一种用于促进刺五加苗期生长的方法

摘要

本发明涉及一种促进刺五加苗期生长的方法。发明人在传统育苗方法基础上，首次使用刺五加内生真菌浇灌刺五加实生苗，通过大量实验筛选出促生长效果最佳的内生真菌Alternaria alternata。实验研究表明，本发明方法能有效促进刺五加生物量(株高、根长、冠幅、叶片数、鲜重等)增长。所述的刺五加内生真菌Alternaria alternata是从刺五加活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，具有繁殖快、生产成本低的特点，因此该方法可用于缩短刺五加种植时间且降低种植成本，便于进行大规模生产管理。

权利要求

1.一种促进刺五加苗期生长的方法，其特征在于：使用刺五加内生真菌与刺五加幼苗共生，所述刺五加内生真菌通过以下步骤分离纯化：(1)清洗：冲洗采集到的新鲜刺五加根、茎、叶，除去表面的泥土和灰尘后，用去离子水洗2-4次；

(2)灭菌：用无菌滤纸吸干表面水分，进行表面消毒，无菌滤纸吸干残留水分；

(3)培养：用消毒后的医用剪刀或枝剪分别将根、茎、叶切成根、茎长1cm，叶1cm2的组织块，分别从各个部位中各随机挑取12个组织块，每4个组织块为一组放在加有青霉素的PDA培养基的培养皿中，培养4-8天；

(4)纯化：待长出菌丝后，进行真菌的纯化，得到刺五加内生真菌。

2.根据权利要求1所述的促进刺五加苗期生长的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)刺五加内生真菌的培养：

取刺五加内生真菌菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接种于已灭菌的PDA固体培养基，于28℃活化培养1-2周；

(2)刺五加内生链格孢真菌与刺五加幼苗的共生：

挑取内生真菌菌丝于液体培养基中，28℃摇床培养5-10天，有机土壤高温灭菌，放凉，将刺五加幼苗栽入其中，将摇床培养的菌液倒入苗盆中，每株苗每次加入10-30ml，每周加一次，共生30-60天。

3.根据权利要求2所述的促进刺五加苗期生长的方法，其特征在于：所述步骤(1)中活化培养1周。

4.根据权利要求2所述的促进刺五加苗期生长的方法，其特征在于：所述步骤(2)中28℃摇床培养6-8天，每株苗每次加入15-25mL，共生40-50天。

5.根据权利要求4所述的促进刺五加苗期生长的方法，其特征在于：所述所述步骤(2)中28℃摇床培养7天，每株苗每次加入20mL，共生45天。

6.刺五加内生真菌在制备促进刺五加苗期生长的药剂的用途，所述刺五加内生真菌通过权利要求1所述步骤分离纯化。

7.一种促进刺五加苗期生长的药剂，其特征在于：由刺五加内生真菌液体培养液及辅料组成，所述刺五加内生真菌通过权利要求1所述步骤分离纯化。

说明书

一种用于促进刺五加苗期生长的方法

技术领域

[0001] 本发明属于中药种植技术领域，具体涉及一种内生真菌促进刺五加种子发芽的方法。

背景技术

[0002] 刺五加(拉丁名：Radix Acanthopanacis senticosl，英文名称：Manyprickle Acanthopanax Root)，又称坎柺棒子、刺拐棒、老虎潦、刺花棒、五加参等，为五加科五加属木本植物，主要分布于我国黑龙江、吉林、辽宁、河北、山西等省，俄罗斯、朝鲜、日本也有分布。刺五加具有悠久的药用历史，根、茎、叶、皮和果实均可入药，具有补中益精，坚筋骨、强意志、祛风湿、活血祛瘀、健胃利尿的作用，具有珍贵的药用价值，主治风寒湿痹、腰膝酸痛、筋骨痿软、体虚羸弱、食欲不振、跌打损伤、骨折、水肿、脚气、阴下湿痒等，在《神农本草经》中被列为上品，久服可以轻身、延年益寿，因此有“宁得一把五加，不用金玉满车”的说法。现代药理研究表明刺五加具有兴奋/抑制中枢神经系统、抗疲劳、抗衰老、抗癌、抗菌、消炎、调节内分泌、增强免疫功能的功效。

[0003] 随着刺五加药用价值的不断挖掘，制药、保健品、食品等领域对刺五加原材料的需求大量上升，野生刺五加经历了掠夺式的无序采集，使得野生刺五加资源遭受了严重的破坏，目前已经面临枯竭，远远不能满足市场需求，造成了刺五加价格连年上涨，而刺五加自然状态下生殖能力弱，被中国植物红皮书列为渐危物种，从而使得人工种植刺五加的需求越来越大。目前，刺五加的繁殖方式包括扦插繁殖、组织培养繁殖和种子繁殖三种，其中刺五加无性繁殖困难，且经过无性繁殖的刺五加幼苗孱弱，生长缓慢，而有性繁殖虽然具有幼苗茁壮等天然的优势，但刺五加种子休眠期长，自然状态下的发芽率过低，使其无法满足人工种植刺五加的需要。

[0004] 内生真菌是指生活于不存在外在感染的健康植物组织内部的真菌，研究表明，植物内生菌与病原菌具有相同的生态位，在植物体内相互竞争空间、营养，使病原菌得不到正常的营养供给而消亡，从而增强宿主抵御病害的能力，植物的内生菌还可以分泌抗生素、毒素等代谢物质，可诱导植物产生系统抗性。

[0005] 链格孢菌(Alternaria)为真菌的一种，多数寄居在植物上，一方面，链格孢菌可引起经济作物的病害，因此，多被认定为引起经济作物病害的病原之一。少数种类的链格孢菌还可以侵入人体或动物体，引起皮癣、甲癣等疾病，另一方面，链格孢由于其次代谢产物具有杀虫、灭菌等活性，而具有开发成杀虫剂、抑菌剂的潜力。已有文献报道了链格孢菌AS 3.577能够定向将熊果酸生物合成为3-羰基熊果酸，从而进一步拓阔了链格孢菌的用途。由于链格孢菌一般被视为经济作为疾病的病原，因此，链格孢菌在在农作物种植上的应用报道较少，张志刚等，公开了细极链格孢菌蛋白激发子是一种能诱导植物获得系统性抗病性的蛋白激发子，可使棉花产生对病虫害的抗性，促进植株生长，还可以提高棉花生长功能叶的叶绿素含量、净光合速率，气孔导度、蒸腾速率、外界光合作用有效辐射等，延缓叶片的衰老和光合功能衰退，延长了叶片的光合功能期。但链格孢菌在其他植物种植上的应用现有技术中并没有报道。

[0006] 由于刺五加幼苗植株生长缓慢，因此，在实际生产中需苗圃地抚育一至两年才能移至大田种植，种植周期长且长势不均，为了解决这一问题，本发明通过研究刺五加内生真菌对刺五加的作用，并筛选获得了具有促生作用的内生真菌，从而提供了一种促进刺五加苗期生长的方法。

发明内容

[0007] 本发明的一个目的是提供一种促进刺五加苗期生长的方法，包括使用刺五加内生真菌与刺五加幼苗共生。

[0008] 具体的，包括以下步骤：

[0009] (1)刺五加内生真菌的培养：

[0010] 取刺五加内生真菌菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接种于已灭菌的PDA固体培养基，于28℃活化培养1-2周；

[0011] (2)刺五加内生链格孢真菌与刺五加幼苗的共生：

[0012] 挑取内生真菌菌丝于液体培养基中，28℃摇床培养5-10天，有机土壤高温灭菌，放凉，将刺五加幼苗栽入其中，将摇床培养的菌液倒入苗盆中，每株苗每次加入10-30ml，每周加一次，共生30-60天。

[0013] 优选的，所述步骤(1)中活化培养1周；

[0014] 优选的，所述步骤(2)中28℃摇床培养6-8天，每株苗每次加入15-25mL，共生40-50天，更优选的，所述所述步骤(2)中28℃摇床培养7天，每株苗每次加入20mL，共生45天。

[0015] 优选的：所述刺五加内生真菌通过以下步骤分离：

[0016] (1)清洗：冲洗采集到的新鲜刺五加根、茎、叶，除去表面的泥土和灰尘后，用去离子水洗2-4次；

[0017] (2)灭菌：用无菌滤纸吸干表面水分，进行表面消毒，无菌滤纸吸干残留水分；

[0018] (3)培养：用消毒后的医用剪刀或枝剪分别将根、茎、叶切成根、茎长1cm，叶1cm2的组织块，分别从各个部位中各随机挑取12个组织块，每4个组织块为一组放在加有青霉素的PDA培养基的培养皿中，培养4-8天；

[0019] (4)纯化：待长出菌丝后，进行真菌的纯化，得到刺五加内生真菌。

[0020] 优选的，所述刺五加内生真菌为刺五加内生链格孢菌。

[0021] 本发明的再一个目的是提供刺五加内生真菌在制备促进刺五加苗期生长的药剂的用途。

[0022] 优选的，所述刺五加内生真菌通过以下步骤分离：

[0023] (1)清洗：冲洗采集到的新鲜刺五加根、茎、叶，除去表面的泥土和灰尘后，用去离子水洗2-4次；

[0024] (2)灭菌：用无菌滤纸吸干表面水分，进行表面消毒，无菌滤纸吸干残留水分；

[0025] (3)培养：用消毒后的医用剪刀或枝剪分别将根、茎、叶切成根、茎长1cm，叶1cm2的组织块，分别从各个部位中各随机挑取12个组织块，每4个组织块为一组放在加有青霉素的PDA培养基的培养皿中，培养4-8天；

[0026] (4)纯化：待长出菌丝后，进行真菌的纯化，得到刺五加内生真菌。

[0027] 更优选的，所述刺五加内生真菌为链格孢菌。

[0028] 本发明的另一个目的是提供一种促进刺五加苗期生长的药剂，由刺五加内生真菌液体培养液及辅料组成。

[0029] 优选的，所述刺五加内生真菌通过以下步骤分离：

[0030] (1)清洗：冲洗采集到的新鲜刺五加根、茎、叶，除去表面的泥土和灰尘后，用去离子水洗2-4次；

[0031] (2)灭菌：用无菌滤纸吸干表面水分，进行表面消毒，无菌滤纸吸干残留水分；

[0032] (3)培养：用消毒后的医用剪刀或枝剪分别将根、茎、叶切成根、茎长1cm，叶1cm2的组织块，分别从各个部位中各随机挑取12个组织块，每4个组织块为一组放在加有青霉素的PDA培养基的培养皿中，培养4-8天；

[0033] (4)纯化：待长出菌丝后，进行真菌的纯化，得到刺五加内生真菌。

[0034] 更优选的，所述刺五加内生真菌为链格孢菌。

[0035] 本发明刺五加内生真菌有效菌种菌落形态：细长的白色菌丝群落，菌落正面周围白色，中央绿色，背面黄绿色。显微形态：分生孢子梗暗色，着生简单的或分枝的分生孢子链，既有横隔又有纵隔，倒棍棒形、椭圆形或卵圆形，向顶着生成长链。

[0036] 本发明有益效果

[0037] 1.本发明首次发现了刺五加内生真菌在促进刺五加苗期生长的效果，促进了刺五加内生真菌在制备刺五加生长药剂方面的应用。

[0038] 2、本发明促进刺五加生长的方法所需原料简单、易得，且成本低廉。

[0039] 3、本发明促进刺五加生长的方法效果显著，可明显促进刺五加苗生物量的增加，有效缩短刺五加育苗期，提升刺五加的培育效率，缩短刺五加的种植周期，提升刺五加的种植效益。

附图说明

[0040] 图1为刺五加内生真菌菌种图；

[0041] 图2为链格孢菌共生前刺五加幼苗图；

[0042] 图3为与链格孢菌共生45天后的刺五加幼苗图。

具体实施方式

[0043] 在下文中更详细地描述了本发明以有助于对本发明的理解。

[0044] 实施例1:刺五加内生真菌的分离纯化

[0045] 采用以下步骤分离纯化刺五加内生真菌：

[0046] (1)清洗：冲洗采集到的新鲜刺五加根、茎、叶，除去表面的泥土和灰尘后，用去离子水洗3次；

[0047] (2)灭菌：用无菌滤纸吸干表面水分，进行表面消毒，无菌滤纸吸干残留水分；

[0048] (3)培养：用消毒后的医用剪刀或枝剪分别将根、茎、叶切成根、茎长1cm，叶1cm2的组织块，分别从各个部位中各随机挑取12个组织块，每4个组织块为一组放在加有青霉素的PDA培养基的培养皿中，培养6天；

[0049] (4)纯化：待长出菌丝后，进行真菌的纯化，得到刺五加内生真菌。

[0050] 效果例1：刺五加内生真菌对刺五加苗期生长的影响

[0051] 1、受试物

[0052] 实施例1刺五加内生真菌、链格孢菌、PDB液体培养基和自来水。

[0053] 2、实验对象

[0054] 选择叶片数为2片，植株高度在1-2cm的刺五加当年幼苗20株，随机分为四组，分别为：实施例1组、链格孢菌组、PDB液体培养基组和自来水组，测量记录所有植株的叶片数、株高(cm)、根长(cm)、冠幅(cm)和鲜重(g)。

[0055] 3、实验方法

[0056] (1)取实施例1刺五加内生真菌及链格孢菌菌种，分别在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的PDA固体培养基，于28℃活化培养1周。

[0057] (2)内生真菌与实生苗共生

[0058] 分别挑取步骤(1)培养的实施例1刺五加内生真菌及链格孢菌的真菌菌丝于PDB液体培养基中，28℃摇床培养一周，有机土壤高温灭菌，放凉，将刺五加幼苗栽入其中，将实施例1组刺五加内生真菌及链格孢菌摇床培养的菌液倒入苗盆中，每株苗每次加入20ml，每周加一次，共生45天，其中PDB液体培养基和自来水组添加相同量的PDB液体培养基或自来水，检测共生45天结束时测量记录所有植株的叶片数、株高(cm)、根长(cm)、冠幅(cm)和鲜重(g)，计算生长率，具体实验结果见表1-2。其中

[0059] 生长率(％)＝(共生后-共生前)/共生前×100％。

[0060] 3、实验结果

[0061] 应用统计软件SPSS的多因素方差分析模块进行数据分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

[0062] 表1实验结果显示了仅添加PDB液体培养基的PDB液体培养基组刺五加幼苗的叶片数、株高、根长、冠幅和鲜重的增长量与自来水组大体相似，表明了仅添加PDB液体培养基并不能有效促进刺五加各生物量的增长，而利用刺五加内生真菌或链格孢菌与刺五加幼苗共生的方法，则可显著增加刺五加幼苗的叶片数、株高、根长、冠幅和鲜重，刺五加幼苗的叶片数超过了自来水组的两倍，株高和冠幅甚至超过了自来水组的三倍，其中链格孢菌的效果更加明显，充分证明了利用刺五加内生真菌或链格孢菌与育苗共生的方法可显著促进刺五加幼苗的生长。

[0063] 表1刺五加内生真菌对刺五加苗期生长的影响

[0064]

[0065] 与自来水组比较：**P<0.01.

[0066] 表2刺五加内生真菌对刺五加苗期生物量生长率的影响

[0067]组别 叶片数 株高(cm) 根长(cm) 冠幅(cm) 鲜重(g)
自来水 80.50％ 42.17％ 9.96％ 6.76％ 20.52％
PDB液体培养基 100.00％ 39.08％ 27.94％ 4.98％ 17.10％
实施例1组 310.00％ 239.77％ 163.16％ 199.50％ 82.03％
链格孢菌组 470.00％ 368.60％ 241.18％ 273.76％ 90.34％

[0068] 表2的生长率的实验结果显示了刺五加内生真菌或链格孢菌与刺五加幼苗共生45天后，刺五加幼苗的叶片数生长率超过了310％，远高于自来水组的80.50％和PDB液体培养组的100％，刺五加幼苗的株高、根长、冠幅和鲜重指标的生长率也呈现出与叶片数生长率大体相似的实验结果，该实验结果充分证明了刺五加内生真菌与刺五加幼苗共生的方法具有显著的促进刺五加幼苗生长的效果，可应用于刺五加的培育工作，显著促进刺五加幼苗的生长，缩短育苗周期，提升刺五加栽培的经济效益。刺五加内生真菌，尤其是刺五加内生链格孢菌可用于制备促进刺五加生长的药剂。

[0069] 以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。