通过内部标准物质谱检测微生物的试剂盒

摘要

本发明提供一种通过内部标准物来质谱检测微生物的方法，该内部标准物具有已知的分子量和质荷比，其在微生物检测过程中并不干扰微生物特征蛋白的峰值谱图。本发明还提供了所述内部标准物组合、试剂组合物及其相关检测产品。本发明中利用内部标准物质校正单个微生物样品检测的方法，可适用于包括真菌，细菌等各类用于MALDI‑TOF MS检测的微生物样品中，提高微生物鉴定的准确率，同时弥补了目前市场上只有外部标准物做校正的不足。

权利要求

1.一种飞行时间质谱检测微生物的试剂盒，包括：(1)微生物样品前处理的试剂组合物；

(2)1000Da<平均分子量<3000Da和12000Da<平均分子量<20000Da的内部标准物组合物；

其中所述内部标准物选自1000Da<平均分子量<2000Da的多肽P(33507-63-0)和/或多肽P14R(syntheticpeptide)；和/或者，其中所述内部标准物选自2000Da<平均分子量<3000Da的多肽ACTH fragment18-39(human)；

以及，其中所述内部标准物选自12000Da<平均分子量<180000Da的马脱辅基肌红蛋白Apomyoglobin(equine)。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其中该试剂盒还包括：(3)其他质谱试剂，包括阴性质控品，阳性质控品。

3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中该试剂盒还包括点样及质谱检测用靶片，以及用于比较和校正标准物和待测物分子量的软件。

说明书

通过内部标准物质谱检测微生物的试剂盒

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及用于飞行时间质谱系统检测微生物样品检测的内标校正。

背景技术

[0002] 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption lionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)技术，是近年来飞速发展的蛋白质组学、基因组学技术之一，具 有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，为生命科学研究与临床重大疾病预警和辅助诊断等提供快 速、高通量的分析测试手段，同时也是一种很好的鉴定病原微生物的方法。

[0003] MALDI-TOF-MS的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传 递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过 程。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即 测定离子的质荷比(M/Z)与离子的飞行时间成正比，检测离子。尽管MALDI-TOF-MS的准确度高 达0.1％～0.01％，远远高于目前常规应用的SDS电泳与高效凝胶色谱技术。MALDI-TOF MS技术具有 快速、准确、稳定、高通量、低成本等特点；MALDI-TOF MS技术是临床微生物的常规快速分析技 术，也是耐药微生物的分析技术之一；
MALDI-TOF MS技术为有病原菌资源库的构建提供了有效的 鉴定技术支持。但由于系统误差等因素影响实验结果的精确定量，因此在质谱检测样品时，引入已知 浓度和比例的内标，从而提高单个微生物样品鉴定的准确度和精密度。

[0004] 目前曲线拟合的方法在国内外均有较为普遍的应用，Jiangyue  Wu等(Anal.Chem.1997,69, 3767-3771)利用MALDI-TOF-MS的拟合曲线法对环孢菌素进行了定量测试；Mazarin等(Anal.Chem. 2006,78,2758-2764)结合脉冲梯度旋转核磁共振和MALDI-TOF-MS定量测定多聚物时，同样采用了 拟合曲线进行数据校正；2009年，吕爽等人利用拟合曲线，成功开发了一种磷酸化肽的 MALDI-TOF-MS定量方法。

[0005] 该技术是在完整的微生物中添加酸性基质辅助细胞裂解，激光激发细胞裂解物(小蛋白或多肽)形 成肽质量指纹谱，与已构建的属、种水平的共性参考谱库进行比对分析，从而实现微生物的鉴定。而 各种特征肽或肽指纹的检测结果通过一系列具有特定质荷比(M/Z)的峰值曲线进行标识。在利用 MALDI-TOF MS质谱仪采集样本的准确性是蛋白指纹谱微生物识别体系的关键因素，如果在检测过 程中由于细胞裂解物的杂质或系统误差(继续补充)的影响，会导致检测结果的峰值曲线出现一定程 度的误差(例如1-10个Da分子量的峰值偏移)，因此一般需要通过标准物进行校正，以使得测定峰 值曲线与实际峰值曲线吻合。

[0006] 袁湘林等(《分析化学研究报告》，2001年第29卷第1期)报道了在基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱用于人参皂甙Rg3的定量分析中，选择芦丁作为内标物,在重现性和线性方面都优于棉子糖。分辨率的提高以及以相对峰面积代表待测物浓度，可使平均相对误差明显降低,改善定量结果。然而，该方法并非用于质谱检测微生物中，与MALDI-TOF MS检测微生物采用的线性模式不同的是，人参皂甙Rg3的定量分析所采用的是反射模式，且待测样品的检测范围小于1000Da，同时其检测区间仅限于400-900(M/Z)，无法满足微生物的检测区间，因此受到了限制。

[0007] 中国专利申请2014100902157、发明名称“用于早期糖尿病诊断的多肽标准物”公开了一种用于质谱检测早期糖尿病的内标多肽，该多肽来源于人血清白蛋白，具有19个氨基酸序列。需要经过周期较长的孵育时间，同时该内标肽段用以参与结果判断，通过计算目标肽段与内标肽段的比值来判断罹患糖尿病的风险可能性，而非判断样品本身的检测结果是否检测准确。然而，该方法同样并非用于MALDI-TOF MS检测微生物中，其检测范围均小于1000Da，与微生物检测范围2000Da-20000Da相差较多，无法满足微生物的检测区间，因此受到了限制。

[0008] 作为最接近的现有技术，中国专利申请201510246677.8、发明名称“微生物鉴定用质谱仪分子量校正标准品及其制备方法与应用”公开了一组利用质荷比m/z分别为2094、2466、 3149、4364等18条大肠杆菌特征蛋白作为标准物，以用于校正特征谱图、稳定校正效果。然而，该发明中涉及的标准物虽然可以有效检测微生物，但其必须在质谱检测之前进行平行检测，以对质谱仪进行分子量校正且无法直接判断单个样品检测结果的精确度，其仍然属于外部标准物，在检测过程中增加了步骤，不利于大量微生物样本的高通量、快速、便捷的检测。综上所述，目前已报道的质谱法检测样本均不能满足鉴定微生物样本时对单个样本检测的校正，其中MALDI-TOF MS法只在用于定量测定中使用添加内标的方法，而对于 MALDI-TOF MS法鉴定微生物尚无报道。

[0009] 目前对于市场上使用MALDI-TOF-MS法检测微生物的过程中，检测范围主要是 2000-20000Da(Calderaro等)，尽管有报道(Pignone等，Shah等，Kumar等，Edwards-Jones 等)400-3000Da的质谱峰被用于鉴别分型等方面的研究，但该质量范围内的特征峰不被用于市售MALDI-TOF-MS仪器的鉴定。而在2000-20000Da检测范围中，微生物的主要特征峰小于12000Da(Winkler等)，因此在现有的激光质谱检测微生物的研究中，仍然使用外部标准物、甚至多种外部标准物进行校正，从而增加了检测时间和检测成本。因此，目前需要一种通过飞行时间质谱系统检测微生物特征蛋白的新方法。

发明内容

[0010] 本发明原理在于：根据现有的MALDI-TOF-MS检测微生物的质荷比区间  (3000-13000m/z)，首次提出使用小于3000m/z或大于12000m/z的单一内部标准物，该内部标准物具有已知的分子量和质荷比，其在微生物检测过程中并不干扰微生物特征蛋白的峰值谱图。因此，在每个待检微生物样品中均添加了该内部标准物，使其与每个微生物样品同时产生特定的质谱图，并通过该标准物的已知分子量及其对应的特征峰，来校正每个微生物样品的质谱图(例如，根据标准物的待测分子量与实际分子量的差值，为待测微生物特征蛋白的分子量测量值进行校正，如根据所述差值对实际测量值进行校正)，从而提高单个微生物样品鉴定的准确度和精密度。由于本发明选择的用于校正的内部标准物质选择在 1000-
3000Da或13000-20000Da，其不但可以达到检测效果，也在不影响微生物鉴定的基础上，添加的内部标准物质可以校正单个样品的整个谱图，以弥补MALDI-TOF MS在检测中可能造成偏差的不足。

[0011] 因此，本发明第一个目的是提供一种通过内部标准物来飞行时间质谱检测微生物的方法，该方法包括：

[0012] (1)对微生物样品进行前处理；

[0013] (2)在前处理的微生物样品中加入1000Da<平均分子量<3000Da或12000Da<平均分子量<20000Da的内部标准物；

[0014] (3)将含有内部标准物的微生物样品进行质谱检测，使得微生物样品和内部标准物同时产生特定的质谱图，并通过该标准物的已知分子量及其对应的特征峰，来校正每个微生物样品的质谱图，从而得到准确的检测结果；

[0015] 其中，所述内部标准物可以是上述平均分子量内已知的多肽或/和蛋白标准品或其组合。

[0016] 在一个实施方案中，所述内部标准物选自1000Da<平均分子量<2000Da的已知的多肽或/和蛋白标准品或其组合。在一个具体实施方案中，所述内部标准物选自多肽 P(33507-63-0)，分子量为1347.63Da，其序列为SEQ ID NO:1：RPKPQQFFGLM-NH2；或，选自多肽P14R(synthetic  peptide)，分子量为1533.85Da，其序列为SEQ  ID NO:2： PPPPPPPPPPPPPPR。

[0017] 在一个实施方案中，所述内部标准物选自2000Da<平均分子量<3000Da的已知的多肽或/和蛋白标准品或其组合。在一个具体实施方案中，所述内部标准物选自多肽ACTH fragment18-39(human) ,分子量为2465.19Da，其序列为SEQ  ID  NO:3： RPVKVYPNGAEDESAEAFPLEF。

[0018] 在一个实施方案中，所述内部标准物选自12000Da<平均分子量<180000Da的已知的多肽或/和蛋白标准品或其组合。在一个具体实施方案中，所述内部标准物选自马肌红蛋白 Apomyoglobin(equine),分子量为16952Da，其序列为SEQ ID NO:4： GLSDGEWQQVLNVWGKVEADIAGHGQEVLIRLFTGHPETLEKFDKFKHLKTEAEMKASE DLKKHGTVVLTALGGILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISDAIIHVLHSKHPG DFGADAQGAMTKALELFRNDIAAKYKELGFQG。

[0019] 还在其他实施方案中，所述内部标准物选自上述平均分子量范围内任意组合。在一个具体实施方案中，其中所述内部标准物选自多肽物质P(33507-63-0)与马肌红蛋白 Apomyoglobin(equine)的组合。在另一个具体实施方案中，所述内部标准物选自 P14R(synthetic peptide)与马肌红蛋白Apomyoglobin(equine)的组合；在其他的具体实施方案中，所述内部标准物选自ACTH fragment18-39(human)与马肌红蛋白Apomyoglobin (equine)的组合；以及，在另外的具体实施方案中，所述内部标准物选自选自多肽物质P (33507-63-0)和ACTH fragment18-39(human)的组合。

[0020] 本发明第二个目的是提供一种用于上述方法中的内部标准物。

[0021] 在一个实施方案中，所述内部标准物选自1000Da<平均分子量<2000Da的已知的多肽或/和蛋白标准品或其组合。在一个具体实施方案中，所述内部标准物选自多肽 P(33507-63-0)，分子量为1347.63Da，其序列为SEQ ID NO:1：RPKPQQFFGLM-NH2；或，选自多肽P14R(synthetic  peptide)，分子量为1533.85Da，其序列为SEQ  ID NO:2： PPPPPPPPPPPPPPR。

[0022] 在一个实施方案中，所述内部标准物选自2000Da<平均分子量<3000Da的已知的多肽或/和蛋白标准品或其组合。在一个具体实施方案中，所述内部标准物选自多肽ACTH fragment18-39(human) ,分子量为2465.19Da，其序列为SEQ  ID  NO:3： RPVKVYPNGAEDESAEAFPLEF。

[0023] 在一个实施方案中，所述内部标准物选自12000Da<平均分子量<180000Da的已知的多肽或/和蛋白标准品或其组合。在一个具体实施方案中，所述内部标准物选自马肌红蛋白 Apomyoglobin(equine),分子量为16952Da，其序列为SEQ ID NO:4： GLSDGEWQQVLNVWGKVEADIAGHGQEVLIRLFTGHPETLEKFDKFKHLKTEAEMKASE DLKKHGTVVLTALGGILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISDAIIHVLHSKHPG DFGADAQGAMTKALELFRNDIAAKYKELGFQG。

[0024] 还在其他实施方案中，所述内部标准物选自上述平均分子量范围内任意组合。在一个具体实施方案中，其中所述内部标准物选自多肽物质P(33507-63-0)与马肌红蛋白 Apomyoglobin(equine)的组合。在另一个具体实施方案中，所述内部标准物选自 P14R(synthetic peptide)与马肌红蛋白Apomyoglobin(equine)的组合；在其他的具体实施方案中，所述内部标准物选自ACTH fragment18-39(human)与马肌红蛋白Apomyoglobin (equine)的组合；以及，在另外的具体实施方案中，所述内部标准物选自选自多肽物质P (33507-63-0)和ACTH fragment18-39(human)的组合。

[0025] 本发明第三个目的是提供一种用于飞行时间质谱微生物样品前处理的试剂组合物，其主要成分包括：组分I：乙腈和甲酸；组分II：乙腈，三氟乙酸和α-氰基-4-羟基肉桂酸；组分 III：上述任一部分所述的内部标准物。

[0026] 在一个实施方案中，其中组分I包括：50.0％(v/v)的乙腈、35.0％(v/v)的甲酸，余量为水。组分II包括：52.5％(v/v)的乙腈、2.5％(v/v)的三氟乙酸、15mg/ml(m/v)α-氰基-4-羟基肉桂酸，余量为水。组分Ⅲ包括：多肽物质P(33507-63-0)(平均分子量为1347.3Da)。

[0027] 在一个实施方案中，其中组分I包括：50.0％(v/v)的乙腈、35.0％(v/v)的甲酸，余量为水。组分II包括：52.5％(v/v)的乙腈、2.5％(v/v)的三氟乙酸、15mg/ml(m/v)α-氰基-4-羟基肉桂酸，余量为水。组分Ⅲ包括：P14R(synthetic  peptide)(平均分子量为
1533.85Da)。

[0028] 在一个实施方案中，其中组分I包括：50.0％(v/v)的乙腈、35.0％(v/v)的甲酸，余量为水。组分II包括：52.5％(v/v)的乙腈、2.5％(v/v)的三氟乙酸、15mg/ml(m/v)α-氰基-4-羟基肉桂酸，余量为水。组分Ⅲ包括：ACTH fragment18-39(human)(平均分子量为
2465.19Da)。

[0029] 在一个实施方案中，其中组分I包括：50.0％(v/v)的乙腈、35.0％(v/v)的甲酸，余量为水。组分II包括：52.5％(v/v)的乙腈、2.5％(v/v)的三氟乙酸、15mg/ml(m/v)α-氰基-4-羟基肉桂酸，余量为水。组分Ⅲ包括：马肌红蛋白Apomyoglobin(equine)(平均分子量为
16952Da)。

[0030] 在一个实施方案中，其中组分I包括：50.0％(v/v)的乙腈、35.0％(v/v)的甲酸，余量为水。组分II包括：52.5％(v/v)的乙腈、2.5％(v/v)的三氟乙酸、15mg/ml(m/v)α-氰基-4-羟基肉桂酸，余量为水。组分Ⅲ包括：多肽物质P(33507-63-0)(平均分子量为1347.3Da)，马肌红蛋白Apomyoglobin(equine)(平均分子量为16952Da)。

[0031] 在一个实施方案中，其中组分I包括：50.0％(v/v)的乙腈、35.0％(v/v)的甲酸，余量为水。组分II包括：52.5％(v/v)的乙腈、2.5％(v/v)的三氟乙酸、15mg/ml(m/v)α-氰基-4-羟基肉桂酸，余量为水。组分Ⅲ包括：P14R(synthetic  peptide)(平均分子量为
1533.85Da)，马肌红蛋白Apomyoglobin(equine)(平均分子量为16952Da)。

[0032] 在一个实施方案中，其中组分I包括：50.0％(v/v)的乙腈、35.0％(v/v)的甲酸，余量为水。组分II包括：52.5％(v/v)的乙腈、2.5％(v/v)的三氟乙酸、15mg/ml(m/v)α-氰基-4-羟基肉桂酸，余量为水。组分Ⅲ包括：ACTH fragment18-39(human)(平均分子量为
2465.19Da)，马肌红蛋白Apomyoglobin(equine)(平均分子量为16952Da)。

[0033] 在一个实施方案中，其中组分I包括：50.0％(v/v)的乙腈、35.0％(v/v)的甲酸，余量为水。组分II包括：52.5％(v/v)的乙腈、2.5％(v/v)的三氟乙酸、15mg/ml(m/v)α-氰基-4-羟基肉桂酸，余量为水。组分Ⅲ包括：多肽物质P(33507-63-0)(平均分子量为1347.3Da)，ACTH fragment18-39(human)(平均分子量为2465.19Da)。

[0034] 本发明第四个目的是提供通过上述内部标准物或试剂组合物所制备的用于质谱鉴定未知微生物的检测产品。

[0035] 在一个实施方案中，该产品为飞行时间质谱检测微生物的试剂盒，包括：

[0036] (1)微生物样品前处理的试剂组合物；

[0037] (2)内部标准物组合物。

[0038] 在一个实施方案中，该试剂盒还包括：(3)其他质谱试剂，包括阴性质控品，阳性质控品。

[0039] 在另一实施方案中，该试剂盒还包括点样及质谱检测用靶片，以及用于比较和校正标准物和待测物分子量的软件。

[0040] 本发明的第五个目的是提供通过通过上述内部标准物或试剂组合物或检测产品用于飞行时间质谱系统鉴定微生物样品的内标校正方法，步骤包括：

[0041] (1)用灭菌牙签(或者1μl接种环)挑取部分合适的单菌落于装有10μl组分I的离心管中，进行细胞破碎，蛋白及多肽释放，裂解5分钟；

[0042] (2)取上述溶液1μl加到靶板的孔位上，室温干燥；

[0043] (3)取内部标准物1μl覆盖到同一孔位上，自然干燥；

[0044] (4)打开组分II的微管，移取1μl组分II加到同一孔位上，自然干燥；

[0045] (5)靶板放入飞行时间质谱系统中进行检测，其中通过比较内部标准物的待测分子量与实际分子量的差值，为待测微生物特征蛋白的分子量进行校正。

[0046] 在一个实施方案中，所述微生物检测是确定微生物的属、种、亚种或亚型。在一个具体实施方案中，所述微生物检测是非诊断目的地检测致病菌、污染菌、耐药菌等，或具有诊断目的的致病菌。

[0047] 在一个实施方案中，上述任一方案中的微生物是环境污染中的微生物、食品检疫中的微生物、进出口商品中的微生物、药物研究中耐药性微生物等。

[0048] 在一个实施方案中，上述任一方案中的微生物是原核微生物、真核微生物。在一个具体实施方案中，所述原核微生物包括细菌。所述真核微生物为真菌包括酵母菌、霉菌等。

[0049] 原理和定义

[0050] 飞行时间质谱系统鉴定微生物的原理是：不同的微生物，其含有的蛋白质有差异，微生物样品经处理后，利用飞行时间质谱系统检测，不同的微生物具有其不同的特征指纹图谱，经过飞行时间质谱系统分析软件与数据库中已知微生物的特征谱图进行比对，便可区分不同种微生物，即给出微生物的鉴定结果。由于微生物的特征指纹谱图是飞行时间质谱系统鉴定微生物唯一判断依据，因而谱图的准确是微生物鉴定正确的前提。在每个单个待测样品中添加标准物质，通过分析软件对单个样品校正后，再进行微生物鉴定，从而提高单个样品检测的准确率。

[0051] 应当指出的是，虽然本发明可以用于检测微生物，但本发明仅仅是对检测结果进行校正，以使检测结果与实际结果保持一致。由于通过飞行时间质谱系统检测微生物，需要预先制备待测微生物的特征蛋白图谱，仅仅依靠本发明的内部标准物并不能完成所述检测，因此本发明所涉及的检测方法并不属于疾病的诊断或检测。

[0052] 技术效果

[0053] (1)本发明通过研究在微生物样本中添加标准物质，发现内部标准物质的添加可对单个微生物样本进行校正，并与飞行时间质谱系统微生物样本处理试剂联合使用，可提高微生物鉴定的准确率，同时弥补了目前市场上只有外部标准品做校正的不足；

[0054] (2)本发明所添加的内部标准物质的分子量范围在微生物鉴定范围以外，并且在检测范围以内，均可达到检测及校正的要求；

[0055] (3)本发明中利用内部标准物质校正单个微生物样品检测的方法，可适用于包括真菌，细菌等各类用于MALDI-TOF MS检测的微生物样品中。

附图说明

[0056] 图1-1：克氏柠檬酸杆菌Citrobacter koseri；图1-2：大肠杆菌Escherichia coli[0057] 图1-3：粪肠球菌Enterococcus faecalis；图1-4：肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae

[0058] 图1-5：嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia

[0059] 图1-6：铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa；图1-7：沙门氏菌Salmonella sp.[0060] 图1-8：产酸克雷伯菌Klebsiella oxytoca；图1-9：人葡萄球菌Staphylococcus hominis

[0061] 图1-10：鲍氏不动杆菌Acinetobacter baumannii

[0062] 图1-11：阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae；图1-12：粘质沙雷氏菌Serratia marcescens

[0063] 图2-1：利用三氟乙酸/乙腈有机溶剂溶解多肽质谱图

[0064] 图2-2：利用超纯水溶解多肽质谱图；图2-3：利用超纯水溶解内标组合物[0065] 图2-4：利用三氟乙酸/乙腈溶解内标组合物

[0066] 图3-1：添加内标利用抹板法处理微生物样本大肠杆菌(ATCC8739)

[0067] 图3-2：添加内标利用一步萃取法处理微生物样本大肠杆菌(ATCC8739)[0068] 图3-3：添加内标利用三步离心法处理微生物样本大肠杆菌(ATCC8739)[0069] 图3-4：混合添加内标组合物(内标物拉开图)；图3-5：混合添加内标组合物图[0070] 图4-1：添加内标利用抹板法处理微生物样本大肠杆菌(ATCC8739)出现偏差的峰图

[0071] 图4-2：添加内标利用抹板法处理微生物样本大肠杆菌(ATCC8739)出现偏差重新对仪器校正后的峰图

[0072] 图5：m/z1351处有明显特征峰图

[0073] 图6-1：溶血性葡萄球菌；图6-2：金黄色葡萄球菌；图6-3：人葡萄球菌[0074] 图6-4：铜绿假单胞菌；图6-5：普通变形杆菌；图6-6：产酸克雷伯菌[0075] 图6-7：鲍曼不动杆菌；图6-8：无乳链球菌；图6-9：屎肠球菌

[0076] 图7：表皮葡萄球菌；图8：嗜水气单胞菌

[0077] 图9：利用马肌红蛋白标准物质超纯水溶解鉴定大肠杆菌的蛋白指纹图谱具体实施方式

[0078] 为了进一步了解本发明的技术特征，下面结合具体实施例对本发明进行详细的阐述。实施例只对本发明具有示例性的作用，而不具有任何限制性的作用，本领域的技术人员在本发明的基础上作出任何非实质性的修改，都应属于本发明的保护范围。

[0079] 实施例一：利用飞行时间质谱系统微生物样本前处理试剂盒鉴定微生物[0080] 菌株培养及前处理：将多株北京某医院检验科保存的临床分离菌株37℃培养24小时，获得对应的单菌落，使用灭菌牙签(或者1μl接种环)挑取部分合适的单菌落涂抹于靶板对应点位，吸取1μl组分I覆盖于该点位上，自然干燥，吸取1μl组分II覆盖到同一孔位上，自然干燥后，上机检测并鉴定分析，鉴定结果如表1和图1‐1至图1‐12。

[0081] 表1实施例一中5株菌的鉴定结果

[0082]

[0083]

[0084] 由上述鉴定结果可知，微生物质谱图(见图1‐1至图1‐12)中主要特征峰分布于 2000‐13000Da之间，因此，本发明中添加的内部标准物分子量小于2000Da或/且大于 
13000Da时，不会产生于微生物特征峰相似的质谱峰，从而理论上保证了微生物鉴定的可行性及准确性。

[0085] 实施例二飞行时间质谱系统鉴定微生物的内标组合物制备

[0086] (1)利用三氟乙酸/乙腈溶解标准物质

[0087] 利用三氟乙酸/乙腈有机溶剂(0.1％三氟乙酸和10％乙腈)将多肽标准品干粉(即多肽 P(33507‐63‐0)，分子量1347Da)溶解成100fmol/ul浓度的溶液，仔细混匀后吸取1μl覆盖到靶板点位上，自然干燥，后吸取1μl市售飞行时间质谱系统微生物样本处理试剂中组分Ⅱ(或其他用于微生物鉴定中的基质液)覆盖到同一点位上，自然干燥后，飞行时间质谱仪进行检测，经仪器校正后，该标准物质的检测结果如图2‐1，其在m/z1348.76处有明显的特征峰，说明该标准物质可用三氟乙酸/乙腈溶解，并具有良好的检测效果。

[0088] (2)利用超纯水溶解标准物质

[0089] 利用超纯水将多肽标准品干粉(即多肽P(33507‐63‐0)，分子量1347Da)溶解成500fmol/ul浓度的溶液，仔细混匀后吸取1μl覆盖到靶板点位上，自然干燥后，吸取1μl市售飞行时间质谱系统微生物样本处理试剂中组分Ⅱ(或其他用于微生物鉴定中的基质液)覆盖到同一点位上，自然干燥后，飞行时间质谱仪进行检测，检测结果如图2‐2，其在m/z1348.88处有明显的特征峰，说明该标准物质可用超纯水溶解，并具有良好的检测效果。

[0090] (3)利用超纯水溶解内标组合物

[0091] 用超纯水配制终浓度为500fmol/μL的多肽物质(即多肽P(33507‐63‐0)，分子量1347Da)和终浓度为50fmol/μL的P14R(分子量1533)的混合溶液。仔细混匀后吸取1μl覆盖到靶板点位上，自然干燥，后吸取1μl市售飞行时间质谱系统微生物样本处理试剂中组分Ⅱ(或其他用于微生物鉴定中的基质液)覆盖到同一点位上，自然干燥后，飞行时间质谱仪进行检测，经仪器校正后，该内标组合物的检测结果如图2‐3，其在m/z 1348.64和m/z 
1534.65处有明显的特征峰，说明该内标组合物可用超纯水溶解，并具有良好的检测效果。

[0092] (4)利用三氟乙酸/乙腈溶解内标组合物

[0093] 利用三氟乙酸/乙腈有机溶剂(0.1％三氟乙酸和10％乙腈)配制终浓度为500fmol/μL的多肽物质(分子量1347Da)和终浓度为50fmol/μL的P14R(分子量1533)的混合溶液。仔细混匀后吸取1μl覆盖到靶板点位上，自然干燥，后吸取1μl市售飞行时间质谱系统微生物样本处理试剂中组分Ⅱ(或其他用于微生物鉴定中的基质液)覆盖到同一点位上，自然干燥后，飞行时间质谱仪进行检测。经仪器校正后，该内标组合物的检测结果如图2‐4，其在m/z 1348.48和m/z1534.48处有明显的特征峰，说明该内标组合物可用三氟乙酸/乙腈有机溶剂溶解，并具有良好的检测效果。

[0094] 如上图所述，内部标准物多肽P(33507‐63‐0)的理论分子量(1347.63Da)和P14R的理论分子量(1533.85Da)，与实际检测的分子量均存在细微差值，并且同一内部标准物(如多肽P)的每次检测值也存在一定差值，这说明在激光质谱检测微生物特征蛋白的分子量过程中不可避免存在系统误差。因此，在实际检测微生物过程中，通过加入上述单一或联合内部标准物来校正系统误差，从而能够更加准确地检测和区分不同微生物及其相近分子量的特征蛋白。

[0095] 实施例三飞行时间质谱系统鉴定微生物的内标组合物添加方法优化

[0096] (1)直接添加内标组合物

[0097] 利用抹板法处理微生物样本大肠杆菌(ATCC8739)，并把内标组合物直接添加到样本点位上，具体操作方法为：无菌牙签挑取大肠杆菌单菌落，均匀涂抹在靶板点位上，自然干燥后，在同一点位上覆盖1μl内标组合物(或在样品点上覆盖1μl市售飞行时间质谱系统微生物样本处理试剂中组分Ⅰ，自然干燥后覆盖1μl内标组合物)，自然干燥，吸取1μl市售飞行时间质谱系统微生物样本处理试剂中组分Ⅱ(或其他用于微生物鉴定中的基质液)覆盖到同一点位上，自然干燥后进行飞行时间质谱仪检测。经仪器校正后，该样品的检测结果如图3‐1，其在m/z1348处有明显的特征峰，说明利用抹板法处理微生物样品时，内标组合物可直接添加进样品点中检测。

[0098] 利用一步萃取法处理微生物样本大肠杆菌(ATCC8739)，并把内标组合物直接添加到样本点位上，具体操作方法为：在200μl离心管中加入30μl市售飞行时间质谱系统微生物样本处理试剂中组分I，用1μl无菌接种环或枪头挑取单菌落于上管中，震荡混匀5min，加1μl样品到靶板上，自然干燥，在同一点位上覆盖1μl内标组合物，自然干燥，吸取1μl市售飞行时间质谱系统微生物样本处理试剂中组分Ⅱ(或其他用于微生物鉴定中的基质液)覆盖到同一点位上，自然干燥后进行飞行时间质谱仪检测。经仪器校正后，该样品的检测结果如图 3‐2，其在m/z1348处有明显的特征峰，说明利用一步萃取法处理微生物样品时，内标组合物可直接添加进样品点中检测。

[0099] 利用三步离心法处理微生物样本大肠杆菌(ATCC8739)，并把内标组合物直接添加到样本点位上，具体操作方法为：在1.5ml或2ml离心管中加入300μl纯水，接种环取大肠杆菌单菌落于上管中，震荡均匀，加入900μl乙醇，震荡，12000rpm离心2分钟，弃去上清，离心2 分钟，自然干燥，加50μl70％甲酸，充分震荡，加50μl乙腈，充分震荡，12000rpm离心2 分钟，加1μl样品到靶板上，自然干燥，在同一点位上覆盖1μl内标组合物，自然干燥，吸取1μl市售飞行时间质谱系统微生物样本处理试剂中组分Ⅱ(或其他用于微生物鉴定中的基质液)覆盖到同一点位上，自然干燥后进行飞行时间质谱仪检测。经仪器校正后，该样品的检测结果如图3‐3，其在m/z1348处有明显的特征峰，说明利用三步离心法处理微生物样品时，内标组合物可直接添加进样品点中检测。

[0100] (2)混合添加内标组合物

[0101] 利用抹板法处理微生物样本大肠杆菌(ATCC8739)，并把内标组合物与基质液按1:1比例混合添加到样本点位上，具体操作方法为：无菌牙签挑取大肠杆菌单菌落，均匀涂抹在靶板点位上，自然干燥后，在同一点位上覆盖1μl内标组合物与市售飞行时间质谱系统微生物样本处理试剂中组分Ⅱ(或其他用于微生物鉴定中的基质液)的混合物，自然干燥后进行飞行时间质谱仪检测。经仪器校正后，该样品的检测结果如图3‐4和3‐5，其在m/z1348和m/z1534 处有明显的特征峰，说明利用抹板法处理微生物样品时，内标组合物可与基质液混合添加进样品点中检测。

[0102] 实施例四飞行时间质谱系统鉴定微生物的内标组合物校正效果评价

[0103] 利用内标组合物校正飞行时间质谱系统检测微生物的质谱图，将大肠杆菌(ATCC8739)接种于哥伦比亚血琼脂培养基上，37℃培养24小时，无菌牙签挑取大肠杆菌单菌落，均匀涂抹在靶板点位上，自然干燥后，在同一点位上覆盖1μl内标组合物(或在样品点上覆盖1μl市售飞行时间质谱系统微生物样本处理试剂中组分Ⅰ，自然干燥后覆盖1μl内标组合物)，自然干燥，吸取1μl市售飞行时间质谱系统微生物样本处理试剂中组分Ⅱ(或其他用于微生物鉴定中的基质液)覆盖到同一点位上，自然干燥后进行飞行时间质谱仪检测，该样品的检测结果如图4‐1，其在m/z1348处无明显特征峰，说明该质谱图中质谱峰出现偏差，该样品的质谱检测结果不可信，需重新进行仪器校正并采集数据。

[0104] 上述大肠杆菌样品经内标组合物特征峰m/z1348值判断，质谱图出现偏差，重新对仪器校正后，采集质谱数据，检测结果如图4‐2，该质谱图中m/z 1348处有明显特征峰，说明该质谱图的质谱峰未出现偏差，该样品的质谱检测结果可信。

[0105] 实施例五飞行时间质谱系统鉴定微生物的内标组合物校正效果评价

[0106] 利用内标组合物校正飞行时间质谱系统检测微生物的质谱图，将大肠杆菌(ATCC8739)接种于哥伦比亚血琼脂培养基上，37℃培养24小时，无菌牙签挑取大肠杆菌单菌落，均匀涂抹在靶板点位上，自然干燥后，在同一点位上覆盖1μl内标组合物(或在样品点上覆盖1μl市售飞行时间质谱系统微生物样本处理试剂中组分Ⅰ，自然干燥后覆盖1μl内标组合物)，自然干燥，吸取1μl市售飞行时间质谱系统微生物样本处理试剂中组分Ⅱ(或其他用于微生物鉴定中的基质液)覆盖到同一点位上，自然干燥后进行飞行时间质谱仪检测，该样品的检测结果如图5，其在m/z1351处有明显的特征峰，而在m/z1348处没有明显特征峰，说明该质谱图中质谱峰出现偏差，将该数据利用含有校正功能的鉴定软件进行鉴定，鉴定结果为 Escherichia coli，且其对应的可信度分值为94，说明该内标具有良好的校正效果。

[0107] 实施例六利用飞行时间质谱系统微生物样本处理试剂与本发明中的内标组合物检测微生物样本

[0108] 根据实施例五所述方法检测对临床常见致病菌(表2)进行检测，检测结果如图6‐1至6‐9，经软件分析处理后鉴定结果为表3。

[0109] 表2临床常见致病菌名单

[0110]菌种编号 菌种拉丁名 菌种中文名
6‐1 Staphylococcus haemolyticus 溶血葡萄球菌
6‐2 Staphylococcus aureus 金黄色葡萄球菌
6‐3 Staphylococcus hominis 人葡萄球菌
6‐4 Pseudomonas aeruginosa 铜绿假单胞菌
6‐5 Proteus vulgaris 普通变形杆菌
6‐6 Klebsiella oxytoca 产酸克雷伯菌
6‐7 Acinetobacter baumannii 鲍曼不动杆菌
6‐8 Streptococcus agalactiae 无乳链球菌
6‐9 Enterococcus faecium 屎肠球菌

[0111] 表3临床常见致病菌鉴定结果

[0112]

[0113]

[0114] 实施例七利用飞行时间质谱系统微生物样本处理试剂与本发明中的内标组合物检测皮肤感染患者的致病菌

[0115] 将某医院的手术部位感染患者伤口处化脓性分泌物标本进行接种培养，得到疑似致病菌的单菌落后，利用实施例五所述方法进行微生物样本处理并利用飞行时间质谱仪检测，得到的检测结果如图7，鉴定结果为表皮葡萄球菌该结果与全自动生化鉴定仪鉴定结果一致。

[0116] 实施例八利用飞行时间质谱系统微生物样本处理试剂与本发明中的内标组合物检测食品中的致病菌

[0117] 质谱鉴定结果如图8所示。

[0118] 实施例九利用马肌红蛋白标准物质鉴定大肠杆菌

[0119] 方法：超纯水溶解，质谱鉴定结果如图9所示。