本发明公开一种基于肽传感器的玉米赤霉烯酮的无毒光电化学竞争免疫分析方法。该传感界面的构筑方法是以碳纳米角、巯基乙胺功能化的金锥以及聚甘氨酸作为基底，并进而固定化玉米赤霉烯酮抗体(Ab)；以酪胺功能化的纳米金红石型TiO2介观晶体用于固定化特定序列的肽链作为光电探针；由于肽链(peptide)具有模拟玉米赤霉烯酮的作用，玉米赤霉烯酮可与标记的光电探针竞争结合传感界面上固定化的玉米赤霉烯酮抗体。结合到传感界面上的光电探针在辣根过氧化物酶的催化下，能进一步结合酪胺‑金红石型TiO2介观晶体复合物，进一步放大光电信号。基于该现象可建立起对于玉米赤霉烯酮的无毒光电分析方法。
1.一种基于肽传感器的玉米赤霉烯酮的无毒光电化学竞争免疫分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）玻碳电极（GCE）的预处理：GCE首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；
（2）Poly(Gly)/ MEA/Au NCs/CNHs/Ab修饰电极的制备：滴加3μL浓度为3mg/ml 的碳纳米角(CNHs)悬浮液于干净的玻碳电极表面，红外灯下烘干，冷却至室温，将巯基乙胺(MEA)溶液与金锥(Au NCs)溶液反应，得到MEA/Au NCs复合溶液，然后将4μL 的MEA/Au NCs复合溶液滴涂到修饰过的电极表面，在烘箱里烘干冷却至室温；将修饰好的电极浸泡在含有1mM甘氨酸的pH为7.0的PBS缓冲溶液中，在电位窗口为-0.5 1.8V范围内，以扫速为0.1V/s进行~扫描，得到Poly(Gly)/MEA/Au NCs/CNHs 修饰电极；最终，将所获得的修饰电极浸泡于1 mg/mL 的玉米赤霉烯酮抗体溶液，在4°C下孵育50 min，随后使用pH7.0的磷酸缓冲溶液去除多余的玉米赤霉烯酮抗体Ab，再将电极浸入浓度为1.0 wt.%的BSA 1 h，封闭电极表面上非特异性活性位点，冲去表面残余液后，即得到Poly(Gly)/MEA/Au NCs/CNHs/Ab修饰电极；
（3）Poly(Gly)/MEA/Au NCs/CNHs/Ab/peptide@ta-RMC修饰电极的制备：3 mg/mL的金红石型TiO2介观晶体（RMC）悬浮液与5mg/mL的酪胺溶液按照1:2的体积比混合吸附30min，离心，用二次水洗涤，去除未吸附的酪胺，将得到的固体用二次水分散，得到RMC-酪胺复合物(RMC-ta)溶液；利用酪胺上的羟基与肽链上的羧基反应，将能模拟玉米赤霉烯酮的肽链(peptide)与RMC-ta复合物连接，形成标记的肽链peptide@ta-RMC；将Poly(Gly)/MEA/Au NCs/CNHs/Ab修饰电极浸入不同浓度的玉米赤霉烯酮（ZEN）标准溶液与标记过的能模拟玉米赤霉烯酮的肽链(peptide@ta-RMC)的混合溶液中于4°C下孵育30min，利用竞争反应结合固定在电极表面的抗体；用pH7.0的磷酸缓冲溶液冲洗电极表面并在室温条件下自然晾干，得到Poly(Gly)/MEA/Au NCs/CNHs/Ab/peptide@ta-RMC修饰电极；
（4）玉米赤霉烯酮的检测：采用三电极体系进行测定，以Poly(Gly)/MEA/Au NCs/CNHs/Ab/peptide@ta-RMC修饰电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，利用光电化学工作站进行检测，设置电压为0.2V，每隔10s进行开关灯，氙灯发射的单色光激发光源使用前由单色仪过滤；在pH 7.0的 PBS缓冲溶液中，通过光电化学工作站进行检测1×
10-6 ng/mL–1 ng/mL之间的一系列不同浓度的玉米赤霉烯酮标准溶液，通过记录开关灯前后产生的不同电流信号，绘制工作曲线；待测样品溶液代替玉米赤霉烯酮标准溶液进行检测，检测的结果通过工作曲线查得。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的金红石型TiO2介观晶体（RMC）材料由下述方法制备的：0.5 g十二烷基苯磺酸钠（SDBS）溶解在25 mL 2.2 mol/mL HNO3溶液中，搅拌15分钟；然后加入0.5mL异丙醇钛（IV），在80°C下搅拌48 h；随后，所得产物经离心、用超纯水、乙醇洗涤4-5次后，在60°C下干燥过夜；上述产物在400 °C 空气中煅烧1h以去除残留的有机物，制得金红石型TiO2介观晶体（RMC）。
3.一种基于肽传感器的玉米赤霉烯酮的无毒光电化学竞争免疫传感器，包括工作电极、铂丝电极为对电极和Ag/ AgCl为参比电极，其特征在于，所述的工作电极采用Poly(Gly)/MEA/Au NCs /CNHs/Ab/peptide@ta-RMC修饰电极，所述的Poly(Gly)/MEA/Au NCs /CNHs/Ab/peptide@ta-RMC修饰电极由下述方法制备而成的：1）玻碳电极的抛光：玻碳电极首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；2）Poly(Gly)/MEA/Au NCs/CNHs/Ab/peptide@ta-RMC修饰电极的制备：滴加3μL浓度为3mg/ml 的碳纳米角(CNHs)悬浮液于干净的玻碳电极表面，红外灯下烘干，冷却至室温，巯基乙胺(MEA)溶液与金锥(Au NCs)溶液反应，得到MEA/Au NCs复合溶液，然后将4μL 的MEA/Au NCs溶液滴涂到修饰过的电极表面，在烘箱里烘干冷却至室温；将修饰好的电极浸泡在含有1mM甘氨酸的pH为7.0的PBS缓冲溶液中，在电位窗口为-0.5 1.8V范围内，以扫速为0.1V/s进行扫描，即得到Poly~(Gly)/MEA/Au NCs/CNHs 修饰电极；最终，将所获得的修饰电极浸泡于1 mg/mL 的玉米赤霉烯酮抗体溶液，在4°C下孵育50 min，随后使用pH7.0的磷酸缓冲溶液去除多余的玉米赤霉烯酮抗体Ab，再将电极浸入浓度为1.0 wt.%的BSA 1 h，封闭电极表面上非特异性活性位点，冲去表面残余液后，即得到Poly(Gly)/MEA/Au NCs/CNHs/Ab修饰电极；3 mg/mL的金红石型TiO2介观晶体（RMC）悬浮液与5mg/mL的酪胺溶液按照1:2的体积比混合吸附30min，离心，用二次水洗涤，去除未吸附的酪胺，将得到的固体用二次水分散，得到RMC-酪胺复合物(RMC-ta)溶液；利用酪胺上的羟基与肽链上的羧基反应，将能模拟玉米赤霉烯酮的肽链(peptide)与RMC-ta复合物连接，形成标记的肽链peptide@ta-RMC，将Poly(Gly)/MEA/Au NCs/CNHs/Ab修饰电极浸入不同浓度的玉米赤霉烯酮（ZEN）标准溶液与标记过的能模拟玉米赤霉烯酮的肽链(peptide@ta-RMC)的混合溶液中于4°C下孵育30min，利用竞争反应结合固定在电极表面的抗体；用pH7.0的磷酸缓冲溶液冲洗电极表面并在室温条件下自然晾干，得到Poly(Gly)/MEA/Au NCs/CNHs/Ab/peptide@ta-RMC修饰电极。
4.权利要求3所述的一种基于肽传感器的玉米赤霉烯酮的无毒光电化学竞争免疫传感器用于玉米赤霉烯酮的检测方法，其特征在于，步骤如下：1）采用三电极体系进行测定，以Poly(Gly)/MEA/Au NCs/CNHs/Ab/peptide@ta-RMC修饰电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，利用光电化学工作站进行检测，设置电压为0.2V，每隔10s进行开关灯，氙灯发射的单色光激发光源使用前由单色仪过滤；2）在pH7.0的 PBS缓冲溶液中，通过光电化学工作站进行检测1×10-6 ng/mL–1 ng/mL之间的一系列不同溶度的玉米赤霉烯酮标准溶液，通过记录开关灯前后产生的不同电流信号，绘制工作曲线；待测样品溶液代替玉米赤霉烯酮标准溶液进行检测，检测的结果可通过工作曲线查得；将反应后的电极与HRP-酪胺溶液继续反应，通过测量电阻，记录阻抗值的变化，同样可以检测玉米赤霉烯酮浓度的变化。
一种基于肽传感器的玉米赤霉烯酮的无毒光电化学竞争免疫
分析方法
技术领域
[0001] 本发明属于新型功能材料与生物传感检测技术领域，具体涉及一种基于肽传感器的玉米赤霉烯酮的无毒光电化学竞争免疫分析方法。
背景技术
[0002] 光电化学（PEC）检测，是以光作为激发信号，以光电流作为检测信号，通过采用不同形式的能量作为激发信号和检测信号，使激发和检测信号互不干扰，因而背景信号较低，可获得较高的灵敏度。在光电化学传感器的构建过程中，光敏材料的选择对于信号的响应至关重要，目前所用的材料中，TiO2纳米材料因其独特的光催化活性、无毒性，优异的化学和物理稳定性，使其成为光催化和光电化学传感器的理想材料。TiO2介观晶体是晶体亚单元有序排列构成的，相比于传统的TiO2单晶，TiO2介观晶体具有更加优良的太阳能转换和催化性能，能显著提高PEC性能。然而，TiO2禁带宽度较大，只能被紫外光激发，因此在可见光区光电转换效率较低。酪胺作为一种易发生氧化的物质，通过自身氧化使电子转移到TiO2表面，与光生空穴反应，可促进电子的传递，降低电子-空穴对的复合，提高光电流。
[0003] 真菌毒素是各种真菌物种的二次代谢产物，被真菌毒素污染的农作物，对人体健康和经济带来很大问题。玉米赤霉烯酮(Zearalenone)，又称F-2毒素，是分布最广的真菌毒素之一，它主要来源于玉米赤霉菌的代谢产物。玉米赤霉烯酮是一种耐高温的真菌，其广泛分布于受污染的谷物及农副产品、奶制品中，尤其是玉米及其加工制品中。玉米赤霉烯酮具有生殖发育毒性、免疫毒性及强烈的致畸毒性等，也可对内分泌造成影响，并且可能诱发肿瘤。因此发展一种玉米赤霉烯酮的无毒灵敏检测方法已成为科研工作者们研究的方向。免疫检测分析方法具有良好的灵敏性和特异性，常用于快速定量检测毒素。该方法的核心主要是抗体以及对应的抗原，通过特异性识别位点与检测物质结合。在玉米赤霉烯酮的传统检测方法中，抗原主要是玉米赤霉烯酮的标准溶液，这种抗原由于其毒性会对人体产生危害。目前已有研究者发现肽链可作为新的抗原代替传统抗原，与传统的玉米赤霉烯酮抗原相比，肽链具有无毒性，且易与其他过氧化物酶或蛋白质结合。已有实验组成功合成了能模拟玉米赤霉烯酮的肽链，将标记的肽链与玉米赤霉烯酮标准溶液竞争结合固定在电极表面的抗体，通过信号的变化，实现对玉米赤霉烯酮的灵敏检测。
[0004] 在本实验中，碳纳米角作为基底材料固定在玻碳电极表面利用其良好的导电性，可使光生电子更好的传递到电极表面，金锥的引入同样使电子更快传递，减少电子-空穴的复合，通过在修饰电极表面聚合甘氨酸，增大了比表面积，可固定更多的抗体。本发明通过一种引入一种能模拟玉米赤霉烯酮的肽链(peptide)，将标记的肽链与不同浓度的玉米赤霉烯酮标准溶液竞争结合固定的抗体，由于TiO2-ta的光电效应，光电流明显增强，光电流信号与玉米赤霉烯酮浓度在一定范围内呈线性。将反应后的电极与HRP-酪胺混合溶液孵育，测量阻抗，阻抗值与玉米赤霉烯酮的浓度在一定范围内呈线性，通过光电流和阻抗值，可实现玉米赤霉烯酮的高灵敏检测，该传感器的成功构建，为玉米赤霉烯酮的无毒检测提供了平台。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种基于肽传感器的玉米赤霉烯酮的无毒光电化学竞争免疫分析方法。
[0006] 为实现发明目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] （1）GCE的预处理：GCE首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；
[0008] （2）Poly(Gly)/ MEA/Au NCs/CNHs/Ab修饰电极的制备：滴加3μL浓度为3mg/ml 的碳纳米角(CNHs)悬浮液于干净的玻碳电极表面，红外灯下烘干，冷却至室温，巯基乙胺(MEA)溶液与金锥(Au NCs)溶液反应，得到MEA/Au NCs复合溶液，然后将4μL 的MEA/Au NCs溶液滴涂到修饰过的电极表面，在烘箱里烘干冷却至室温；将修饰好的电极浸泡在含有1mM甘氨酸的pH为7.0的PBS缓冲溶液中，在电位窗口为-0.5 1.8V范围内，以扫速为0.1V/s进行~扫描,即得到Poly(Gly)/MEA/Au NCs/CNHs修饰电极；最终，将所获得的修饰电极浸泡于1 mg/mL 的玉米赤霉烯酮抗体溶液，在4°C下孵育50 min，随后使用pH7.0的磷酸缓冲溶液去除多余的玉米赤霉烯酮抗体Ab，再将电极浸入浓度为1.0 wt.%的BSA 1 h，封闭电极表面上非特异性活性位点，冲去表面残余液后，即得到Poly(Gly)/MEA/Au NCs/CNHs/Ab修饰电极；
[0009] （3）Poly(Gly)/MEA/Au NCs/CNHs/Ab/peptide@ta-RMC修饰电极的制备：3 mg/mL的金红石型TiO2介观晶体（RMC）悬浮液与5mg/mL的酪胺溶液按照1:2的体积比混合吸附30min，离心，用二次水洗涤，去除未吸附的酪胺，将得到的固体用二次水分散，得到RMC-酪胺复合物(RMC-ta)溶液。利用酪胺上的羟基与肽链上的羧基反应，将能模拟玉米赤霉烯酮的肽链(peptide)与RMC-ta复合物连接，形成标记的肽链peptide@ta-RMC。将Poly(Gly)/MEA/Au NCs/CNHs/Ab修饰电极浸入不同浓度的玉米赤霉烯酮（ZEN）标准溶液与标记过的能模拟玉米赤霉烯酮的肽的混合溶液中于4°C下孵育30min，利用竞争反应结合固定在电极表面的抗体；用pH7.0的磷酸缓冲溶液冲洗电极表面并在室温条件下自然晾干，得到Poly(Gly)/MEA/Au NCs/CNHs/Ab/peptide@ta-RMC修饰电极；
[0010] （4）玉米赤霉烯酮的检测：采用三电极体系进行测定，以Poly(Gly)/MEA/Au NCs/CNHs/Ab/peptide@ta-RMC修饰电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为对电极，利用光电化学工作站进行检测，设置电压为0.1V，每隔10s进行开关灯，氙灯发射的单色光激发光源使用前由单色仪过滤；在pH 6.5的 PBS缓冲溶液中，通过光电化学工作站进行检测1×10-6 ng/mL–1 ng/mL一系列不同浓度的玉米赤霉烯酮标准溶液，通过记录开关灯前后产生的不同电流信号，绘制工作曲线；待测样品溶液代替玉米赤霉烯酮标准溶液进行检测，检测的结果可通过工作曲线查得。
[0011] (5) 上述能模拟玉米赤霉烯酮的肽链(peptide)的氨基酸序列表为Asp-Ala-V al-Ile-Leu-Leu-Met，购买于杭州丹港生物科技有限公司。
[0012] 上述金红石型TiO2介观晶体（RMC）材料的制备：
[0013] 0.5 g十二烷基苯磺酸钠（SDBS）溶解在25 mL 2.2 mol/mL HNO3溶液中，搅拌15分钟。然后加入0.5 mL异丙醇钛（IV），在80°C下搅拌48 h。随后，所得产物经离心、用超纯水、乙醇洗涤4-5次后，在60 °C下干燥过夜。上述产物在400 °C空气中煅烧1h以去除残留的有机物，制得金红石型TiO2介观晶体。
[0014] 上述金锥(Au NCs)的制备：
[0015] 在旋涂聚苯乙烯珠之前，首先将teflon膜切割成正方形(1.5x1.5cm)并用乙醇和二次水冲洗，然后用等离子水清洗3分钟。吸取1mL浓度为2.5 w/v %的聚苯乙烯珠溶液并将其离心，再转移到乙醇和甲醇的体积比为2:1的混合溶液中。在溶液中加入体积比为0.2 %的表面活性剂(TX100)，接着将聚苯乙烯珠的浓度调节至约5 w/v %。 然后将聚苯乙烯珠旋涂在清洁的teflon膜上，并在室温下放置几分钟，使溶剂干燥。用O2等离子体蚀刻聚苯乙烯珠/ teflon表面一定时间。 最后通过热蒸发在该表面涂上50nm的金，得到金锥。
[0016] 本发明所述的一种基于肽传感器的玉米赤霉烯酮的无毒光电化学竞争免疫传感器，包括工作电极、铂丝电极为对电极和Ag/ AgCl为参比电极，其特征在于，所述的工作电极采用Poly(Gly)/MEA/Au NCs/CNHs/Ab/peptide@ta-RMC修饰电极，其由下述步骤的方法制备而成的1）玻碳电极的抛光：玻碳电极首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；2）Poly(Gly)/MEA/Au NCs/CNHs/Ab/peptide@ta-RMC修饰电极的制备：滴加3μL浓度为3mg/ml 的碳纳米角悬浮液于干净的玻碳电极表面，红外灯下烘干，冷却至室温，巯基乙胺(MEA)溶液与金锥(Au NCs)溶液反应，得到MEA/Au NCs复合溶液，然后将4μL 的MEA/Au NCs溶液滴涂到修饰过的电极表面，在烘箱里烘干冷却至室温；将修饰好的电极浸泡在含有1mM甘氨酸的pH为7.0的PBS缓冲溶液中，在电位窗口为-0.5 1.8V范围内，以扫~速为0.1V/s进行扫描,即得到Poly(Gly)/MEA/Au NCs/CNHs修饰电极；最终，将所获得的修饰电极浸泡于1 mg/mL 的玉米赤霉烯酮抗体溶液，在4°C下孵育50 min，随后使用pH7.0的磷酸缓冲溶液去除多余的玉米赤霉烯酮抗体Ab。再将电极浸入浓度为1.0 wt.%的BSA 1 h，封闭电极表面上非特异性活性位点，冲去表面残余液后，即得到Poly(Gly)/MEA/Au NCs/CNHs/Ab修饰电极；3 mg/mL的金红石型TiO2介观晶体（RMC）悬浮液与5mg/mL的酪胺溶液按照1:2的体积比混合吸附30min，离心，用二次水洗涤，去除未吸附的酪胺，将得到的固体用二次水分散，得到RMC-酪胺复合物(RMC-ta)溶液。利用酪胺上的羟基与肽链上的羧基反应，将能模拟玉米赤霉烯酮的肽链(peptide)与RMC-ta复合物连接，形成标记的肽链peptide@ta-RMC。将Poly(Gly)/MEA/Au NCs/CNHs/Ab修饰电极浸入不同浓度的玉米赤霉烯酮（ZEN）标准溶液与标记过的能模拟玉米赤霉烯酮的肽的混合溶液中于4°C下孵育30min，利用竞争反应结合固定在电极表面的抗体；用pH7.0的磷酸缓冲溶液冲洗电极表面并在室温条件下自然晾干，得到Poly(Gly)/MEA/Au NCs/CNHs/Ab/peptide@ta-RMC修饰电极；
[0017] 本发明所述的一种基于TiO2介观晶体的光电化学传感器用于玉米赤霉烯酮的检测方法，其特征在于，步骤如下：1）采用三电极体系进行测定，以Poly(Gly)/MEA/Au NCs/CNHs/Ab/peptide@ta-RMC修饰电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，利用光电化学工作站进行检测，设置电压为0.2V，每隔10s进行开关灯，氙灯发射的单色光激发光源使用前由单色仪过滤；2）在pH7.0的 PBS缓冲溶液中，通过光电化学工作站进行-6检测1×10 ng/mL–1 ng/mL之间的一系列不同溶度的玉米赤霉烯酮标准溶液，通过记录开关灯前后产生的不同电流信号，绘制工作曲线；待测样品溶液代替玉米赤霉烯酮标准溶液进行检测，检测的结果可通过工作曲线查得。将反应后的电极与HRP-酪胺溶液继续反应，通过测量电阻，记录阻抗值的变化，同样可以检测玉米赤霉烯酮浓度的变化。
[0018] 本发明的显著优点为：
[0019] (1)以酪胺敏化的金红石型TiO2介观晶体为标记物标记肽链，金红石型TiO2介观晶体具有较高的孔隙率，酪酸的引入增强了电子的传输速度，与单独的传统TiO2单晶材料相比，有效提高光电转换效率及传感器的灵敏度。将能模拟ZEN的肽链(peptide)引入传感界面，利用竞争反应结合固定在电极表面的抗体，通过光信号的变化，实现对目标物的灵敏检测。
[0020] (2)抗原与抗体特异性结合形成空间位阻效应，制得的传感器实现了对玉米赤霉烯酮的超灵敏检测。
[0021] (3)通过引入能模拟与赤霉烯酮的肽链(peptide)作为抗原与标准溶液进行竞争反应，为玉米赤霉烯酮的无毒检测提供了平台。
附图说明
[0022] 图1为本发明所述的玉米赤霉烯酮的signal-on型光电化学传感器的制备过程示意图。
[0023] 图2 A为不同浓度1×10-6 ng/mL–1 ng/mL（a-g）玉米赤霉烯酮标准溶液，传感电极的光电流响应图。
[0024] 图2 B为传感电极的光电流响应与玉米赤霉烯酮标准溶液浓度的线性关系图。
[0025] 图3A为免疫反应后的电极与HRP-酪胺溶液孵育后的阻抗图。
[0026] 图3B为阻抗值与玉米赤霉烯酮标准溶液浓度的现象关系图。
具体实施方式
[0027] 本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。
[0028] 实施例1
[0029] 一种基于肽传感器的玉米赤霉烯酮的无毒光电化学竞争免疫分析方法(如图1所示)：
[0030] （1）玻碳电极的预处理：玻碳电极首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；
[0031] （2）滴加3μL浓度为3 mg/mL CNHs悬浮液于干净的玻碳电极表面，红外灯下烘干，冷却至室温；
[0032] （3）巯基乙胺(MEA)溶液与金锥(Au NCs)溶液反应，得到MEA/Au NCs复合溶液，再将3μL Au NCs/MEA复合溶液滴涂到修饰好的电极表面，放在烘箱里烘干，再在室温下冷却；
[0033] （4） 将修饰好的电极浸泡在含有1mM甘氨酸的pH为7.0的PBS缓冲溶液中，在电位窗口为-0.5-1.8V范围内，以扫速为0.1V/s进行扫描，即得到Poly(Gly)/MEA/Au NCs/CNHs修饰电极；
[0034] （5）将修饰电极于玉米赤霉烯酮抗体Ab(2 mg/mL)溶液中于4°C下孵育1h，接着用pH 7.0的磷酸缓冲溶液洗去多余的Ab，再将电极浸入浓度为1.0 wt.%的BSA 1 h，封闭电极表面上非特异性活性位点；冲去表面残余液后，用pH为 7.0的磷酸缓冲溶液冲洗电极表面并在室温条件下自然晾干，制得Poly(Gly)/MEA/Au NCs/CNHs/Ab修饰电极；
[0035] （6）Poly(Gly)/MEA/Au NCs/CNHs/Ab/peptide@ta-RMC修饰电极的制备：3 mg/mL的金红石型TiO2介观晶体（RMC）悬浮液与5mg/mL的酪胺溶液按照1:2的体积比混合吸附30min，离心，用二次水洗涤，去除未吸附的酪胺，将得到的固体用二次水分散，得到RMC-酪胺的复合物（RMC-ta）溶液。利用酪胺上的羟基与肽链上的羧基反应，将能模拟玉米赤霉烯酮的肽链(peptide)与RMC-ta复合物连接，形成标记的肽链peptide@ta-RMC。将Poly(Gly)/MEA/Au NCs/CNHs/Ab修饰电极浸入不同浓度的玉米赤霉烯酮（ZEN）标准溶液与标记过的能模拟玉米赤霉烯酮的肽链的混合溶液中于4°C下孵育30min，利用竞争反应结合固定在电极表面的抗体；用pH7.0的磷酸缓冲溶液冲洗电极表面并在室温条件下自然晾干，得到Poly(Gly)/MEA/Au NCs/CNHs/Ab/peptide@ta-RMC修饰电极。
[0036] 实施例2
[0037] 一种基于肽传感器的玉米赤霉烯酮的无毒光电化学竞争免疫分析方法，步骤如下：
[0038] （1）采用三电极体系进行测定，以实施例1制得的Poly(Gly)/MEA/Au NCs/CNHs/Ab/peptide@ta-RMC修饰电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为对电极，利用光电化学工作站进行检测，设置电压为0.1V，每隔10s进行开关灯，氙灯发射的单色光激发光源使用前由单色仪过滤；
[0039] （2）在pH 7.0的 PBS缓冲溶液中，通过光电化学工作站进行检测1×10-6 ng/mL–1 ng/mL一系列不同浓度的玉米赤霉烯酮标准溶液，通过记录开关灯前后产生的不同电流信号，绘制工作曲线。图2 A为不同浓度1×10-6 ng/mL–1 ng/mL（a-g）玉米赤霉烯酮标准溶液，传感电极的光电流响应。图2 B为传感电极的光电流响应与玉米赤霉烯酮标准溶液浓度的线性关系图。
[0040] （3）将待测样品溶液代替玉米赤霉烯酮标准溶液进行检测，检测的结果可通过工作曲线查得。
[0041] 在含有5 mM Fe(CN)63-/4-的0.1 M KCl溶液中，通过电化学工作站进行一系列浓度标准溶液的的阻抗检测，绘制工作曲线。图3A为浓度在1×10-6 ng/mL–0.1 ng/mL范围内的玉米赤霉烯酮标准溶液产生的阻抗值。图3B为传感电极阻抗响应与标准浓度的线性关系。
