒购买自http://
www.miaolingbio.com；需要说明的是，上述各材料均为市售，对于实现本发明的目的来说，
不同厂家、不同规格的产品并不影响本发明的实施。本实施例中，所述卡纳抗性培养基的成
分为：含35mg/L卡纳霉素LB培养基。

[0050] 实施例2敲除thrB基因、过表达rhtA基因的菌株MG1655(ΔthrB,rhtA23)

[0051] 本实施例构建的L-高丝氨酸生产菌株为thrB基因被敲除、rhtA基因被过表达的菌株MG1655(ΔthrB,rhtA23)，其构建方法可参考文献:Microb Cell Fact.2016Dec 1；15
(1):205，具体包括如下步骤：

[0052] (1)以大肠杆菌MG1655为模板，以pSOE-rhtA23-H1-f、pSOE-rhtA23-H1-r、pSOE-rhtA23-H2-f、pSOE-rhtA23-H2-r、prhtA23-N20-f、prhtA23-N20-r为引物，通过重叠延伸
PCR法(即SOE-PCR法)进行扩增，将苏氨酸-高丝氨酸抗性基因(转移泵基因)rhtA上游直接
相邻碱基从G替换成A，得到rhtA23供体DNA片段,并在两端引入构建CRISPR/Cas9基因编辑
质粒所需克隆位点；

[0053] 其中，所述引物pSOE-rhtA23-H1-f具有如SEQ ID No.3所示的序列，所述引物pSOE-rhtA23-H1-r具有如SEQ ID No.4所示的序列，所述引物pSOE-rhtA23-H2-f具有如SEQ 
ID No.5所示的序列，所述引物pSOE-rhtA23-H2-r具有如SEQ ID No.6所示的序列，所述引
物prhtA23-N20-f具有如SEQ ID No.7所示的序列，所述引物prhtA23-N20-r具有如SEQ ID 
No.8所示的序列，具体如下：

[0054] SEQ ID No.3：5’-CCAGGTCTCAGTGCCAAATGTGATTCAAATAAGTCCTAAG-3’；

[0055] SEQ ID No.4：5’-GTAATGAACCAGGCATTCTTTCTCCCACAAATATC-3’；

[0056] SEQ ID No.5：5’-GATATTTGTGGGAGAAAGAATGCCTGGTTCATTAC-3’；

[0057] SEQ ID No.6：5’-CCAGGTCTCAGAGCAGTGGTCCGGTGAACTC-3’；

[0058] SEQ ID No.7：5’-AGCGATTTGTGGGAGAAAGAATGCC-3’；

[0059] SEQ ID No.8：5’-AAACGGCATTCTTTCTCCCACAAAT-3’。

[0060] 所述rhtA23供体DNA片段具有如SEQ ID No.9所示的序列，具体如下：

[0061] SEQ ID No.9：

[0062] 5’-CAAATGTGATTCAAATAAGTCCTAAGTTTTAAATATATCAAAAATTAATGGGAAACTCTTCGCGATTTGTGATGTCTAACGGGCCATTTCATGTAACAGAACGTTTCCATACACCGCTATCCATCTAAATTTAAATCACTT
TTTCAGAGAACTGCGTAAGTATTACGCATGTTTTCCCTGTCATTCATCCAGATTATTCCTAATCACCAGACTAATG
ATTCCATCAATCCTGGCGCATTTTAGTCAAAACGGGGGAAAATTTTTTCAACAAATGCTCGACCAGCATTGGGTAT
ATCCAGTACACTCCACGCTTTACTTAAGTCTAGATATTTGTGGGAGAAAGAATGCCTGGTTCATTACGTAAAATGC
CGGTCTGGTTACCAATAGTCATATTGCTCGTTGCCATGGCGTCTATTCAGGGTGGAGCCTCGTTAGCTAAGTCACT
TTTTCCTCTGGTGGGCGCACCGGGTGTCACTGCGCTGCGTCTGGCATTAGGAACGCTGATCCTCATCGCGTTCTTT
AAGCCATGGCGACTGCGCTTTGCCAAAGAGCAACGGTTACCGCTGTTGTTTTACGGCGTTTCGCTGGGTGGGATGA
ATTATCTTTTTTATCTTTCTATTCAGACAGTACCGCTGGGTATTGCGGTGGCGCTGGAGTTCACCGGACCACT-3’

[0063] (2)将步骤(1)中得到的所述rhtA23供体DNA与对应的靶点序列N20克隆到温敏质粒中，所述温敏质粒含有通过诱导表达Gam、Bet以及Exo 3种Lambda噬菌体重组酶、Cas9DNA
内切酶；

[0064] (3)筛选步骤(2)中得到的所述温敏质粒，并将正确的质粒转入实施例1中得到的所述菌株MG1655(ΔthrB)的感受态细胞中，然后，在30℃下进行培养，将成功转入的菌株置
于阿拉伯糖诱导条件下继续培养，使其表达Lambda噬菌体重组酶、gRNA和Cas9DNA内切酶，
再筛选目标rhtA23突变体菌落；

[0065] (4)将步骤(3)中筛选确认的所述目标rhtA23突变体菌落在42℃下培养消除CRISPR/Cas9质粒，同时消除质粒所导致的卡纳霉素抗性，即得到所述菌株MG1655(ΔthrB,
rhtA23)。

[0066] 本实施例中采用的所述温敏质粒具有文献Cell Fact.2016Dec1；15(1):205.中的温敏质粒pRed_Cas9_recA_Δpoxb300所示的DNA序列结构；所述大肠杆菌MG1655购买自
ATCC；需要说明的是，上述各材料均为市售，对于实现本发明的目的来说，不同厂家、不同规
格的产品并不影响本发明的实施。本实施例中，所述阿拉伯糖诱导条件具体为：在含20mM阿
拉伯糖的LB培养基中，30℃诱导培养。

[0067] 实施例3弱化thrB基因、过表达rhtA基因的菌株MG1655(thrB(R235H),rhtA23)的构建

[0068] 本实施例构建的L-高丝氨酸生产菌株为thrB基因被弱化、rhtA基因被过表达的菌株MG1655(thrB(R235H),rhtA23)，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术实现菌株的构建，对thrB
基因的R235位置和rhtA的基因上游碱基进行突变，其构建方法与实施例2的方法基本相同，
区别仅在于：以原始菌MG1655为操作对象，分两步分别实现rhtA23和thrB(R235H)的基因编
辑。具体的：第一步是在MG1655菌上，重复实施例2中所述步骤，获得过表达rhtA基因的菌
株；第二步，在该过度菌株的基础上使用一样的方法实现对thrB基因R235位置的编辑：只是
将实施例2中所述步骤(1)中采用的引物由所述pSOE-rhtA23-H1-f、pSOE-rhtA23-H1-r、
pSOE-rhtA23-H2-f、pSOE-rhtA23-H2-f、prhtA23-N20-f、prhtA23-N20-r，替换为pSOE-
thrB-R235H-H1-f、pSOE-thrB-R235H-H1-r、pSOE-thrB-R235H-H2-f、pSOE-thrB-R235H-H2-
r、pthrB-R235H-N20-f、pthrB-R235H-N20-r；

[0069] 其中，所述引物pSOE-thrB-R235H-H1-f具有如SEQ ID No.10所示的序列，所述引物pSOE-thrB-R235H-H1-r具有如SEQ ID No.11所示的序列，所述引物pSOE-thrB-R235H-
H2-f具有如SEQ ID No.12所示的序列，所述引物pSOE-thrB-R235H-H2-r具有如SEQ ID 
No.13所示的序列，所述引物pthrB-R235H-N20-f具有如SEQ ID No.14所示的序列，所述引
物pthrB-R235H-N20-r具有如SEQ ID No.15所示的序列，具体如下：

[0070] SEQ ID No.10:5’-CCAGGTCTCAGTGCCCGGCAGCATTCATTACGAC-3’；

[0071] SEQ ID No.11：5’-CTCGTGATATGGCTCGGCTATAACATCTTTCATCAGCTTCGC-3’；

[0072] SEQ ID No.12：5’-TAGCCGAGCCATATCACGAGCGGTTACTGCCAGGCTTCCG-3’；

[0073] SEQ ID No.13：5’-CCAGGTCTCAGAGCTTTGCCCAACCCCTGGGTTAC-3’；

[0074] SEQ ID No.14：5’-AGCGTAGCCGAGCCATATCACGAG-3’；

[0075] SEQ ID No.15：5’-AAACCTCGTGATATGGCTCGGCTA-3’。

[0076] 实施例4敲除thrB基因、过表达rhtA基因、敲除thrL基因的菌株MG1655(ΔthrB,rhtA23,ΔthrL)的构建

[0077] 本实施例构建的L-高丝氨酸生产菌株为thrB基因被敲除、rhtA基因被过表达、thrL基因被敲除的菌株MG1655(ΔthrB,rhtA23,ΔthrL)，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术
在实施例2的基础上实现菌株的构建，其构建方法与实施例2的方法基本相同，区别仅在于：
将实施例2中所述步骤(1)中采用的引物由所述pSOE-rhtA23-H1-f、pSOE-rhtA23-H1-r、
pSOE-rhtA23-H2-f、pSOE-rhtA23-H2-f、prhtA23-N20-f、prhtA23-N20-r，替换为pSOE-Δ
thrL-H1-f、pSOE-ΔthrL-H1-r、pSOE-ΔthrL-H2-f、pSOE-ΔthrL-H2-r、pthrL-N20-f、
pthrL-N20-r；

[0078] 其中，所述引物pSOE-ΔthrL-H1-f具有如SEQ ID No.16所示的序列，所述引物pSOE-ΔthrL-H1-r具有如SEQ ID No.17所示的序列，所述引物pSOE-ΔthrL-H2-f具有如
SEQ ID No.18所示的序列，所述引物pSOE-ΔthrL-H2-r具有如SEQ ID No.19所示的序列，
所述引物pthrL-N20-f具有如SEQ ID No.20所示的序列，所述引物pthrL-N20-r具有如SEQ 
ID No.21所示的序列，具体如下：

[0079] SEQ ID No.16:5’-CCAGGTCTCAGTGCCCAGGTCTCAGTGC-3’；

[0080] SEQ ID No.17：5’-TAGGCATAGCGCACAGACAGATAAAGACTCTAGAGTCCGACCAAAGGTAACGAGGTAAC-3’；

[0081] SEQ ID No.18：5’-GTTACCTCGTTACCTTTGGTCGGACTCTAGAGTCTTTATCTGTCTGTGCGCTATGCCTA-3’；

[0082] SEQ ID No.19：5’-CCAGGTCTCAGAGCGCACTGCCCCAACAAACTAATGC-3’；

[0083] SEQ ID No.20：5’-AGCGACCACCATCACCATTACCAC-3’；

[0084] SEQ ID No.21：5’-AAACGTGGTAATGGTGATGGTGGT-3’。

[0085] 实施例5弱化thrB基因、过表达rhtA基因、敲除thrL基因的菌株MG1655(thrB(R235H),rhtA23,ΔthrL)的构建

[0086] 本实施例构建的L-高丝氨酸生产菌株为thrB基因被弱化、rhtA基因被过表达、thrL基因被敲除的菌株MG1655(thrB(R235H),rhtA23,ΔthrL)，采用CRISPR/Cas9基因编辑
技术实现菌株的构建，其构建方法与实施例4的方法基本相同，区别仅在于：本菌株是在实
施例3生成菌株基础上获得。

[0087] 实施例6敲除thrB基因、过表达rhtA基因、敲除thrL基因、突变thrA基因的菌株MG1655(ΔthrB,rhtA23,ΔthrL,thrA*(G433R))的构建

[0088] 本实施例构建的L-高丝氨酸生产菌株为thrB基因被敲除、rhtA基因被过表达、thrL基因被敲除、thrA基因被突变的菌株MG1655(ΔthrB,rhtA23,ΔthrL,thrA*(G433R))，
采用CRISPR/Cas9基因编辑技术实现菌株的构建，其构建方法与实施例2的方法基本相同，
区别仅在于：本菌株是在实施例4生成菌株基础上获得，且将实施例2中所述步骤(1)中采用
的引物由所述pSOE-rhtA23-H1-f、pSOE-rhtA23-H1-r、pSOE-rhtA23-H2-f、pSOE-rhtA23-
H2-f、prhtA23-N20-f、prhtA23-N20-r，替换为pSOE-thrA*-H1-f、pSOE-thrA*-H1-r、pSOE-
thrA*-H2-f、pSOE-thrA*-H2-r、pthrA-N20-f、pthrA-N20-r；

[0089] 其中，所述引物pSOE-thrA*-H1-f具有如SEQ ID No.22所示的序列，所述引物pSOE-thrA*-H1-r具有如SEQ ID No.23所示的序列，所述引物pSOE-thrA*-H2-f具有如SEQ 
ID No.24所示的序列，所述引物pSOE-thrA*-H2-r具有如SEQ ID No.25所示的序列，所述引
物pthrA-N20-f具有如SEQ ID No.26所示的序列，所述引物pthrA-N20-r具有如SEQ ID 
No.27所示的序列，具体如下：

[0090] SEQ ID No.22:5’-CCAGGTCTCAGTGCTGAAAGGGATGGTCGGCATG-3’；

[0091] SEQ ID No.23：5’-TATCAACATTGTCGCCATTGCTCAGGGATCTTCTGAACGCTCAATCTC-3’；

[0092] SEQ ID No.24：5’-GAGATTGAGCGTTCAGAAGATCCCTGAGCAATGGCGACAATGTTGATA-3’；

[0093] SEQ ID No.25：5’-CCAGGTCTCAGAGCCATATTGATCCGCCACTGCCTGGC-3’；

[0094] SEQ ID No.26：5’-AGCGTTCAGAAGATCCCTGAGCAA-3’；

[0095] SEQ ID No.27：5’-AAACTTGCTCAGGGATCTTCTGAA-3’。

[0096] 实施例7弱化thrB基因、过表达rhtA基因、敲除thrL基因、突变thrA基因的菌株MG1655(thrB(R235H),rhtA23,ΔthrL,thrA*(G433R))的构建本实施例构建的L-高丝氨酸
生产菌株为thrB基因被弱化、rhtA基因被过表达、thrL基因被敲除、thrA基因被突变的菌株
MG1655(thrB(R235H),rhtA23,ΔthrL,thrA*(G433R))，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术实
现菌株的构建，其构建方法与实施例6的方法基本相同，区别仅在于：本菌株是在实施例5生
成菌株基础上获得。

[0097] 实施例8重组质粒pHom1的构建及其菌株

[0098] 本实施例构建的L-高丝氨酸生产菌株为thrA*基因被突变、asd基因被过表达的菌株，将基因Asd过表达利用了thrA*内部天然的thrB的核糖体结合位点，其构建方法如下：

[0099] (1)以pACYC-duet为载体，通过SOE-PCR法将thrA*基因与asd基因克隆到天然的Lac启动子下方，得到具有p15a复制原点和氯霉素抗性基因的质粒pHom1；

[0100] (2)将步骤(1)中得到的所述质粒pHom1转入大肠杆菌MG1655中，即得所述L-高丝氨酸生产菌株。

[0101] 作为本实施例优选的实施方式，可将步骤(1)中得到的所述质粒pHom1转入实施例1-7中制备得到所述L-高丝氨酸生产菌株中。

[0102] 本实施例中采用的所述pACYC-duet的载体购买自Novagen公司。需要说明的是，上述各材料均为市售，对于实现本发明的目的来说，不同厂家、不同规格的产品并不影响本发
明的实施。

[0103] 取本实施例中制备得到的所述L-高丝氨酸生产菌株、将所述质粒pHom1分别转入实施例1-7中制备得到的所述L-高丝氨酸生产菌株，进行发酵实验，结果证明上述7种所述
L-高丝氨酸生产菌株具有稳定的将L-天门冬氨酸转化为L-高丝氨酸的能力。

[0104] 实施例9重组质粒pHom2的构建及其菌株

[0105] 本实施例构建的L-高丝氨酸生产菌株为thrA*基因被突变，asd基因、pcc基因、pntAB基因被过表达的菌株，其构建方法如下：

[0106] (1)以pACYC-duet为载体，通过SOE-PCR法将thrA*基因、asd基因pcc基因、pntAB基因克隆到天然的Lac启动子下方，得到具有p15a复制原点和氯霉素抗性基因的质粒pHom2；

[0107] (2)将步骤(1)中得到的所述质粒pHom2转入大肠杆菌MG1655中，即得所述L-高丝氨酸生产菌株。

[0108] 作为本实施例优选的实施方式，可将步骤(1)中得到的所述质粒pHom1转入实施例1-7中制备得到所述L-高丝氨酸生产菌株中。

[0109] 取本实施例中制备得到的所述L-高丝氨酸生产菌株、将所述质粒pHom2分别转入实施例1-7中制备得到的所述L-高丝氨酸生产菌株，进行发酵实验，结果证明上述7种所述
L-高丝氨酸生产菌株具有具有自发生产L-高丝氨酸的能力。

[0110] 实施例10L-高丝氨酸生产菌株发酵生产L-高丝氨酸

[0111] 本实施例采用实施例1中制备得到的菌株进行L-高丝氨酸的发酵生产，其生产方法具体如下：

[0112] 取实施例1最终制备得到的菌株，将其接种至活化斜面培养基，在37℃下培养12h后，用接种环刮取斜面菌种，再将其接种至种子培养基，在37℃、转速250rpm下，培养10.5h，
然后按10％(v/v)的接种量转接至装有发酵培养基的容量为3L的发酵罐中进行发酵，发酵
即得L-高丝氨酸。

[0113] 作为本实施例优选的实施方式，在所述发酵罐中进行发酵时，维持温度在37℃、溶氧在30-40％，并用NH3·H2O调节发酵液pH值在7.0；作为进一步优选的实施方式，在所述发
酵罐中发酵时，在线监测所述发酵液中葡萄糖的残留量，当其下降至3g/L时，流加70％葡萄
糖至发酵液的残糖量为1-5g/L。本领域技术人员可根据实际情况对上述条件进行一定幅度
的调整，并不影响本发明目的的实现。

[0114] 需要说明的是，本实施例中采用的所述斜面培养基为LB培养基，具体成分为：酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L；所述种子培养基为TB培养基，具体成分为：
酵母膏24g/L，蛋白胨12g/L，甘油4g/L，72mM K2HPO4(所述mM是指mmol/L，下同，后文不再冗
述),17mM KH2PO4；所述发酵培养基的具体成分为：葡萄糖10g/L，玉米浆20g/L,糖蜜15g/L，
甜菜碱0.25g/L,(NH4)2SO43g/L，KCl 2g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，MnSO4·H2O0.02g/L，其余为
水，pH值为7.0。本领域技术人员可根据实际情况对上述各成分进行一定幅度的调整，本实
施例仅提供一种具体实现方案,作为本实施例可替换的实施方式，所述发酵培养基包括的
成分含量可替换为以下范围内的任意值：葡萄糖5-15g/L，玉米浆15-25g/L,糖蜜12-18g/L，
甜菜碱0.1-0.5g/L,(NH4)2SO41-5g/L，KCl 1-5g/L，MgSO4·7H2O 0.5-3g/L，MnSO4·H2O 
0.01-0.1g/L，其余为水。

[0115] 作为本实施例可替换的实施方式，所述实施例1最终制备得到的菌株还可替换为实施例2-9中最终制备得到的菌株。

[0116] 实施例11 L-高丝氨酸生产菌株发酵的结果统计

[0117] 本实施例优选采用实施例6和实施例7中所述已转入了pHom2质粒的菌株进行L-高丝氨酸的发酵生产，与MG1655菌对比。其生产方法与实施例10中所述的生产方法完全一致，
对含有质粒的菌发酵时额外添加氯霉素至终浓度30ug/mL。

[0118] 按照采用实施例6中制备得到的菌株进行发酵的实验编号为HomoS6、采用实施例7中制备得到的菌株进行发酵的实验编号为HomoS7，分别对L-高丝氨酸的产量、糖转化率进
行检测和计算，其结果如下：

[0119] 菌种 L-高丝氨酸产量(g/L)MG1655 0
MG1655/pHom2 0.16±0.06
HomoS6/pHom2 34.7±6.4
HomoS7/pHom2 42.3±4.7

[0120] 由上述结果可知，采用本发明的菌株发酵生产L-高丝氨酸的产量最高达约47g/L，表明本发明对各基因的敲除、弱化、增强、过表达、突变起到了明显的效果。

[0121] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或
变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或
变动仍处于本发明创造的保护范围之中。