杞菊地黄口服液多成分定量的检测方法

摘要

本发明公开了杞菊地黄口服液多成分定量的检测方法，杞菊地黄口服液多成分定量方法的建立包括以下步骤：步骤1、杞菊地黄口服液供试品溶液的制备；步骤2、混合对照品溶液的制备：步骤3、分别精密吸取供试品溶液和混合对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图；步骤4，将步骤3中获得的混合对照品和杞菊地黄口服液色相色谱图，根据保留时间、峰面积，计算样品中各个成分的含量。本发明所提供的杞菊地黄口服液多成分定量分析方法，能全面，客观地表征杞菊地黄口服液的质量。本发明提供的多成分定量的检测方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点。

权利要求

1.一种杞菊地黄口服液多成分定量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、杞菊地黄口服液供试品溶液的制备：

取3个不同批次杞菊地黄口服液10mL，精密量取，置蒸发皿中，水浴挥干，加入5ml甲醇超声处理30分钟，超声功率150W，频率20kHz，放冷，过滤得清液，定容至10mL，过0.45μm微孔滤膜，即得；

步骤2、酸类混合对照品溶液的制备：

取绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、丹酚酸B和丹皮酚适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含绿原酸90μg、隐绿原酸60μg、异绿原酸B 10μg、异绿原酸A 50μg、异绿原酸C 50μg、丹酚酸B 40μg、丹皮酚50μg的混合对照品溶液，摇匀，即可；

步骤3、皂苷类混合对照品溶液制备：

取5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、芍药苷、毛蕊花糖苷、木樨草苷适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含5-羟甲基糠醛80μg、莫诺苷120μg、马钱苷10μg、芍药苷300μg、毛蕊花糖苷10μg、木樨草苷30μg的混合对照品溶液，摇匀，即可；

步骤4、分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；

步骤5，将步骤4中获得的混合对照品和杞菊地黄口服液供试品的液相色谱图，根据保留时间、峰面积，计算杞菊地黄口服液供试品中各个成分的含量；

步骤4中，高效液相色谱仪的色谱条件为：色谱柱：YMC-Pack ODS-A，250×4.6mm，5μm，

12nm；流动相为0.1％甲酸和乙腈溶液，梯度洗脱，二极管阵列检测器，210-800nm全波长扫描，检测波长：254nm和325nm，柱温35℃，流速1mL/min，进样体积：10μL；

梯度洗脱程序如下：

0～10分钟：乙腈体积5～5％、0.1％甲酸水溶液体积95～95％；

10～20分钟：乙腈体积5～10％、0.1％甲酸水溶液体积95～90％；

20～90分钟：乙腈体积10～30％、0.1％甲酸水溶液体积90～70％；

90～105分钟：乙腈体积30～55％、0.1％甲酸水溶液体积70～45％。

说明书

杞菊地黄口服液多成分定量的检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种中药的检测方法，具体涉及杞菊地黄口服液多成分定量的检测方法。

背景技术

[0002] 杞菊地黄丸对应治疗阴虚火旺外加清肝明目杞菊地黄丸偏于养肝明目，适用于肝肾阴虚、两目昏花、视物模糊之证。阴虚火旺是指阴阳失调、阴虚则阳亢并生热化(成)火，出游阴虚内热现象外，尚有面红，目赤、咽干、喉痛、出血、心烦、苔少、舌质红瘦、脉细数等证。阴虚火旺是指脏腑阴分亏虚，失于滋养，虚热内生的表现。心、肝、肺、脾、肾均可出现此种情况。临床以肾阴虚较为常见，症状包括潮热盗汗、心烦、失眠，或男子早泄、遗精，女子经少或经闭，或骨蒸发热、腰膝酸软、耳鸣等。肝开窍于目，肝血上注于目则能视。枸杞子补肾益精，养肝明目；菊花善清利头目，宣散肝经之热。八种药物配伍组合共同发挥滋阴、养肝、明目的作用滋肾养肝。用于肝肾阴亏，眩晕耳鸣，羞明畏光，迎风流泪，视物昏花。

[0003] 目前关于杞菊地黄口服液的质量鉴定方法仅仅测定单个或几个有效成分的含量，不能全面客观的评价杞菊地黄口服液的质量。本发明采用高效液相色谱法建立杞菊地黄口服液中的13个成分的定量检测方法，为杞菊地黄口服液的药材鉴别、质量评价以及质量标准的制定具有重要的意义。

发明内容

[0004] 发明目的：本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种杞菊地黄口服液的多成分定量检测方法，该检测方法可以客观、全面、准确的评价杞菊地黄口服液的质量，对控制杞菊地黄口服液的质量和保证临床疗效具有重要意义。

[0005] 技术方案：为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

[0006] 一种杞菊地黄口服液多成分定量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

[0007] 步骤1、杞菊地黄口服液供试品溶液的制备：

[0008] 取杞菊地黄口服液，精密量取，置蒸发皿中，水浴挥干，加入甲醇超声处理 (功率150W，频率20kHz)30分钟，放冷，过滤得清液，定容，过0.45μm微孔滤膜，即得。

[0009] 步骤2、酸类混合对照品溶液的制备：

[0010] 取绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、丹酚酸B、丹皮酚适量，精密称定，加甲醇制成混合对照品溶液，摇匀，即可。

[0011] 步骤3、皂苷类混合对照品溶液制备取5-羟甲基糠醛(5-HMF)、莫诺苷、马钱苷、芍药苷、毛蕊花糖苷、木樨草苷适量，精密称定，加甲醇制成每1mL 含5-HMF 80ug、莫诺苷120ug、马钱苷10ug、芍药苷300ug、毛蕊花糖苷10ug、木樨草苷30ug的混合对照品溶液，摇匀，即可；

[0012] 步骤4、分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；

[0013] 步骤5，将步骤4中获得的混合对照品和杞菊地黄口服液色相色谱图，根据保留时间、峰面积，计算样品中各个成分的含量。

[0014] 作为优选方案，以上所述的杞菊地黄口服液多成分定量的检测方法，步骤1 杞菊地黄口服液供试品溶液制备方法为：取3批次的取杞菊地黄口服液10mL，精密量取，置蒸发皿中，水浴挥干，加入5ml甲醇超声处理(功率150W，频率 20kHz)30分钟，放冷，过滤得清液，定容至10mL，过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

[0015] 作为优选方案，以上所述的杞菊地黄口服液多成分定量的检测方法，步骤2 酸类混合对照品溶液的制备：取绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、丹酚酸B、丹皮酚适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含绿原酸90ug、隐绿原酸60ug、异绿原酸B 10ug、异绿原酸A 50ug、异绿原酸C 50ug、丹酚酸 B 40ug、丹皮酚50ug的混合对照品溶液，摇匀，即可。

[0016] 作为优选方案，以上所述的杞菊地黄口服液多成分定量的检测方法，步骤3 皂苷类混合对照品溶液制备取5-HMF、莫诺苷、马钱苷、芍药苷、毛蕊花糖苷、木樨草苷适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含5-HMF 80ug、莫诺苷120ug、马钱苷10ug、芍药苷300ug、毛蕊花糖苷10ug、木樨草苷30ug的混合对照品溶液，摇匀，即可。

[0017] 作为优选方案，以上所述的杞菊地黄口服液多成分定量的检测方法，步骤4 中，液相色谱条件为：液相色谱条件为：色谱柱：YMC-Pack ODS-A(250×4.6mm， 5um，12nm)；流动相为0.1％甲酸-乙腈溶液，梯度洗脱(如表1)，二极管阵列检测器(DAD)210-800nm全波长扫描 ，检测波长：254nm和325nm，柱温35℃，流速1mL/min，进样体积：10uL。

[0018] 表1梯度洗脱程序

[0019]程序 时间(min) 乙腈(％) 0.1％甲酸水溶液(％)
1 0 5 95
2 10 5 95
3 20 10 90
4 90 30 70
7 105 55 45

[0020] 作为优选方案，以上所述的杞菊地黄口服液多成分定量的检测方法，其特征在于，同时检测酚酸类和皂苷类等13个成分的含量。

[0021] 作为优选方案，以上所述的杞菊地黄口服液多成分定量的检测方法，步骤5，精密吸取酚酸类混合对照品溶液和皂苷类混合标准品溶液各1、2、4、8、10、 15、20μL进样，测定峰面积，以对照品进样量x(μg)为横坐标，峰面积y为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程:

[0022] 标准曲线

[0023]

[0024] 多成分定量检测条件的优化：

[0025] 1、在样品溶液的制备优化方面

[0026] 本发明通过对样品蒸干、稀释、萃取等处理后使用不同提取溶剂(甲醇、水、70％乙醇水溶液、85％乙醇水溶液、95％乙醇、无水乙醇)复溶、进行实验比较，结果发现蒸干后复溶所得的谱图差异响应值较高，极限平稳，故采用蒸干后复溶的方法；对复溶溶剂的考察中发现甲醇提取物色谱图信息量最多，成分含量最高；所以选用水浴挥干，加甲醇超声处理。

[0027] 2、在色谱条件进行优化方面

[0028] 本发明采用二极管阵列检测器对检测波长进行考察，提取254nm、280nm、 284nm、300nm、325nm处的色谱图，结果发现检测波长为254nm时，皂苷类成分色谱图所包含的信息量最全面且基线平稳，故选254nm为皂苷类成分检测波长；发现检测波长为325nm时，酚酸类成分色谱图所包含的信息量最全面且基线平稳，故选325nm为酚酸类成分检测波长；

[0029] 本发明对流速(1ml/min、0.8ml/min、0.7ml/min、0.6ml/min、0.5ml/min) 进行筛选，因杞菊地黄口服液中的成分中多存在同分异构体及其它极性极为相似的成分，故高流速下无法将其分开，故在低流速下分离效果较好，最终在流速为1ml/min多次等梯度条件下将极性相似的物质分开。

[0030] 本发明比较了甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.1％甲酸，乙腈和0.05％磷酸水，乙腈-0.1％磷酸水5个不同洗脱系统在不同梯度下的洗脱效果。结果发现以乙腈和0.1％甲酸水，为流动相时，杞菊地黄口服液中各成分能达到很好的分离效果，故最终选定以乙腈和0.1％甲酸水，为流动相。

[0031] 有益效果：

[0032] 1、本发明根据杞菊地黄口服液中所含的活性成分的结构性质特点，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成，梯度洗脱程序、流速，检测波长、色谱柱，柱温等分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的杞菊地黄口服液多成分定量检测方法，可以全面、客观、准确的检测和评价杞菊地黄口服液的质量，为保证临床杞菊地黄口服液疗效具有重要意义。

[0033] 2、用本发明所提供的方法所建立的杞菊地黄口服液多成分定量，能有效地表征杞菊地黄口服液的质量，能客观体现各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既可避免因测定个别化学成分而判定杞菊地黄口服液质量的片面性，又可减少为质量达标而人为处理的可能性。

[0034] 3、本发明提供的杞菊地黄口服液多成分定量的检测方法，具有方法简便、稳定性好、精密度高、重现性好等优点。

附图说明

[0035] 图1为皂苷类对照品溶液的色谱图。

[0036] 图2为酚酸类对照品溶液的色谱图。

[0037] 图3为杞菊地黄口服液供试品在254nm下的色谱图。

[0038] 图4为杞菊地黄口服液供试品在325nm下的色谱图。

具体实施方式

[0039] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

[0040] 实施例用到的仪器与试剂如下：

[0041] 实验器材

[0042] 1.1仪器

[0043] 日本岛津公司全波段扫描(200-800nm)高液相色谱系统，包括全自动在线脱气系统，全自动进样系统Prominence SIL-20A，二极管阵列检测器SPD-M20A 和自动温控柱温箱CTO-20A，KQ3200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，BP121S电子分析天平(SARTORIUS)。

[0044] 1.2药品与试剂

[0045] 杞菊地黄口服液样品均来自江苏海昇药业有限公司(样品批号分别为： 140401、160301、160503)；5-HMF对照品(批号：111626-201509)、莫诺苷对照品(批号：111998-
201501，纯度：96.8％)、绿原酸对照品(批号：110753-201415，纯度：96.2％)、隐绿原酸对照品(批号：150728纯度：≥98％)、马钱苷对照品 (批号：111640-201005，纯度：99.2％)、芍药苷对照品(批号：110736-201539)、毛蕊花糖苷对照品(批号：61276-17-3，纯度：≥98％)南京森贝伽生物科技有限公司、木樨草苷对照品(批号：111720-200905，纯度：96.5％)、异绿原酸B对照品(批号：150726)、异绿原酸A对照品(批号：151028)、异绿原酸C对照品(批号：
150624)、丹酚酸B对照品(批号：111562-201615)、丹皮酚对照品 (批号：110708-200506，纯度：≥98％)均购于中国药品生物制品检验所；甲醇 (分析纯)；石油醚(分析纯)；乙醚(分析纯)；磷酸(分析纯)；乙腈(色谱纯)；实验所用到的试剂均购于南京化学试剂有限公司，娃哈哈纯净水。

[0046] 实施例1一种杞菊地黄口服液多成分定量的检测方法，包括以下步骤：

[0047] 步骤1、杞菊地黄口服液供试品溶液的制备：

[0048] 取以上表1的3批杞菊地黄口服液10mL，精密量取，置蒸发皿中，水浴挥干，加入5ml甲醇超声处理(功率150W，频率20kHz)30分钟，放冷，过滤得清液，定容至10mL，过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

[0049] 步骤2、酸类混合对照品溶液的制备：

[0050] 取绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、丹酚酸B、丹皮酚适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含绿原酸90ug、隐绿原酸60ug、异绿原酸B 10ug、异绿原酸A 50ug、异绿原酸C 50ug、丹酚酸B 40ug、丹皮酚50ug 的混合对照品溶液，摇匀，即可。

[0051] 步骤3、皂苷类混合对照品溶液制备取5-HMF、莫诺苷、马钱苷、芍药苷、毛蕊花糖苷、木樨草苷适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含5-HMF 80ug、莫诺苷120ug、马钱苷10ug、芍药苷300ug、毛蕊花糖苷10ug、木樨草苷30ug的混合对照品溶液，摇匀，即可。

[0052] 步骤4、分别精密吸取3批杞菊地黄口服液供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，混合对照品色谱如图1和图2，供试品溶液的色谱图如图3和图4；(图中峰1为5-HMF；峰2为莫诺苷；峰3为绿原酸；峰4为隐绿原酸；峰5为马钱苷；峰6为芍药苷；峰7为毛蕊花糖苷；峰8为木樨草苷；峰9为异绿原酸B；峰10为异绿原酸A；峰11为异绿原酸C；峰
12为丹酚酸B；峰13为丹皮酚) 色谱柱：YMC-Pack ODS-A(250×4.6mm，5um，12nm)；流动相为
0.1％甲酸-乙腈溶液，梯度洗脱如表1，二极管阵列检测器(DAD)210-800nm全波长扫描 ，检测波长：254nm和325nm，柱温35℃，流速1mL/min，进样体积：10uL。

[0053] 表1梯度洗脱程序

[0054]

[0055] 1、线性关系考察

[0056] 取酚酸类混合对照品溶液和皂苷类混合标准品溶液各1、2、4、8、10、15、 20μL进样，测定峰面积，以对照品进样量x(μg)为横坐标，峰面积y为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。结果见表2。

[0057] 表2标准曲线

[0058]

[0059] 实施例2方法学考察

[0060] 1、精密度研究

[0061] 按实施例1方法制备的样品批号为140401供试品溶液，按照实施例1的检测方法分析，平行进样6次，进样量为10μL，以5-HMF、莫诺苷、绿原酸、隐绿原酸、马钱苷、芍药苷、毛蕊花糖苷、木樨草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、丹酚酸B、丹皮酚峰面积的RSD(％)值分别为1.32、2.58、3.45、 2.01、1.94、1.53、1.49、2.05、2.53、2.41、0.98、2.40、2.58，结果表明该设备的平行进样精密性良好。

[0062] 2、稳定性研究

[0063] 按实施例1方法制备的样品批号为140401供试品溶液，按照实施例1的检测方法分析，采用0、2、6、12、18、24小时不同时间进样分析，进样量为10 μL，以5-HMF、莫诺苷、绿原酸、隐绿原酸、马钱苷、芍药苷、毛蕊花糖苷、木樨草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、丹酚酸B、丹皮酚的峰面积 RSD(％)值分别为2.47、1.25、2.53、3.47、3.15、2.34、1.13、1.14、1.83、 2.64、2.89、2.58、2.79，结果表明供试品溶液在24h之内的色谱峰面积变化不大，稳定性非常好。

[0064] 3、重复性试验

[0065] 平行精密称取批号为140401供试品溶液，按照实施例1的检测方法分析，进样量为10μL，以5-HMF、莫诺苷、绿原酸、隐绿原酸、马钱苷、芍药苷、毛蕊花糖苷、木樨草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、丹酚酸B、丹皮酚的峰面积RSD(％)值分别为1.72、1.32、2.35、
2.05、1.52、1.63、1.42、2.43、 2.38、1.05、1.86、2.56、2.35，结果表明样品色谱峰重现性好，该方法的重复性良好。

[0066] 以上实验结果表明，本发明提供的杞菊地黄口服液多成分定量检测方法，稳定性好，精密度高，重复性好，能全面客观评价杞菊地黄口服液的质量，为保证临床疗效具有重要的意义。

[0067] 以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。