一种钌配合物、钌-RGD肽偶联物及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种钌配合物、钌‑RGD肽偶联物及其制备方法和应用。所述的偶联物由钌配合物(RuM)和RGD肽(RGDfK)两部分偶联合成得到。其中钌配合物RuM的通式为：[Ru(dmp)2(X‑COOH)](PF6)2，其中X代表的配体为：1,2‑二甲基‑1H‑咪唑[4,5‑f][1,10]菲啰啉。RGD肽为商品化试剂(RGDfK，上海强耀生物)。偶联物RuM‑RGD由钌配合物RuM和RGD肽RGDfK经缩合反应所得。本发明的RuM‑RGD偶联物，对胶质瘤细胞U87具有强的抑制作用，能够蓄积在U87肿瘤细胞的线粒体并抑制肿瘤细胞增殖，可作为新的以肿瘤细胞线粒体为靶点的抗肿瘤药物。

权利要求

1.钌-RGD肽偶联物RuM-RGD，其特征在于，其结构式如式下所示：

2.如权利要求1所述的钌-RGD肽偶联物RuM-RGD的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、钌配合物RuM的制备：取0.2mmol的配体L1和0.2mmol的配体L2，溶于10mL的DMF，氩气保护下150℃反应8小时，得深红色溶液；冷却后的反应液用15mL水稀释，加入饱和六氟磷酸铵剧烈搅拌，过滤；收集暗红色固体，用少量的水和乙醚洗涤数次，真空干燥，氧化铝柱层析纯化，用乙腈和乙醇洗脱，最后除去溶剂，减压旋干得红色微晶即可；

S2、将带有羧基端的钌配合物RuM溶于30mL的无水乙腈，剧烈搅拌，然后将0.43mmol N-羟基丁二酰亚胺和0.38mmol的N,N'-二环己基碳酰亚胺加入溶液中，室温搅拌反应6h；反应产物用硅胶柱纯化，10％甲醇作为流动相，产物冻干得暗黄色固体RuM-NHS；将0.016mmol的RuM-NHS溶于4mL无水无氧的DMF，然后加入0.04g的RGDfK，室温搅拌反应24h，在纯水中透析，产物经冻干得橘红色的固体RuM-RGD。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，钌配合物RuM的反应式如下所示：

4.如权利要求1所述的钌-RGD肽偶联物RuM-RGD在制备以U87肿瘤细胞线粒体为靶点的抗肿瘤药物中的应用。

说明书

一种钌配合物、钌-RGD肽偶联物及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明公开的是一种钌配合物，以及一种可以靶向U87肿瘤细胞线粒体的钌-RGD肽偶联物RuM-RGD的制备及应用，所公开的偶联物可作为新的以U87肿瘤细胞线粒体为靶点的抗肿瘤药物

背景技术

[0002] 钌(Ruthenium)配合物和其它金属抗癌药物相比，具有更高的细胞毒性和更小的毒副作用，呈现出广阔的发展前景，尤其是三种钌配合物已经进入Ⅱ期(NAMI-A)或Ⅰ期(KP1019和NKP1339)临床研究，所以对钌配合物进行各种修饰设计，以期能够进一步增强其抗肿瘤活性及靶向性已成为国内外的研究热点(Mini Rev.Med.Chem.,16:787-95,2016.)。最近Simone Fulda等提出了一个抗肿瘤药物新的设计方向：线粒体靶向抗癌药物。肿瘤细胞与正常细胞的线粒体无论在结构上还是功能上都存在较大差异，主要表现在线粒体能量代谢、膜电位及通透性、线粒体内ROS水平等几方面，肿瘤细胞由于发生较为广泛的变异而更容易受线粒体损伤的影响，许多研究巧妙地利用这些特点来设计和筛选新的线粒体靶向药物(Nat.Rev.Drug Discov.,9:447-464,2010.)。近年国内外学者以及本项目组研究发现某些结构的钌配合物能够靶向肿瘤细胞的线粒体(Mitochondria)，并且通过线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡，该类钌配合物大多具有一个共同的特点，对肿瘤细胞毒性与顺铂相当甚至优于顺铂，并且对顺铂耐药株肿瘤细胞有良好的杀伤效果，因此该类钌配合物有可能被开发成一种新型线粒体靶向的抗癌药。然而，虽然由于肿瘤细胞和正常细胞间的线粒体差异造成该类钌配合物对肿瘤细胞毒性大于正常细胞，但这还是不能完全避免对正常细胞的毒性，所以提高该类钌配合物的靶向杀伤能力成为需要进一步研究解决的问题(Nat.Commun.,7:12538,2016)。

[0003] 将靶向性差的小分子细胞毒药物与具有肿瘤靶向识别功能的导航配体偶联，将药物主动靶向导入肿瘤部位，避免其在健康组织蓄积，可以有效地减少对正常组织或器官的损害，提高靶向抗肿瘤效果。RGD肽是一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)的三肽序列的小分子寡肽，最早由Pierschbacher等在1984年首次发现报道可以作为细胞的识别配体，后来又陆续发现一些含有RGD序列的亲和力更高的线性或者环形寡肽(如RGDs，cRGDfv，cRGDfK等)都笼统称作RGD肽(J.Med.Chem.,56:1853-1864,2013)。RGD肽与在某些肿瘤细胞表面高表达的整合素αvβ3受体具有特异性的高亲和力。整合素αvβ3分子在很多恶性肿瘤细胞膜和肿瘤新生血管内皮细胞膜表面过度表达，但在正常细胞和静止休眠的上皮细胞不表达或者表达很弱，由于这种细胞间差异，整合素αvβ3已成为近年来重要的抗癌药物作用靶点。所以，RGD肽近年来成为在各种药物、分子探针、基因载体研究中广泛采用的靶向偶联配体(Mol.Pharm.,9:2961-2973,2012)。目前国际上关于RGD肽靶向偶联研究多集中在铂类抗癌药物和一些高分子载体方面，关于金属配合物尤其是钌配合物作为偶联分子的研究尚处于起步阶段。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种钌配合物、钌-RGD肽偶联物及其制备方法和应用。

[0005] 本发明的目的通过以下技术方案来予以实现：

[0006] 提供偶联物RuM-RGD在体外靶向肿瘤细胞线粒体及抑制肿瘤细胞增殖的效果。为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：

[0007] 一种钌配合物RuM，其特征在于，其由配体L1和配体L2制备得到，其反应式如下所示：

[0008]

[0009] 所述的配体L1的制备方法如下：取1mmol的苯胺，1mmol的4-甲酰苯甲酸，20mmol的醋酸铵，1mmol的1,10邻菲罗啉-5,6-二酮，溶于10mL冰醋酸中，氩气保护下回流24小时，反应液冷却后加入50mL水冷却，得黄色沉淀即可。

[0010] 所述的配体L2的制备方法如下：称取RuCl3·3H2O 1.56g，氯化锂1.68g溶解于10mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，氩气保护下140℃回流8h，反应完全后冷却至室温，加入50mL丙酮冷冻过夜，溶液抽滤，沉淀用冰水充分洗涤，得黑色固体；将固体溶于300mL乙醇：水＝1:1(V:V)的混合体系中，加热至回流并过滤，滤液中加入20g氯化锂，旋蒸除去乙醇，静置，待晶体析出后，抽滤，将晶体依次用水、乙醚洗涤，抽滤物真空干燥，得黑色微晶即可。

[0011] 上述钌配合物RuM的制备方法包括如下步骤：取0.2mmol的配体L1和0.2mmol的配体L2，溶于10mL的DMF，氩气保护下150℃反应8小时，得深红色溶液；冷却后的反应液用15mL水稀释，加入饱和六氟磷酸铵剧烈搅拌，过滤；收集暗红色固体，用少量的水和乙醚洗涤数次，真空干燥，氧化铝柱层析纯化，用乙腈和乙醇洗脱，最后除去溶剂，减压旋干得红色微晶即可。

[0012] 本发明提出的钌-RGD肽偶联物RuM-RGD，其结构式如式下所示：

[0013]

[0014] 钌-RGD肽偶联物RuM-RGD的制备方法包括如下步骤：将带有羧基端的钌配合物RuM溶于30mL的无水乙腈，剧烈搅拌，然后将0.43mmol N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和0.38mmol的N,N'-二环己基碳酰亚胺(DCC)加入溶液中，室温搅拌反应6h；反应产物用硅胶柱纯化，10％甲醇作为流动相，产物冻干得暗黄色固体RuM-NHS；将0.016mmol的RuM-NHS溶于4mL无水无氧的DMF，然后加入0.04g的RGDfK，室温搅拌反应24h，在纯水中透析，产物经冻干得橘红色的固体RuM-RGD。

[0015] 本发明还提出了上述钌-RGD肽偶联物RuM-RGD作为以U87肿瘤细胞线粒体为靶点的抗肿瘤药物的应用。

[0016] 与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：

[0017] 本发明提供了钌-RGD偶联物RuM-RGD的合成方法，细胞荧光显像实验发现该偶联物RuM-RGD能够特异性进入肿瘤细胞，而几乎不进入正常细胞。线粒体荧光共定位实验发现偶联物特异性蓄积在肿瘤细胞线粒体。MTT实验发现偶联物能够明显抑制肿瘤细胞的增殖，而对正常细胞增殖抑制不明显，可作为新的以肿瘤细胞线粒体为靶点的抗肿瘤药物。

附图说明

[0018] 图1为偶联物RuM-RGD靶向进入U87肿瘤细胞的荧光显像图片：A，D为细胞在明场下的图像。B，E为细胞荧光图像。C，F分别为A，B和D，E的叠加图像。

[0019] 图2为偶联物RuM-RGD靶向进入U87肿瘤细胞线粒体的荧光共定位图片：A，为RuM-RGD的荧光图像。B，为线粒体染料Mitotracker的荧光图像。C，为A，B的叠加图像。

[0020] 图3为MTT检测偶联物RuM-RGD对肿瘤细胞及正常细胞增殖的抑制效果。

具体实施方式

[0021] 下面结合具体的实施例来进一步详细说明本发明，但本发明的内容并不局限于此。

[0022] 实施例1钌-RGD偶联物RuM-RGD的合成

[0023] 所述的偶联物由钌配合物(RuM)和RGD肽(RGDfK)两部分偶联合成得到。其中钌配合物RuM的通式为：[Ru(dmp)2(X-COOH)](PF6)2，其中X代表的配体为：1,2-二甲基-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲啰啉。RGD肽为商品化试剂(RGDfK，上海强耀生物)。偶联物RuM-RGD由钌配合物RuM和RGD肽RGDfK经缩合反应所得。(RuM钌配合物合成流程如式I所示，偶联物RuM-RGD如式II所示)：

[0024]

[0025] 其中配体制备方法如下：

[0026] (1)配体L1的制备方法：称取0.093g苯胺(1mmol)，0.150g 4-甲酰苯甲酸(1mmol)，1.542g醋酸铵(20mmol)，0.21g的1,10邻菲罗啉-5,6-二酮(1mmol)，溶于10mL冰醋酸，氩气保护下回流24小时。反应液冷却后加入50mL水冷却，得黄色沉淀。

[0027] (2)配体L2的制备方法：参照(Inorg.Chem.1978,17,3334-3341)的合成方法，其特征在于称取RuCl3·3H2O 1.56g，氯化锂1.68g溶解于10mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，氩气保护下140℃回流8h。反应完全后冷却至室温，加入50mL丙酮冷冻过夜。溶液抽滤，沉淀用冰水充分洗涤，得黑色固体。将固体溶于300mL乙醇：水＝1:1(V:V)的混合体系中，加热至回流并过滤。滤液中加入20g氯化锂，旋蒸除去乙醇，静置，待晶体析出后，抽滤。将晶体依次用水、乙醚洗涤，抽滤物真空干燥，得黑色微晶。

[0028] (3)钌配合物RuM的制备方法：其特征在于称取0.083g配体L1(0.2mmol)和0.2mmol的配体L2，溶于10mL的DMF，氩气保护下150℃反应8小时，得深红色溶液。冷却后的反应液用15mL水稀释。加入饱和六氟磷酸铵剧烈搅拌，过滤。收集暗红色固体，用少量的水和乙醚洗涤数次，真空干燥。氧化铝柱层析纯化，用乙腈和乙醇洗脱。除去溶剂，减压旋干得红色微晶(产率60％)。

[0029] 偶联物RuM-RGD如式II所示，偶联物RuM-RGD的制备方法如下：

[0030] 偶联物RuM-RGD的制备方法，其特征在于：将带有羧基端的钌配合物RuM溶于30mL的无水乙腈，剧烈搅拌。将0.43mmol N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和0.38mmol的N,N'-二环己基碳酰亚胺(DCC)加入溶液中，室温搅拌反应6h。反应产物用硅胶柱纯化，10％甲醇作为流动相。产物冻干得暗黄色固体RuM-NHS(产率55％)。将0.016mmol的RuM-NHS溶于4mL无水无氧的DMF，然后加入0.04g的RGDfK。室温搅拌反应24h，在纯水中透析。产物经冻干得橘红色的固体RuM-RGD(产率45％)。

[0031] 实施例2偶联物RuM-RGD对U87肿瘤细胞的靶向识别

[0032] 将偶联物RuM-RGD(100μM)分别与高表达整合素αvβ3的U87(人胶质细胞瘤)细胞和低表达整合素αvβ3的正常肝细胞L02的共孵育6小时，U87细胞质呈现明显的红色荧光而L02细胞未观察到明显荧光，说明偶联物RuM-RGD能够靶向识别高表达整合素αvβ3的肿瘤细胞U87，如附图1所示。

[0033] 实施例3钌-RGD偶联物RuM-RGD靶向分布于U87肿瘤细胞的线粒体

[0034] 为进一步明确偶联物RuM-RGD进入细胞后是否能够靶向线粒体，利用荧光显微镜进行细胞器荧光共定位检测。将带有绿色荧光的线粒体特异性染料Mitotracker和带有红色荧光的偶联物RuM-RGD(100μM)加入到U87肿瘤细胞共孵育6h。如果两种荧光物质共定位在相同的细胞部位，则绿色荧光与红色荧光就会重叠变成橙黄色。结果显示，两种物质的荧光叠加后变为橙黄色，说明两种荧光物质共定位在线粒体上，证明偶联物RuM-RGD进入细胞后能够靶向U87肿瘤细胞的线粒体，如附图2所示。

[0035] 实施例4钌-RGD偶联物RuM-RGD靶向杀伤U87肿瘤细胞

[0036] 偶联物RuM-RGD对高表达整合素αvβ3的U87(人胶质细胞瘤)细胞杀伤能力显著高于未偶联的钌配合物RuM，而对于低表达整合素αvβ3的正常肝细胞L02，由于不具有识别RGD的受体而影响配合物进入细胞，所以偶联前后对于L02细胞的杀伤能力都十分弱，如附图3所示。

[0037] 上述实施例为本发明包含却不仅限于的实施方式，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

[0038] 本发明所指的钌配合物具有水溶性好，靶向识别能力强，在体外试验中可以显著抑制人胶质瘤细胞U87的增殖，而对正常肝细胞L02几乎没有杀伤活性，显示良好的应用价值，可作为新的以肿瘤细胞线粒体为靶点的抗肿瘤药物。

[0039] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。