一种虾青素-胶原蛋白耦合物及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种虾青素‑胶原蛋白耦合物及其制备方法和应用，该方法为将富含虾青素的原料与水溶性有机溶剂混合，去除不溶性成分；将胶原蛋白用水溶解；在温度4～60℃、酸性条件下将上述两种溶液滴加混合，使胶原蛋白和虾青素在混和反应液中溶解，并避光搅拌反应；将上述反应液中生成的虾青素‑胶原蛋白耦合物分离纯化，即得。

权利要求

1.一种虾青素-胶原蛋白耦合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将富含虾青素的原料与水溶性有机溶剂混合，去除不溶性成分；将胶原蛋白用水溶解；

2)在温度4～45℃、PH4.0～5.0条件下将上述两种溶液滴加混合，使胶原蛋白和虾青素在反应液中溶解，并避光搅拌反应；

3)将上述反应液中生成的虾青素-胶原蛋白耦合物分离纯化，得到虾青素-胶原蛋白耦合物；

步骤1)中所述水溶性有机溶剂选自乙醇、丙酮、甲醇。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，反应液中虾青素与胶原蛋白加入量的摩尔比为1:1～10:1。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，反应液中水溶性有机溶剂与水的体积比为0.5:1～4:1。

4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述富含虾青素的原料中虾青素的含量不少于1％w/w。

5.权利要求1～4任一项方法所制备的虾青素-胶原蛋白耦合物。

6.权利要求5所述的虾青素-胶原蛋白耦合物在制备预防和治疗皮肤光老化的产品中的应用。

7.一种预防和治疗皮肤光老化的产品，其特征在于，该产品中含有权利要求5所述的虾青素-胶原蛋白耦合物。

8.根据权利要求7所述的一种预防和治疗皮肤光老化的产品，其特征在于，该产品由

0.5～2.0份权利要求5所述的虾青素-胶原蛋白耦合物、16～19份油相、5～7份乳化剂、74～

77份水相制成。

9.根据权利要求8所述的一种预防和治疗皮肤光老化的产品，其特征在于，所述油相由

8～12份硬脂酸、1～2份十六醇、0.8～1.2份羊毛脂、4～6份石蜡油组成；

所述乳化剂由4～5份单硬脂酸甘油酯、1～2份十二烷基硫酸钠组成；

所述水相由2～3份甘油、70～75份水组成。

说明书

一种虾青素-胶原蛋白耦合物及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及一种虾青素-胶原蛋白耦合物的制备以及预防、治疗皮肤光老化的应用。

背景技术

[0002] 皮肤光老化是皮肤长期受到紫外线照射所引起的累积损伤，过量的紫外线照射会使皮肤胶原、透明质酸和弹性蛋白降解，导致皮肤外观变化，严重者可导致基底细胞癌、黑素细胞瘤和鳞状细胞癌等肿瘤性疾病的形成。目前，预防和治疗光老化已成为医药、化妆品和生物材料领域研究的热点，开发安全、有效的防治光老化产品是目前相关产业研究的一个重要方向。

[0003] 虾青素(3,3′-二羟基-4,4′-二酮基-β-胡萝卜素，Astaxanthin,以下简称虾青素)能减少紫外线引起的皮肤损伤，改善皮肤胶原蛋白功能，有效延缓皮肤衰老。然而，虾青素本直接涂敷于皮肤使用时极大地限制了它在包括抗皮肤光老化在内的各种开发和应用中的直接使用。采用诸如微胶囊包埋、主客体包结络合和纳米沉淀等技术，以及低温避光保存、脂溶性溶剂溶解保存和小剂量涂敷使用等方法，虽然可以在一定程度上解决虾青素的应用缺陷，但对工艺技术水平要求高，抑或使用成本高、便利性和有效性不足。因此，目前市场上少有以虾青素为主要活性成份的皮肤用药品或化妆品。其中的根本原因在于：虾青素在现有各种应用中仍以不稳定的原始分子形式存在，物理方法无法从本质上解决虾青素应用的局限性。

发明内容

[0004] 本发明的目的之一在于提供一种虾青素-胶原蛋白耦合物的制备方法。

[0005] 本发明的目的之二是提供上述方法制备的虾青素-胶原蛋白耦合物的应用。

[0006] 本发明所采取的技术方案是：

[0007] 一种虾青素-胶原蛋白耦合物的制备方法，包括以下步骤：

[0008] 1)将富含虾青素的原料与水溶性有机溶剂混合，去除不溶性成分；将胶原蛋白用水溶解；

[0009] 2)在温度4～60℃、酸性条件下将上述两种溶液滴加混合，使胶原蛋白和虾青素在反应液中溶解，并避光搅拌反应；

[0010] 3)将上述反应液中生成的虾青素-胶原蛋白耦合物分离纯化，得到虾青素-胶原蛋白耦合物。

[0011] 进一步的，步骤2)中，反应液中虾青素与胶原蛋白加入量的摩尔比为1:1～10:1。

[0012] 进一步的，步骤2)中，反应液中水溶性有机溶剂与水的体积比为0.5:1～4:1。

[0013] 进一步的，所述水溶性有机溶剂选自乙醇、丙酮、甲醇、乙二醇、二甲基亚砜、四氢呋喃。

[0014] 进一步的，所述富含虾青素的原料中虾青素的含量不少于1％w/w。

[0015] 上述任一项方法所制备的虾青素-胶原蛋白耦合物。

[0016] 上述所述的虾青素-胶原蛋白耦合物在制备预防和治疗皮肤光老化的产品中的应用。

[0017] 一种预防和治疗皮肤光老化的产品，该产品中含有上述所述的虾青素-胶原蛋白耦合物。

[0018] 进一步的，上述预防和治疗皮肤光老化的产品由0.5～2.0份权利要求6所述的虾青素-胶原蛋白耦合物、16～19份油相、5～7份乳化剂、74～77份水相制成。

[0019] 进一步的，所述油相由8～12份硬脂酸、1～2份十六醇、0.8～1.2份羊毛脂、4～6份石蜡油组成；

[0020] 所述乳化剂由4～5份单硬脂酸甘油酯、1～2份十二烷基硫酸钠组成；

[0021] 所述水相由2～3份甘油、70～75份水组成。

[0022] 本发明的有益效果是：

[0023] (1)本发明所述制备的虾青素-胶原蛋白耦合物具有不同于胶原蛋白原料(214nm)和虾青素(480nm)的紫外特征吸收峰，可溶于水，无着色性。

[0024] (2)本发明所述制备的虾青素-胶原蛋白耦合物具有更好的抗光氧化性，可更好地降低光照引发的皮肤厚度，降低MDA含量，提高SOD和GSH-Px抗氧化酶活力。本发明制备的虾青素-胶原蛋白耦合物具有预防和治疗皮肤光老化的作用，为胶原蛋白和虾青素的应用提供了市场前景。

[0025] (3)本发明制备方法步骤简单，操作条件易控。

附图说明

[0026] 图1为本发明虾青素-胶原蛋白耦合物在不同检测波长下的凝胶过滤色谱图，图中Coupling表示本发明的胶原蛋白-虾青素耦合物组，Collagen peptide表示胶原蛋白多肽，Astaranthin虾青素；

[0027] 图2小鼠皮肤厚度(Thickness of skin)变化，其中A：正常对照组；B：模型对照组；C：基质对照组；D：虾青素组；E：游离胶原蛋白和虾青素组，含4％游离虾青素(w/w)；F：本发明胶原蛋白-虾青素耦合物组；G：维生素E组；与正常对照组比较，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05；与模型对照组相比，###p<0.001，##p<0.01，#p<0.05)；

[0028] 图3各实验组小鼠的皮肤组织病理切片HE染色；

[0029] 图4各实验组小鼠的皮肤组织中MDA含量变化；

[0030] 图5各实验组小鼠的皮肤组织中SOD(I)和GSH-Px(II)活力变化。

具体实施方式

[0031] 一种虾青素-胶原蛋白耦合物的制备方法，包括以下步骤：

[0032] 1)将富含虾青素的原料与水溶性有机溶剂混合，去除不溶性成分；将胶原蛋白用水溶解；

[0033] 2)在温度4～60℃、酸性条件下将上述两种溶液滴加混合，使胶原蛋白和虾青素在反应液中溶解，并避光搅拌反应；

[0034] 3)将上述反应液中生成的虾青素-胶原蛋白耦合物分离纯化，得到虾青素-胶原蛋白耦合物。

[0035] 优选的，步骤2)中，酸性条件指pH为3.0～6.0，更优选4.5～5.5，最优选5.0。

[0036] 优选的，步骤2)中的温度优选4～45℃，最优选37℃。

[0037] 优选的，步骤2)中，反应液中虾青素与胶原蛋白加入量的摩尔比为1:1～10:1。

[0038] 优选的，步骤2)中，反应液中水溶性有机溶剂与水的体积比为0.5:1～4:1。

[0039] 优选的，步骤2)中，避光搅拌反应时间为0.5～2h，更优选为0.5～1.5h，最优选为0.75h。

[0040] 优选的，步骤3)中，所述分离纯化包括采用有机溶剂沉淀、盐析法、膜过滤法和/或柱层析法进行分离纯化。

[0041] 优选的，所述水溶性有机溶剂选自乙醇、丙酮、甲醇、乙二醇、二甲基亚砜、四氢呋喃。

[0042] 优选的，所述富含虾青素的原料中虾青素的含量不少于1％w/w。

[0043] 更优选的，所述富含虾青素的原料为：不同顺反结构[(3S，3S′)、(3R，3S′)和(3R，3R′)]的虾青素单体及其组合、红球藻藻粉、雪藻藻粉、富含虾青素的藻类提取物、富含虾青素的甲壳生物提取物。

[0044] 优选的，所述胶原蛋白包括：分子量为500～20000的水解胶原蛋白或/和分子量为500～20000的明胶。

[0045] 上述任一项方法所制备的虾青素-胶原蛋白耦合物。

[0046] 上述所述的虾青素-胶原蛋白耦合物在制备预防和治疗皮肤光老化的产品中的应用。

[0047] 优选的，所述的产品包括护肤品、化妆品。

[0048] 一种预防和治疗皮肤光老化的产品，该产品中含有上述所述的虾青素-胶原蛋白耦合物。

[0049] 优选的，上述预防和治疗皮肤光老化的产品由0.5～2.0份上述所述的虾青素-胶原蛋白耦合物、16～19份油相、5～7份乳化剂、74～77份水相制成。

[0050] 优选的，所述油相由8～12份硬脂酸、1～2份十六醇、0.8～1.2份羊毛脂、4～6份石蜡油组成；

[0051] 所述乳化剂由4～5份单硬脂酸甘油酯、1～2份十二烷基硫酸钠组成；

[0052] 所述水相由2～3份甘油、70～75份水组成。

[0053] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

[0054] 实施例1一种虾青素-胶原蛋白耦合物的制备方法

[0055] 将雨生红球藻来源的(3S，3S′)虾青素单体用乙醇溶解，离心去除不溶性成分，将平均分子量为15600的水解胶原蛋白用水溶解。调节上述两种溶液pH至5.0，在25℃下滴加混合，混合液中虾青素与胶原蛋白加入量的摩尔比为10:1，且混合液中乙醇与水的体积比为2:1，避光反应搅拌2小时后，向反应液中加入饱和硫酸铵溶液至蛋白沉淀，收集蛋白沉淀，冻干低温避光保存。

[0056] 经检测，上所制备的虾青素-胶原蛋白耦合物的紫外特征吸收峰在418nm附近(见图1)，具有不同于胶原蛋白(214nm)和虾青素单体(480nm)的紫外特征吸收峰，可溶于水，无着色性。

[0057] 实施例2一种虾青素-胶原蛋白耦合物的制备方法

[0058] 将雨生红球藻粉(虾青素含量为3％w/w)与丙酮混合，搅拌，在4℃振荡40min，离心(4000r/min，10min)，取上清液。将数均分子量为5000的水解胶原蛋白用水溶解。调节上述溶液pH至4.0，在4℃下滴加混合，混合后的虾青素与胶原蛋白加入摩尔比为5:1，丙酮与水的体积比为1:1，避光反应搅拌1小时后，向反应液中继续滴加冷丙酮至蛋白沉淀，收集蛋白沉淀，冻干低温避光保存。

[0059] 经检测，上所制备的虾青素-胶原蛋白耦合物的的紫外特征吸收峰在390nm附近，具有不同于胶原蛋白原料(214nm)和虾青素(480nm)的紫外特征吸收峰，可溶于水，无着色性。

[0060] 实施例3一种虾青素-胶原蛋白耦合物的制备方法

[0061] 将富含虾青素的甲壳生物提取物(虾青素单体含量26％、虾青素酯含量9％,w/w)用甲醇溶解，加入0.4mol/L NaOH-CH3OH溶液，料液比1:2(v/v)，在10℃保持20分钟，离心(4000r/min，10min)，取上清液。调节pH值至4.5，将数均分子量为10000的水解明胶用水溶解。调节溶液pH至4.5，在37℃下与皂化后的甲壳生物提取物甲醇溶液滴加混合。混合后的虾青素与胶原蛋白加入摩尔比为2.5:1，甲醇与水的体积比为3:1，避光反应搅拌1小时后，采用截留分子量为5000的有机滤膜过滤，收集保留液，挥干溶剂，收集样品后低温避光保存。

[0062] 经检测，上所制备的虾青素-胶原蛋白耦合物的的紫外特征吸收峰在407nm附近，具有不同于胶原蛋白原料(214nm)和虾青素(480nm)的紫外特征吸收峰，可溶于水，无着色性。

[0063] 实施例4一种预防和治疗皮肤光老化的产品

[0064] 本产品由1份本发明虾青素-胶原蛋白耦合物、17.5份油相、6份乳化剂和75.5份水相制成。

[0065] 其中，油相配方为：硬脂酸(10份)、十六醇(1.5份)、羊毛脂(1份)、石蜡油(5份)；

[0066] 乳化剂配方为：单硬脂酸甘油酯(4.26份)、十二烷基硫酸钠(1.74份)；

[0067] 水相配方为：甘油(2.5份)、去离子水(73份)。

[0068] 按比例配好油相、乳化剂和水相，油相和乳化剂在75℃下均质搅拌15-20min，水相灭菌降至80℃后，把油相和乳化剂缓慢加入到水相中，温度降到75℃时乳化搅拌15-20min，得基质，在基质温度降至60℃时，再将本发明虾青素-胶原蛋白耦合物加入其中，混匀，冷却至室温，即得预防和治疗皮肤光老化的产品。

[0069] 下面对本发明制备的虾青素-胶原蛋白耦合物作进一步的效果检测。

[0070] 本发明胶原蛋白-虾青素耦合物对光老化小鼠皮肤的改善作用。

[0071] 实验方法：

[0072] Balb/c小鼠适应性喂养一段时间后，按体重随机分为7组，每组6只。分别为正常对照组(A)、模型对照组(B)、基质对照组(C)、虾青素组(D)、游离胶原蛋白和虾青素组(E，含4％游离虾青素，w/w)、本发明胶原蛋白-虾青素耦合物组(F)和维生素E组(G)。每组小鼠每天背部剃毛，面积为2cm×3cm。3支UVB灯源(发射光谱275-320nm，峰值313nm，40w)，4支UVA灯源(发射光谱320-420nm，峰值340nm，40w)进行照射。将各组小鼠标记好放入照射箱内，距离光源50cm，照射前灯管预热15-20min，测定紫外强度，待稳定后，进行照射，分别进行UVB和UVA照射(正常对照组(A)不进行UVB和UVA照射处理)。照射剂量：从最小红斑剂量MED(UVB 
0.1J/cm2，UVA定为10倍UVB，即1J/cm2)开始照射，第1周为1个MED，第2周2个MED，第3周4个MED，第4周到第六周均为4个MED，1次/天，每周照射6天，共6周，UVB总剂量为11.4J/cm2，UVA总剂量为114J/cm2。在UV照射前1h给药，给药情况如下。

[0073] 正常对照组(A)：不进行任何药物涂抹；

[0074] 模型对照组(B)：不进行任何药物涂抹；

[0075] 基质对照组(C)：给予基质涂抹，所用基质为实施例4中所述的基质。

[0076] 虾青素组(D)：所涂物除了将本发明胶原蛋白-虾青素耦合物组替换成等量的虾青素外，其余成分和用量均与实施例4相同。

[0077] 游离胶原蛋白和虾青素组(E，含4％游离虾青素，w/w)：所涂物除了将本发明胶原蛋白-虾青素耦合物组替换成等量的游离的胶原蛋白和虾青素外，其余成分和用量均与实施例4相同。

[0078] 本发明胶原蛋白-虾青素耦合物组(F)：涂抹实施例4所制备的产品。

[0079] 维生素E组(G)：即阳性对照组。

[0080] 结果分析：

[0081] (1)皮肤厚度测定和病理分析

[0082] 皮肤厚度测定结果如图2和图3所示，相比于正常对照组，模型对照组和基质对照组小鼠的皮肤厚度显著增加(p<0.001)，这表明过多UV照射会使皮肤厚度增加；与模型对照组相比，基质对照组无显著性差异(p>0.05)，表明基质不会降低光老化引起的皮肤厚度增加，基质对其它给药组无干扰作用；与模型对照组相比，各给药组的小鼠皮肤损伤情况均得到改善，角质层和表皮层厚度明显减小，真皮层胶原纤维和弹性纤维网状结构有所恢复，纤维组织断裂现象较少；基底细胞受损情况较轻。虾青素组的小鼠皮肤呈明显橙色，且不易消退；游离胶原蛋白和虾青素组(E组)实验小鼠皮肤呈微橙色；本发明耦合物组皮肤呈正常鲜红色，与对照组无差异。相比于模型对照组，虾青素组(p<0.01)、游离胶原蛋白和虾青素组(p<0.05)和耦合物组(p<0.001)的小鼠皮肤厚度均显著降低。

[0083] 上述结果说明本发明制备的虾青素-胶原蛋白耦合物比游离胶原蛋白和虾青素组作用效果更显著，具有更佳的抗氧化性，且不具有着色性，在光老化防治的实际应用时更具有适用性。

[0084] (2)小鼠皮肤组织皮生化指标检测

[0085] 剪取上述实验小鼠的背部裸露皮肤组织，除去皮下组织，经预冷生理盐水漂洗，滤纸拭干，迅速称重，装入5mL EP管中，按组织重量和生理盐水1:9(m:v)的比例加入相应体积的预冷生理盐水，于-80℃保存。冰浴条件下进行皮肤组织匀浆，低温离心(3500r/min，4℃，15min)，取上清分装，-80℃保存，用于丙二醛(MAD，过氧化程度指标)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽氧化酶(GSH-Px)的测定。

[0086] 如图4所示，与正常对照组相比，模型对照组和基质对照组的MDA含量显著增加(p<0.001)，表明模型对照组和基质对照组小鼠的皮肤脂质过氧化反应较为严重；与模型对照组相比，基质对照组无显著差异(p>0.05)，表明基质对其他给药组MDA含量无干扰作用。与模型对照组相比，虾青素组(p<0.001)、游离胶原蛋白和虾青素组(p<0.05)、本发明耦合物组(p<0.001)MDA含量明显下降。

[0087] 上述结果说明，本发明耦合物组比游离胶原蛋白和虾青素组对改善UV照射引起的皮肤脂质过氧化反应效果更明显，更有利于MDA含量的下降。

[0088] 如图5所示，与正常对照组相比，模型对照组和基质对照组的SOD和GSH-Px活力显著降低(p<0.001)，表明模型对照组和基质对照组小鼠皮肤组织中氧化应激压力显著上升；基质对照组和模型对照组无显著差异(p>0.05)，表明基质对其他给药组的此项检测指标无干扰作用。与模型对照组相比，虾青素组、游离胶原蛋白和虾青素组、本发明耦合物组的SOD和GSH-Px活力显著升高(p<0.05)。

[0089] 上述结果说明，本发明虾青素-胶原蛋白耦合物具有不低于游离胶原蛋白和虾青素组的提高小鼠体内SOD和GSH-Px抗氧化酶活力的能力，可有效减弱超氧阴离子自由基对皮肤组织的损伤作用。

[0090] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。