一种转基因斑马鱼在制备慢性粒细胞白血病的动物模型中的应用

摘要

本发明公开了一种转基因斑马鱼在制备慢性粒细胞白血病的动物模型中的应用。该转基因斑马鱼为BCR/ABL转基因斑马鱼，是人源性BCR‑ABL诱导的转基因斑马鱼。本发明将人源性的BCR/ABL mRNA显微注射到斑马鱼胚胎中时，发现其胚胎出现类似慢性粒细胞白血病的表型：中性粒细胞大量增加，这就提示人源性的BCR/ABL蛋白可以在斑马鱼的体内发挥作用；且本发明中首次发现了转基因斑马鱼在幼年和成年时期出现类似人白血病的表型，并证明了可以利用其对治疗白血病的药物进行高通量筛选，即本发明中成功建立了慢性粒细胞白血病的动物模型，可为慢性粒细胞白血病的研究及其药物筛选提供有效的途径。

权利要求

1.一种转基因斑马鱼在制备慢性粒细胞白血病的动物模型中的应用，其特征在于：所述转基因斑马鱼为BCR/ABL转基因斑马鱼；

所述的BCR/ABL转基因斑马鱼通过如下方法构建得到：将重组质粒pTol2 hsp70:BCR/ABL与Tol2转座酶mRNA共同导入野生型斑马鱼中，获得BCR/ABL转基因斑马鱼；其中，所述的重组质粒pTol2 hsp70:BCR/ABL通过如下步骤构建得到：（1）将BCR/ABL融合基因连接到带有Tol2转座子识别位点的质粒中，得到重组质粒pTol2 BCR/ABL；

（2）将hsp70基因启动子插入到重组质粒pTol2 BCR/ABL中，得到重组质粒pTol2 hsp70:BCR/ABL；

所述的BCR/ABL转基因斑马鱼的构建方法，还包括将获得的BCR/ABL转基因斑马鱼进行饲养和热激诱导的步骤，具体为：将获得的BCR/ABL转基因斑马鱼饲养在28.5℃循环养殖系统中，待其发育至8个月大小再进行热激诱导，连续热激处理1个月，随后继续正常饲养，得到所述的转基因斑马鱼；

所述的BCR/ABL转基因斑马鱼表现为外周血或骨髓血中的髓系或髓系前体细胞增多；

步骤（1）中所述的质粒为T2AL200R150G质粒；

步骤（2）中所述的hsp70基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID No：1 所示。

2.根据权利要求1所述的转基因斑马鱼在制备慢性粒细胞白血病的动物模型中的应用，其特征在于：所述的慢性粒细胞白血病是由BCR/ABL融合基因的表达引起的。

3.根据权利要求1所述的转基因斑马鱼在制备慢性粒细胞白血病的动物模型中的应用，其特征在于：所述的慢性粒细胞白血病在通过阻断酪氨酸激酶起作用的药物治疗后症状缓解，或通过阻断TGFβR-I通路的药物治疗后症状缓解。

4.根据权利要求3所述的转基因斑马鱼在制备慢性粒细胞白血病的动物模型中的应用，其特征在于：所述的阻断酪氨酸激酶起作用的药物为依马替尼、达沙替尼和伯舒替尼中的至少一种；

所述的阻断TGFβR-I通路起作用的药物为LY364947。

5.一种转基因斑马鱼在制备用于筛选对慢性粒细胞白血病有效的药物的动物模型中的应用，其特征在于：所述转基因斑马鱼为BCR/ABL转基因斑马鱼；

所述的BCR/ABL转基因斑马鱼通过如下方法构建得到：将重组质粒pTol2 hsp70:BCR/ABL与Tol2转座酶mRNA共同导入野生型斑马鱼中，获得BCR/ABL转基因斑马鱼；其中，所述的重组质粒pTol2 hsp70:BCR/ABL通过如下步骤构建得到：（1）将BCR/ABL融合基因连接到带有Tol2转座子识别位点的质粒中，得到重组质粒pTol2 BCR/ABL；

（2）将hsp70基因启动子序列插入到重组质粒pTol2 BCR/ABL中，得到重组质粒pTol2 hsp70:BCR/ABL；

所述的BCR/ABL转基因斑马鱼的构建方法，还包括将获得的BCR/ABL转基因斑马鱼进行饲养和热激诱导的步骤，具体为：将获得的BCR/ABL转基因斑马鱼饲养在28.5℃循环养殖系统中，待其发育至8个月大小再进行热激诱导，连续热激处理1个月，随后继续正常饲养，得到所述的转基因斑马鱼；

所述的BCR/ABL转基因斑马鱼表现为外周血或骨髓血中的髓系或髓系前体细胞增多；

步骤（1）中所述的质粒为T2AL200R150G质粒；

步骤（2）中所述的hsp70基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID No：1 所示。

6.根据权利要求5所述的转基因斑马鱼在制备用于筛选对慢性粒细胞白血病有效的药物的动物模型中的应用，其特征在于：所述的慢性粒细胞白血病是由BCR/ABL融合基因的表达引起。

7.根据权利要求5所述的转基因斑马鱼在制备用于筛选对慢性粒细胞白血病有效的药物的动物模型中的应用，其特征在于：所述的慢性粒细胞白血病在通过阻断酪氨酸激酶起作用的药物治疗后症状缓解，或通过阻断TGFβR-I通路的药物治疗后症状缓解。

8.根据权利要求7所述的转基因斑马鱼在制备用于筛选对慢性粒细胞白血病有效的药物的动物模型中的应用，其特征在于：所述的阻断酪氨酸激酶起作用的药物为依马替尼、达沙替尼和伯舒替尼中的至少一种；

所述的阻断TGFβR-I通路起作用的药物为LY364947。

说明书

一种转基因斑马鱼在制备慢性粒细胞白血病的动物模型中的

应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，特别涉及一种转基因斑马鱼在制备慢性粒细胞白血病的动物模型中的应用。

背景技术

[0002] 慢性白血病常见有慢性粒细胞白血病(CML)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)。CML患者白血病细胞中可发现BCR/ABL融合基因，CML病程分为慢性期、加速期及急变期。同一疾病的不同时期，肿瘤细胞的生物学行为、临床表现、治疗方法及预后却截然不同。慢性期主要表现为骨髓、外周血和脾脏中大量粒细胞积聚，主要是接近成熟的中、晚幼粒细胞为主，此阶段患者对于羟基脲、干扰素、温和化疗以及酪氨酸激酶抑制剂等相关治疗反应好，能很快获得完全缓解，部分患者缓解后可以接受异基因造血干细胞移植从而达到长期无病生存。慢性期持续大约3～5年左右，CML患者进入加速期，加速期一般持续4～6个月，加速期原始细胞，不成熟细胞比例增高，最后进入急变期。急变期患者病情进一步恶化，骨髓和外周血中无功能白细胞大量积聚，类似于AML(急性髓细胞白血病)和ALL(急性淋巴细胞白血病)的表现。CML可以向髓系和淋巴系急变，急变期对各种治疗效果反应差，预后不佳。

[0003] CML的治疗是一个不断探索的过程，经历了放疗，核素治疗，白消安，羟基脲，其他药物如阿糖胞苷、高三尖杉酯碱、靛玉红、异靛甲、干扰素的使用及联合化疗，到后来酪氨酸激酶抑制剂(Druker BJ,Tamura S,Buchdunger E,Ohno S,Segal GM,Fanning S,Zimmermann J,Lydon NB.Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells.Nature medicine,1996.2(5):p.561-566.)(TKI)的使用后，疗效显著提高。尽管如此，骨髓移植才是目前真正能治愈CML的唯一办法，骨髓移植是应用强烈化疗使CML患者体内肿瘤细胞抑制，然后将正常骨髓移植到患者体内，但骨髓移植费用高昂，一般家庭难以承受，而且骨髓移植难以找到合适的供体，这对供体总量相对紧张的中国来说，更是难上加难。随着TKI的大量应用，临床上越来越多的CML耐药病例出现，耐药已成为临床上CML治疗失败的重要原因。

[0004] 尽管现在有许多小鼠和细胞的CML模型并已取得极大的突破性研究，如传统的BCR/ABL1的转基因小鼠模型和移植小鼠模型和从这些模型中发现的一些靶向药物。但已有的CML模型在机制研究和药物筛选中仍存在不足，细胞水平的疾病模型与体内生理条件相差较远，不能反映全部生理机能且不能全面评价药物不良反应和毒副作用。小鼠模型可以从整体模拟疾病状态及评价药物的作用，所获得的结果具有十分重要的临床价值和应用前景。但传统小鼠等脊椎动物模型存在体型大、成本高、周期长、所需样品量大、无法进行大规模的靶向药物筛选等明显的不足之处(1、Hariharan IK,Harris AW,Crawford M,Abud H,Webb E,Cory S,Adams JM.A bcr-v-abl oncogene induces lymphomas in transgenic mice.Mol Cell Biol,1989.9(7):p.2798-805.2、Honda H,Fujii T,Takatoku M,Mano H,Witte ON,Yazaki Y,Hirai H.Expression of p210bcr/abl by metallothionein promoter induced T-cell leukemia in transgenic mice.Blood,1995.85(10):p.2853-61.3、Kelliher MA,McLaughlin J,Witte ON,Rosenberg N.Induction of a chronic myelogenous leukemia-like syndrome in mice with v-abl and BCR/ABL.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1990.87(17):p.6649-53.4、Zhang,X.and R.Ren,Bcr-Abl efficiently induces a 
myeloproliferative disease and production of excess interleukin-3and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in mice:a novel model for chronic myelogenous leukemia.Blood,1998.92(10):p.3829-40.)。到目前为止，还未有建立一种建模快，体型小，饲养成本低，给药方便，表型阅读简单的脊椎动物模型。

发明内容

[0005] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种转基因斑马鱼在制备慢性粒细胞白血病(CML)的动物模型中的应用。

[0006] 本发明的另一目的在于提供一种转基因斑马鱼在制备用于筛选对慢性粒细胞白血病有效的药物的动物模型中的应用。

[0007] 本发明的再一目的在于提供一种利用转基因斑马鱼筛选对慢性粒细胞白血病有效的药物的方法。

[0008] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种转基因斑马鱼在制备慢性粒细胞白血病(CML)的动物模型中的应用，其中所述转基因斑马鱼为BCR/ABL转基因斑马鱼。

[0009] 所述的BCR/ABL转基因斑马鱼为人源性BCR-ABL诱导的转基因斑马鱼；优选为通过如下方法构建得到：将重组质粒pTol2hsp70:BCR/ABL与Tol2转座酶mRNA共同导入野生型斑马鱼中，获得BCR/ABL转基因斑马鱼。

[0010] 所述的重组质粒pTol2hsp70:BCR/ABL通过如下步骤构建得到：

[0011] (1)将BCR/ABL融合基因连接到带有Tol2转座子识别位点的质粒中，得到重组质粒pTol2BCR/ABL；

[0012] (2)将hsp70基因启动子插入到重组质粒pTol2BCR/ABL中，得到重组质粒pTol2hsp70:BCR/ABL。

[0013] 步骤(1)中所述的BCR/ABL融合基因优选为通过限制性内切酶EcoRI从质粒载体NGFR P210切出获得的BCR/ABL融合基因。

[0014] 步骤(1)中所述的质粒优选为T2AL200R150G质粒。

[0015] 步骤(2)中所述的hsp70基因启动子为带有ClaⅠ、EcoRⅤ和AgeⅠ识别位点的hsp70基因启动子序列；其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

[0016] 所述的将重组质粒pTol2hsp70:BCR/ABL与Tol2转座酶mRNA共同导入野生型斑马鱼中优选为通过如下步骤实现：将重组质粒pTol2hsp70:BCR/ABL与Tol2转座酶mRNA通过显微注射的方法在斑马鱼胚胎发育的1细胞时期导入到斑马鱼胚胎中。

[0017] 所述的Tol2转座酶mRNA是从pCS2-Tol2转座酶载体通过mMESSAGE mMACHINE系统体外转录的Tol2转座酶mRNA；其核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。

[0018] 所述的慢性粒细胞白血病是由BCR/ABL融合基因的表达引起的。

[0019] 所述的慢性粒细胞白血病在通过阻断酪氨酸激酶起作用的药物治疗后症状缓解，或通过阻断TGFβR-I通路的药物治疗后症状缓解。

[0020] 所述的断酪氨酸激酶起作用的药物优选为依马替尼、达沙替尼和伯舒替尼中的至少一种。

[0021] 所述的阻断TGFβR-I通路起作用的药物优选为LY364947。

[0022] 一种转基因斑马鱼在制备用于筛选对慢性粒细胞白血病(CML)有效的药物的动物模型中的应用，其中所述转基因斑马鱼为BCR/ABL转基因斑马鱼。

[0023] 所述的慢性粒细胞白血病(CML)是由BCR/ABL融合基因的表达引起。

[0024] 所述的慢性粒细胞白血病(CML)在通过阻断酪氨酸激酶起作用的药物治疗后症状缓解，或通过阻断TGFβR-I通路的药物治疗后症状缓解。

[0025] 所述的断酪氨酸激酶起作用的药物优选为依马替尼、达沙替尼和伯舒替尼中的至少一种。

[0026] 所述的阻断TGFβR-I通路起作用的药物优选为LY364947。

[0027] 所述的筛选优选为通过如下步骤实现：

[0028] (1)以相同浓度的备选药物处理受精后第一天至两天的所述转基因斑马鱼的胚胎和野生型同胞鱼胚胎：

[0029] (2)在处理后第二至五天观察胚胎尾部造血组织(CHT)区域的血液表型，以确定所述备选药物对所述慢性粒细胞白血病(CML)的治疗效果。

[0030] 所述的血液表型包括苏丹黑B(SB)染色阳性粒细胞计数。

[0031] 一种利用转基因斑马鱼筛选对慢性粒细胞白血病(CML)有效的药物的方法，其中所述转基因斑马鱼为BCR/ABL转基因斑马鱼。

[0032] 所述的慢性粒细胞白血病是由BCR/ABL融合基因的表达引起。

[0033] 所述的慢性粒细胞白血病(CML)在通过阻断酪氨酸激酶起作用的药物治疗后症状缓解，或通过阻断TGFβR-I通路的药物治疗后症状缓解。

[0034] 所述的断酪氨酸激酶起作用的药物优选为依马替尼、达沙替尼和伯舒替尼中的至少一种。

[0035] 所述的阻断TGFβR-I通路起作用的药物优选为LY364947。

[0036] 本发明的总体构思为：

[0037] (1)胚胎时期，利用标记不同阶段髓系细胞的基因探针进行整体原位杂交(WISH)实验来检测详细的髓系造血改变，用lcp标记早期髓系细胞；mpo，lyz标记成熟的中性粒细胞；mfap4来标记成熟的巨噬细胞。阐述BCR-ABL诱导的慢性粒细胞白血病斑马鱼中特异性髓系祖细胞分化以及随后中性粒细胞和巨噬细胞命运选择中的作用。

[0038] (2)在成鱼时期，我们将BCR-ABL诱导的慢性粒细胞白血病斑马鱼的肾脏、血液循环系统中髓系细胞的数量、亚型、分化阶段的情况会用流式细胞仪(FACS)和细胞学方法分析(3月，1年)，观察白血病的特征是否会在这些鱼中出现。

[0039] (3)根据模型的骨髓血象中髓系细胞成熟程度和自然病程与临床进行详细比对，统计转基因斑马鱼分别发展为AML的比率。

[0040] (4)已知白血病治疗药物对白血病模型的药理学验证：将BCR-ABL诱导的慢性粒细胞白血病斑马鱼与野生型斑马鱼AB杂交，每条母鱼产卵200～300个。绿色荧光挑出BCR-ABL过表达受精卵。将BCR-ABL过表达受精卵放入96孔板或384孔板，每孔放3～5个。

[0041] (5)已有临床的药物或选取具有潜在生物学活性化合物的小分子库(主要为临床上已有的CML药物)。将所选的不同的小分子加入到含有鱼卵和水的孔中，每孔只加一种药物。孵育一段时间后，通过SB染色等方法大规模分析，找到可以改变BCR-ABL过表达鱼卵造血发育表型的化合物。

[0042] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

[0043] (1)由于小鼠与人的同源性较高(BCR的蛋白同源性为93.8％，ABL的蛋白同源性为87.8％)，所以很多人源性的质粒和模型都是在小鼠的基础上建立的。而斑马鱼和人的BCR/ABL的蛋白同源性与小鼠相比来说相对较低，分别为73.8％/69.5％。但是在关键结构域上的同源性仍然比较高。迄今为止，慢性粒细胞白血病斑马鱼模型也没有报道过，本发明将人源性的BCR/ABL mRNA显微注射到斑马鱼胚胎中时，发现其胚胎出现类似CML的表型：中性粒细胞大量增加，这就提示人源性的BCR/ABL蛋白可以在斑马鱼的体内发挥作用。

[0044] (2)斑马鱼是进行药物研发的理想模式动物。斑马鱼相比于小鼠更适合做大规模的药物筛选，具有成本低、高效等优势。斑马鱼用于药物筛选可以实现以下优点：高通量，斑马鱼产卵数量多，且受精后的1天开始加药，2-5天后检测，在此期间卵黄可担供胚胎营养而不用喂食，使得可以用96孔板或384孔板进行药物筛选。低费用，斑马鱼饲养和消耗的费用远远低于小鼠，平均每天每只消费约为小鼠的1/100。给药方便：可直接将化合物溶于水中，扩散至胚胎，所需化合物的量公为小鼠的1/100-1/1000。本发明是首次在斑马鱼体内过表达人源性BCR-ABL，继而引起髓系造血异常的表型；且本发明中首次发现了转基因斑马鱼在幼年和成年时期出现类似人白血病的表型，并证明了可以利用其对治疗白血病的药物进行高通量筛选。

[0045] (3)本发明通过构建过表达BCR-ABL斑马鱼，发现具有以下表型：①早期髓系祖细胞分化异常，粒细胞明显增生；②成鱼肾脏血中粒细胞增多；③1年龄斑马鱼中部分出现白血病细胞全身浸润，其中部分可进展为急性髓系白血病(AML)；④人类的化疗药物伊马替尼等CML药物可以明显改善这种异常的血象改变，利用骨髓移植实验，确定该斑马鱼疾病模型与人类疾病的治疗效果相似。

[0046] (4)本发明中Tg(hsp70:p210BCR/ABL)转基因斑马鱼除了胚胎期出现症状外，成年的斑马鱼肾骨髓(相当于人类骨髓)里也出现慢性粒细胞白血病症状，甚至是出现了类似急性粒细胞白血病症状，这意味着我们获得了一个可研究从慢性期转变为急性期的慢性粒细胞白血病模型，这在小鼠及细胞模型是无法做到的。

[0047] (5)本发明将人源性的BCR/ABL cDNA基因序列与热启动蛋白的hsp70启动子连接，使得人们可以在不同温度和时间下控制BCR/ABL的表达量，模拟不同病人中不同程度的BCR/ABL表达量的病例，另外，还可以以此来研究在疾病的不同时期，不同的BCR/ABL的变化BCR/ABL对疾病进程的影响作用。此外，本发明借助Tol2转座子系统将hsp70:p210 整合至斑马鱼基因组，构建能够稳定遗传并表达p210BCR/ABL的Tg(hsp70:p210BCR/ABL)转基因斑马鱼。而在已有的表达人源性BCR/ABL的小鼠中尚没有可以进行不同的剂量控制的模型，无法更好的模拟临床病人的异质性，并选择最优方案进行药物筛选。

附图说明

[0048] 图1是本发明中转基因载体pTol2hsp70:BCR/ABL上各元件的排列结构图；其中，“Tol2”为转座子识别序列，“hsp70promotor”为热休克基因hsp70的启动子序列，“BCR”为从慢性粒细胞白血病病人血样获得的BCR/ABL融合基因中BCR基因部分序列，“ABL”为从慢性粒细胞白血病病人血样获得的BCR/ABL融合基因中ABL基因部分序列，“pA”为翻译终止信号识别序列。

[0049] 图2是野生型斑马鱼(WT)和Tg(hsp70:P210BCR/ABL转基因斑马鱼胚胎中BCR/ABL mRNA表达水平检测的结果图(根据基因类型和胚胎培养条件分为四组样本，每组样本各检测了160枚胚胎)；其中，“h”为胚胎有进行热激处理；“28.5”为胚胎持续孵育置于28.5度恒温培养箱(“**”P<0.001；“****”P<0.0001)。

[0050] 图3是利用原位杂交检测Tg(hsp70:p210BCR/ABL)转基因斑马鱼胚胎中BCR/ABL基因表达量结果图(收集不同发育阶段的转基因斑马鱼与野生型斑马鱼胚胎，进行BCR/ABL探针整胚原位杂交实验后的结果)；其中，“h”为胚胎有进行热激处理，“黑色箭头”指示位置为HSCs(造血干细胞)生成部位。

[0051] 图4是Tg(hsp70:p210BCR/ABL)转基因斑马鱼在胚胎造血发育过程中髓系标记物(lcp、lyz、SB和mfap4)异常表达图；其中，图A～D、I～J为lcp、lyz WISH的结果以及对所有阳性信号进行计数统计的结果(图中右下方黑色方框为PBI区域信号放大图，图右上方标记的数字为基因表达增多的斑马鱼胚胎数目比上总的斑马鱼胚胎数目)；图E、F、K为SB染色的结果以及对所有阳性信号进行计数统计的结果(图中右下方黑色方框为PBI区信号放大图，图右方标记的数字为基因表达增多的斑马鱼胚胎比上总的斑马鱼胚胎数目)；图G、H、L为mfap4WISH的结果以及对所有阳性信号进行计数统计的结果(图中右下方黑色方框分别为头部立面图和PBI区域信号放大图，图中右方标记的数字为基因表达增多的斑马鱼胚胎比上总的斑马鱼胚胎数目)；统计方法为t检验，“*”p<0.05；“****”p<0.0001，“h”表示有胚胎进行热激处理。

[0052] 图5是野生型斑马鱼和Tg(hsp70:p210BCR/ABL)转基因斑马鱼成鱼的肾脏血和外周血进行血涂片吉姆萨染色的结果图；其中，图a为WT成鱼外周血涂片吉姆萨染色结果(血细胞组成以红细胞为主，鲜少淋巴细胞、髓系细胞和血小板)；图b为Tg(hsp70:p210BCR/ABL)转基因斑马鱼成鱼外周血涂片吉姆萨染色结果(血液表型主要表现为各个发育阶段的中性粒细胞增多)；图c为WT成鱼肾脏血涂片吉姆萨染色结果(发育不同阶段的各类型细胞皆占一定比例，以红细胞和中性粒细胞居多，淋巴细胞次之，其它类型细胞占据较少比例)；图d为[0053] Tg(hsp70:p210BCR/ABL)转基因斑马鱼成鱼肾脏血涂片吉姆萨染色结果(血液表型主要表现为各个发育阶段的中性粒细胞增多)；图中星号为原始细胞，线装箭头表示髓系前体，三角箭头为不成熟中性粒细胞，闪电箭头为成熟的中性粒细胞。

[0054] 图6是Tg(hsp70:p210BCR/ABL)转基因斑马鱼进展为AML的血液表型；其中，图a为WT成鱼外周血涂片吉姆萨染色结果(血细胞组成以红细胞为主，鲜少淋巴细胞、髓系细胞和血小板)；图b为Tg(hsp70:p210BCR/ABL)转基因斑马鱼成鱼外周血涂片吉姆萨染色结果(血液表型主要表现为原始粒细胞大量增加)；图c为WT成鱼肾脏血涂片吉姆萨染色结果(处于发育不同阶段的各类型细胞皆占一定比例，以红细胞和中性粒细胞居多，淋巴细胞次之，其它类BCR/ABL型细胞占据较少比例)；图d为Tg(hsp70:p210 )转基因斑马鱼成鱼肾脏血涂片吉姆萨染色结果(血液表型主要表现为原始粒细胞大量增加)；图中线装箭头表示原始中性粒细胞。

[0055] 图7是Tg(hsp70:p210BCR/ABL)转基因斑马鱼胚胎对TKIs的反应结果图；其中，图A为安慰剂组Tg(hsp70:p210BCR/ABL)转基因斑马鱼胚胎5dpf lcp WISH(整体原位杂交)结果；图B～D为TKIs处理Tg(hsp70:p210BCR/ABL)转基因斑马鱼胚胎，5dpf lcp WISH结果；图中右侧标记的数字为lcp+细胞减少的Tg(hsp70:p210BCR/ABL)转基因斑马鱼胚胎比上总的Tg(hsp70:p210BCR/ABL)转基因斑马鱼胚胎数目，右下角黑色方框为PBI区域放大图；图中“h”表示有进行热激实验处理。

[0056] 图8是Tg(hsp70:p210BCR/ABL)转基因斑马鱼胚胎对TGFβR-I通路抑制剂的反应结果BCR/ABL图；其中，图A、B为安慰剂组野生型wt斑马鱼(A)和Tg(hsp70:p210 )转基因斑马鱼胚胎(B)5dpf lcp WISH结果；图C、D为TGFβR-I通路抑制剂LY364947处理野生型wt斑马鱼(C)和Tg(hsp70:p210BCR/ABL)转基因斑马鱼胚胎(D)5dpf lcp WISH结果；图E为统计A～D中lcp阳性中性粒细胞星号数(“*”p<0.05)。

具体实施方式

[0057] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中所使用的各原料，除特别指出的以外，均可由市售获得。

[0058] 本发明中所使用的术语“hpf”指受精后的小时数。本文所使用的术语“dpf”指受精后的天数。举例来说，3hpf指受精后的3小时，8dpf指受精后的8天。

[0059] 本发明中所使用的术语“野生型”或者“WT”都是指野生型斑马鱼。

[0060] 本发明中所使用的术语“同胞鱼(sibling)”是指由同一双亲的后代个体。

[0061] 实施例1

[0062] 1、材料和方法：

[0063] (1)斑马鱼养殖

[0064] 斑马鱼的养殖如文献(Westerfield M:The zebrafish:guide for the laboratory use of zebrafish(Brachdanio rerio).Edition by Eugene,OR,M.Westerfield，1993)所述。本发明中用到下面的品系：AB野生型斑马鱼、BCR-ABL转基因斑马鱼。

[0065] (2)转基因斑马鱼建立

[0066] 本申请采用转座子介导的转基因技术构建转基因斑马鱼系。研究中BCR/ABL融合基因序列是通过限制性内切酶EcoRI从质粒载体NGFR P210切出获得。其中，NGFR P210(Addgene，plasmid#27486)质粒载体是通过委托Addgene中国区独家代理公司北京中原合聚经贸有限公司向美国Addgene公司购买获得(合同编号：QC13120106)。我们扩增后的NGFR P210质粒载体送英潍捷基(InvitrogenTM|Thermo Fisher Scientific)公司进行DNA碱基测序，选择与临床上慢性粒细胞白血病病人血样中获得的BCR/ABL融合基因序列完全一致的质粒载体进行后续实验。

[0067] 首先通过酶切链接体系将BCR/ABL融合基因连入带有Tol2转座子识别位点的T2AL200R150G质粒(T2AL200R150G质粒已在日本Koichi Kawakami实验室发表的文章中公开：Functional Dissection of the Tol2Transposable Eleme nt Identified the Minimal cis-Sequence and a Highly Repetitive Sequence in th e Subterminal Region Essential for Transposition.)，从而得到pTol2BCR/ABL质粒载体。接着为了获得稳定遗传且条件性表达BCR/ABL融合蛋白的转基因斑马鱼系，我们选择只有在38.5℃温度条件下才会有高表达的hsp70基因的启动子，hsp70基因的启动子通过提取野生型斑马鱼基因组并克隆其序列，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。启动BCR/ABL融合蛋白在斑马鱼体内表达。针对hsp70启动子序列分别设计带有限制性内切酶ClaⅠ识别位点的前引物序列(C laⅠ-hsp70-FP：5’-CCATCGATTCAGGGGTGTCGCTTGGT-3’)和带有限制性内切酶EcoRⅤ和AgeⅠ识 别位点的 后引 物序列 (Eco RⅤ- AgeⅠ- hsp 70-R P ：5’- C CGATATCACCGGTCTGCAGGAAAAAAAAAC-3’)扩增hsp70启动子序列。

[0068] 通过酶切链接体系将hsp70启动子序列插入到上述pTol2BCR/ABL质粒载体中，结果如图1所示，得到pTol2hsp70:BCR/ABL质粒载体。最后通过Tol2转座酶mRNA(是从pCS2-Tol2转座酶载体通过mMESSAGE mMACHINE系统体外转录的Tol2转座酶mRNA，核苷酸序列如SEQ ID No：2所示)和pTol2hsp70:BCR/ABL质粒载体一起显微注射的方法(两者的用量可以根据实际需要调整，如每个斑马鱼胚胎注射50pg Tol2转座酶mRNA+50pg pTol2hsp70:BCR/ABL质粒载体)，在斑马鱼胚胎发育的1细胞时期导入斑马鱼胚胎中，在转座酶的作用下，将转基因载体上两个Tol2识别位点序列之间的基因DNA片段整合至斑马鱼的基因组上，得到Tg(hsp70:P210BCR/ABL)转基因斑马鱼，即BCR/AB L转基因斑马鱼。

[0069] (3)实时荧光定量PCR检测BCR/ABL的表达

[0070] 首先我们利用荧光定量PCR检测BCR/ABL在转基因鱼中的表达：第一、二组样品分别为野生型AB品系斑马鱼或Tg(hsp70:P210BCR/ABL)转基因斑马鱼胚胎，持续置于28.5度恒温培养箱中孵育3d；第三、四组样品分别为野生型AB品系斑马鱼或Tg(hsp70:P210BCR/ABL)转基因斑马鱼胚胎在受精后24h、36h、48h、60h和72h进行热激处理。之后利用RNAeasy Kit(Qiagen,Maryland,USA；74004)提取野生型和转基因鱼的总RNA，继而利用反转录试剂盒(Promega,Madison,USA,M1701)合成cDNA。实时荧光定量PCR利用SYBR Green Real-time PC R Master Mix(Applied Biosystems,Austin,USA；4472908)染料在LightCycler N ano SW1.0机器上进行BCR/ABL  mRNA表达量检测(bcr-qPCR-FP：5’-GGCT CTATGGGTTTCTGAATGTC-3’；abl-qPCR-RP：5’-TTTCCTTGGAGTTCCAACG AG-3’)。

[0071] 结果如图2所示：Tg(hsp70:P210BCR/ABL)转基因斑马鱼的后代中的BCR/ABL mRNA表达量与对照组野生型斑马鱼的后代相比较，增高了上千倍。进行热激处理的转基因后代中的BCR/ABL mRNA表达量与28.5度恒温培养箱持续孵育的转基因后代相比较，也是显著性增高的。进一步说明我们所建立的转基因模型中BCR/ABL的表达受hsp70的启动调控，在38.5度条件下可高表达。这样的转基因模型有助于我们研究BCR/ABL表达量与疾病的关系。为了避免BCR/ABL在斑马鱼胚胎期表达量过高而影响其正常生长发育或导致其无法存活至成年，我们可以将转基因鱼持续低温饲养，然后根据研究需要选择时间进行热激处理诱导BCR/ABL的表达，条件可控。

[0072] (4)原位杂交检测BCR/ABL的表达

[0073] 我们参考NCBI及ENSEMBLE数据库中人类及斑马鱼的BCR和ABL基因核酸序列，设计了人类特异的BCR/ABL探针，核苷酸序列如SEQ ID No：3所示。并用BCR/ABL探针进行斑马鱼胚胎整体原位杂交实验检测转基因斑马鱼胚胎体内BCR/ABL mRNA的时空表达。待Tg(hsp70:P210BCR/ABL)胚胎发育至24hpf，进行幼鱼热激实验，分别选择24hpf、32hpf、50hpf、80hpf、110hpf、140hpf进行热激，收集36hpf、3dpf(85hpf)和5dpf(145hpf)胚胎，用BCR/ABL探针进行整胚原位杂交实验(以野生型AB品系斑马鱼为对照)。

[0074] 结果如图3所示：Tg(hsp70:p210BCR/ABL)转基因斑马鱼胚胎中各个时间点皆能检测到BCR/ABL mRNA的表达，表达模式为所有组织广泛表达；而对照组野生型AB品系斑马鱼胚胎中则完全检测不到BCR/ABL mRNA的表达。

[0075] (5)整体原位杂交

[0076] 收集3dpf(约78hpf)大小的Tg(hsp70:p210BCR/ABL)转基因斑马鱼胚胎，选用髓系细胞特异标记基因(l-plastin、lyz、mpx)探针(探针请提供可以购买得到的商业来源)进行整BCR/ABL胚原位杂交实验和苏丹黑B(SB)染色实验，检测在斑马鱼体内瞬时表达p210 ，对胚胎造血过程中髓系细胞发育的影响。“l-plastin”标记所有髓系细胞类群，包括中性粒细胞和巨噬细胞。“mpx、lyz”标记发育相对成熟的晚幼粒细胞细胞和成熟的中性粒细胞。“SB”标记中幼粒、晚幼粒、成熟的中性粒细胞。

[0077] 结果如图4所示，在斑马鱼体内表达p210BCR/ABL，l-plastin、mpx、lyz、SB标记的这些髓系细胞数目显著增多。我们知道，临床上CML慢性期病人的主要血液学表型就是粒系增生。而在斑马鱼体内瞬时表达p210BCR/ABL也会引起粒细胞的增多，说明人源性的p210BCR/ABL在斑马鱼体内表达也能发挥在人体中相似的生物学功能。

[0078] (6)细胞学分析

[0079] 为了避免p210BCR/ABL高表达导致Tg(hsp70:p210BCR/ABL)转基因斑马鱼胚胎致死而不能正常发育至成体，我们将Tg(hsp70:p210BCR/ABL)转基因斑马鱼饲养在28.5℃循环养殖系统，待其发育至8个月大小再进行热激诱导p210BCR/ABL高表达，连续热激处理1个月，随后继续正常饲养至1年大小。随后，我们对100条Tg(hsp70:p210BCR/ABL)转基因斑马鱼和同批处理的55条野生型斑马鱼进行解剖，收集肾脏血和外周血进行血涂片吉姆萨染色，观察并计数肾脏血和外周血中不同种类及发育不同程度的血细胞组成。造血细胞的分离如下：斑马鱼用三卡因麻醉，外周血(PB)通过用肝素化过的微量血细胞吸管从鳃中获取。肾脏血(KM)细胞从肾脏中分离。分离出的PB和KM用含5％的FBS重悬，接着将重悬的细胞400转3分钟离心至玻片上。最后用姬姆萨(Merck,Germany；1.09204.0500)固定5分钟后水洗，再用瑞士姬(Merck:1.01424.0500)染色40分钟后水洗观察。根据细胞形态对PB和KM细胞进行计数。

[0080] 结果如图5，以及表1和2所示：100条鱼中有76条表现为外周血或骨髓血中的髓系或髓系前体细胞增多。并且根据其程度可分为Ⅰ-Ⅵ类，与人的CML血象类似。并且如图6所示：与人的CML急变进程类似，其中100例转基因斑马鱼中有1例发展为AML急变期，变现为外周血及骨髓血中，出现大量祖细胞。

[0081] 表1.Tg(hsp70:p210BCR/ABL)斑马鱼血液表型分类(外周血)

[0082]

[0083] 表2.Tg(hsp70:p210BCR/ABL)斑马鱼血液表型分类(骨髓血)

[0084]

[0085] 实施例2

[0086] CML可以在通过阻断酪氨酸激酶起作用的药物治疗后症状缓解，通过阻断酪氨酸激酶起作用的药物可以为依马替尼(Imatinib)、达沙替尼(Dasatinib)或伯舒替尼(Bosutinib)；CML还可以通过阻断TGFβR-I通路的药物(如LY364947)治疗后症状缓解，具体实验步骤如下：

[0087] (1)酪氨酸激酶抑制剂处理实验

[0088] a.实验组为Tg(hsp70:p210BCR/ABL)转基因斑马鱼胚胎39.5度热激后加DMSO(二甲基亚砜，安慰剂组)处理。对照组为同样条件下BCR/ABL转基因斑马鱼胚胎39.5度热激后加酪氨酸激酶抑制剂药物处理。

[0089] b.热激处理：收集胚胎，分别在受精后10小时热激处理30min，22hpf、34hpf、46hpf、58hpf和70hpf热激处理2h，随后转至28.5℃孵箱正常孵育。

[0090] c.以5～100uM浓度的药物(依马替尼：100uM；达沙替尼：10uM；伯舒替尼：5uM)或DMSO对Tg(hsp70:p210BCR/ABL)转基因斑马鱼胚胎进行连续浸泡48小时处理。

[0091] d.对处理后5dpf后的Tg(hsp70:p210BCR/ABL)转基因斑马鱼胚胎进行lcp原位杂交实验，观察胚胎尾部造血组织区域的中性粒细胞表型，以确定所述备选药物对所述CML的治疗效果。血液表型还可以包括lcp基因原位杂交后阳性细胞计数并统计。lcp阳性粒细胞数目的减少视为药物治疗后症状缓解。

[0092] 结果如图7所示：相对安慰剂组，在加入酪氨酸激酶抑制剂(依马替尼、达沙替尼或伯舒替尼)皆明显减少了lcp阳性粒细胞数目，缓解了CML中粒细胞增多的症状。提示我们与临床药效一致，酪氨酸激酶抑制剂不仅可以缓解临床CML的症状，也同样可以缓解Tg(hsp70:p210BCR/ABL)转基因斑马鱼粒细胞异常增多的CML表型。这个转基因斑马鱼为治疗CML的新药筛选提供了一个有价值的平台。

[0093] (2)TGFβR-I通路抑制剂处理实验

[0094] a.实验组为Tg(hsp70:p210BCR/ABL)转基因斑马鱼胚胎39.5度热激处理组。对照组为同样条件下野生型WT斑马鱼胚胎39.5度热激处理组。

[0095] b.热激处理：收集胚胎，分别在受精后10小时热激处理30min，22hpf、34hpf、46hpf、58hpf和70hpf热激处理2h，随后转至28.5℃孵箱正常孵育。

[0096] c.以5uM浓度的LY364947药物或DMSO对Tg(hsp70:p210BCR/ABL)转基因斑马鱼或野生型胚胎进行连续浸泡48小时处理。

[0097] d.对处理后5dpf后的Tg(hsp70:p210BCR/ABL)转基因斑马鱼胚胎进行lcp原位杂交实验，观察胚胎尾部造血组织区域的中性粒细胞表型，以确定所述备选药物对所述CML的治疗效果。血液表型还可以包括lcp基因原位杂交后阳性细胞计数并统计。lcp阳性粒细胞数目的减少视为药物治疗后症状缓解。

[0098] 结果如图8所示：相对于安慰剂组(DMSO)，在加入TGFβR-I通路抑制剂(LY364947)明显减少了Tg(hsp70:p210BCR/ABL)转基因斑马鱼胚胎中lcp阳性粒细胞数目，缓解了CML中粒细胞增多的症状。而野生型斑马鱼组则没有明显改变。TGFβR-I通路是BCR/ABL致病的关键通路之一，目前临床尚无相关通路的药物发现，这提示我们可以利用Tg(hsp70:p210BCR/ABL)转基因斑马鱼筛选新的CML药物。

[0099] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。