一种适合烟草基因编辑素材水溶性糖的测定方法

摘要

本发明公开了一种适合烟草基因编辑素材水溶性糖的测定方法，使用以下装置：样品萃取瓶，包括：外套管(1)；内套管(2)；导液管(4)；筛板(3)，位于所述内套管(2)的下端开口内，为一个或多个；该方法包括以下步骤：①烟叶萃取；②过滤和转移；③分析作出色谱图；④与标准色谱图的峰面积，即可得到烟草基因编辑素材水溶性糖的含量。本发明的测定方法首次使用在离子色谱分析柱前加一个在线固相萃取净化柱，具有处理简单、方便、效果好的优点，测定方法具有定量准确、重复性好、检出限低等优点，有效实现烟草基因编辑素材中水溶性糖的高通量分析测定。

权利要求

1.一种适合烟草基因编辑素材水溶性糖的测定方法，其特征在于，使用以下装置：

样品萃取瓶，包括：外套管（1），其底部密封且为平底，其口部有一密封圈（11）；内套管（2），其外径与所述外套管（1）的内径相适配，其长度大于所述外套管（1）的长度；导液管（4），位于所述内套管（2）内，其下端有一扩张口与所述内套管（2）的下端内壁密封固定连接，其与所述内套管（2）上端口固定连接形成受压面（21），其上部伸出所述内套管（2）外部，并回弯向下；筛板（3），位于所述内套管（2）的下端开口内，为一个或多个；

该方法包括以下步骤：

①将烟叶在-80℃下冷冻，然后在40℃烘干，粉碎并过40目筛；

②称取步骤①得到的粉末0.1 g于所述外套管（1）中，加入50 mL萃取剂，将所述内套管（2）的一部分插入到所述外套管（1）中并被所述密封圈（11）密封，然后在一定温度下超声萃取20 min；

③在所述受压面（21）施加向下的力，则所述外套管（1）中的萃取溶液通过所述筛板（3）被过滤后进入所述导液管（4）中，并从导液管（4）流出进入到样品收集瓶中，冷却至室温得到待分析的样品滤液；收集样品滤液1-1.5 mL，进行在线净化离子色谱分析，所述的在线净化离子色谱分析为在离子色谱分析柱前加一个在线固相萃取净化柱，所述在线固相萃取净化柱填料为MCI-GEL反相树脂；

④采用峰面积法进行定量，通过样品中糖类物质的峰面积与标准工作曲线对比，即可确定所述烟草基因编辑素材水溶性糖的含量。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤②所述的萃取剂为水。

3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤②所述的温度为50℃。

4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤③所述的筛板的孔径为0.45μm。

5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤③所述的在线固相萃取净化柱填料为MCI-GEL反相树脂，在线固相萃取净化柱规格为4 × 10 mm，填料粒径为5.0 μm，萃取容量为30 mg。

6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤③所述的在线净化离子色谱分析条件为：在线固相萃取净化柱接在离子色谱分析柱前端，离子色谱条件：CarboPac PA1 4×

250 mm，5 μm 碳水化合物分析柱；柱温：30 ℃；柱流速：1.5 mL / min；进样量：2.0 μL；流动相：0.20 mol/L 的氢氧化钠水溶液；等度洗脱；采用脉冲安培检测法检测。

7.根据权利要求6所述的测定方法，其特征在于，所述脉冲安培检测法条件为：以AgCl/Ag为参比电极，Au为工作电极，工作电位如下：0.00-0.40 s，0.1 V； 0.41-0.42 s，- 2.0 V；0.43 s，0.6 V；0.44-0.50 s，-0.1 V；积分区间为0.20-0.40 s。

说明书

一种适合烟草基因编辑素材水溶性糖的测定方法

技术领域

[0001] 本发明涉及分析化学技术领域，具体是涉及一种适合烟草基因编辑素材水溶性糖的测定方法。

背景技术

[0002] 糖类化合物是烟草中的重要成分，对烟草的生长发育以及成品烟叶的内在质量均有重要影响。烟草样品中含有多种糖，但葡萄糖、果糖和蔗糖占烟草中水溶性总糖含量的90％以上；因此烟草中葡萄糖、果糖和蔗糖的测定对了解烟草的生长发育情况及成品烟叶品质的评价均具有重要意义。目前，烟草中水溶性糖的测定文献报到很多，主要有方法有滴定法、近红外光谱法、连续流动分析法、毛细管电泳法、气相色谱法、高效液相色谱法和离子色谱法等。

[0003] 离子色谱法可以无需衍生直接进行检测低浓度糖的定量分析，几乎能分析所有的单糖和大部分的低聚糖，样品前处理操作简单，因此该技术在水溶性糖分析中得到了广泛应用。目前烟草行业标准YC/T 251-2008采用离子色谱法测定烟草中葡萄糖、果糖和蔗糖。但样品分析时间长(每个样品的色谱分析时间需40min左右)；而且样品前处理采用萃取液不经净化直接进样，大量样品分析时萃取液中的干扰成分容易在离子色谱柱上富集，容易污染色谱柱并影响分析结果。随着烟草行业烟草基因编辑工厂化育种工作的启动，通过基因编辑将产生数万个素材。要对这些海量的素材进行快速化学分析评价，现有行业标准很难满足这些海量素材快速筛选化学分析的需求。

[0004] 在进行烟草基因编辑素材品质评价过程中，需要寻找一种更简便、快速的水溶性糖的测定方法，该测定方法可批量、高通量操作，实现快速、高效、准确的测定。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种集在线固相萃取净化功能的离子色谱分析方法，可有效实现烟草基因编辑素材中水溶性糖的高通量分析测定。

[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的。

[0007] 一种适合烟草基因编辑素材水溶性糖的测定方法，使用以下装置：

[0008] 样品萃取瓶，包括：外套管1，其底部密封且为平底，其口部有一密封圈11；内套管2，其外径与所述外套管1的内径相适配，其的长度大于所述外套管1的长度；导液管4，位于所述内套管2内，其下端有一扩张口与所述内套管2的下端内壁密封固定连接，其与所述内套管2上端口固定连接形成受压面21，其上部伸出所述内套管2外部，并回弯向下；筛板3，位于所述内套管2的下端开口内，为一个或多个；

[0009] 该方法包括以下步骤：

[0010] ①将烟叶在-80℃下冷冻，然后在40℃烘干，粉碎并过40目筛；

[0011] ②称取步骤1得到的粉末0.1g于所述外套管1中，加入50mL萃取剂，将所述内套管2的一部分插入到所述外套管1中并被所述密封圈11密封，然后在一定温下超声萃取20min；

[0012] ③在所述受压面21施加向下的力，则所述外套管1中的萃取溶液通过所述筛板3被过滤后进入所述导液管4中，并从导液管4流出进入到样品收集瓶中，冷却至室温得到待分析的样品滤液；收集样品滤液1-1.5mL，进行在线净化离子色谱分析；

[0013] ④采用峰面积法进行定量，通过样品中糖类物质的峰面积与标准工作曲线对比，即可确定所述烟草基因编辑素材水溶性糖的含量。

[0014] 优选地，步骤②所述的萃取试剂为水。

[0015] 优选地，步骤②所述的温度为50℃。

[0016] 优选地，步骤③所述的筛板的孔径为0.45μm。

[0017] 优选地，步骤③所述的在线净化离子色谱法为在离子色谱分析柱前加入一个在线固相萃取净化柱，所述在线固相萃取净化柱填料为MCI-GEL反向树脂，其规格为4×10mm，填料粒径为5.0μm，萃取容量为30mg。

[0018] 优选地，步骤③所述的在线净化离子色谱条件为：在线固相萃取净化柱接在离子色谱分析柱前端，离子色谱条件：CarboPac PA1(4×250mm，5μm)碳水化合物分析柱；柱温：30℃；柱流速：1.5mL/min；进样量：2.0μL；流动相：0.20mol/L的氢氧化钠水溶液；等度洗脱；
采用脉冲安培检测法检测。

[0019] 优选地，所述脉冲安培检测法条件为：以AgCl/Ag为参比电极，Au为工作电极，工作电位如下：0.00-0.40s，0.1V；0.41-0.42s，-2.0V；0.43s，0.6V；0.44-0.50s，-0.1V；积分区间为0.20-0.40s。

[0020] 在本发明的技术方案中，所述的在线固相萃取净化柱可以连续进样500次，超过500次后，将净化柱反接在液相色谱泵端，利用100％甲醇，1.0mL/min流速进行反洗1h后，即可重新进行使用。

[0021] 本发明与现有技术相比，其有益效果为：

[0022] ①本发明提供了一种适合烟草基因编辑素材水溶性糖的测定方法，对比不同素材或者基因编辑素材与正常烟叶样品中糖的含量，进行不同烟叶品质的判定评价。在烟草样品的糖分析过程中，样品萃取液中会含有少量的蜡质，色素、多酚、脂肪类物质等物干扰成分，这些成分不能被离子色谱的流动相洗脱，容易在色谱柱上残留污染色谱柱，进而影响分析结果。本发明采用固相萃取进行样品前处理能得到较好的分析效果。采用在离子色谱柱前接MCI-GEL反向树脂填料的在线固相萃取柱；当样品随流动相通过固相萃取柱时，较小的极性成分富集在固相萃取柱上，不能被离子色谱的流动相洗脱。而待测的糖在反相固相萃取柱上没有保留，可通过固相萃取柱后再进入离子色谱柱，这样可在线达到固相萃取净化的效果。样品测试过程中不需要单独进行固相萃取操作步骤，可通过在线固相萃取除去样品萃取液中的干扰成分，大大简化了样品前处理操作。

[0023] ②本发明选择在离子色谱柱前接MCI-GEL反向树脂填料的在线固相萃取柱；MCI-GEL反向树脂基体是聚苯乙烯和二乙烯基共聚物，和C18具有相似的保留行为，但使用的pH范围比C18宽，在pH 0-14范围内均可稳定使用，因此在离子色谱的碱性流动相条件下可长期稳定使用；成功解决了常规固相萃取材料(C18等)使用pH范围窄，在碱性条件下易分解，无法适用于离子色谱的碱性流动相的缺陷。而且MCI-GEL反相树脂可不经活化直接固相萃取，和在线固相萃取方法兼容性好。

[0024] ③此外本发明的方法中还对离子色谱条件进行了优化，优化后的条件每个样品离子色谱分析时间只需10min，和现有烟草行业标准YC/T 251-2008相比，分析时间缩短3倍以上。进一步大幅度提高了样品分析效率。和常规分析方法相比，通过在线固相萃取有效简化了样品前处理操作，避免了离线固相萃取操作样品转移所带来的实验误差，具有前处理简单、方便、净化效果好、样品处理通量高、定量准确等优点，适用于大批量样品的准确测试。可为海量烟草基因编辑素材样品的检测评价提供准确可靠的方法，为烟叶品质评价提供有效的技术支持。

[0025] ④本发明使用的装置，样品的前处理过程中不需要转移样品就可以直接萃取、过滤并收集得到待分析样品，有效避免了操作所带来的实验误差，具有处理简单、方便、效果好的优点。

附图说明

[0026] 图1为本发明的外套管示意图；

[0027] 图2为本发明的内套管示意图；

[0028] 图3为本发明的萃取混合时内套管插入外套管口部示意图；

[0029] 图4为本发明的萃取液过滤、转移时内套管插入外套管内部示意图；

[0030] 图5为本发明的一个样品萃取瓶放置在样品萃取架上和样品收集瓶放置在样品收集架上时样品转移步骤的示意图；

[0031] 图6为糖类物质标准溶液；

[0032] 图7为烟草基因编辑素材中糖类物质色谱图。

[0033] 附图说明：1-外套管；2-内套管；21-受压面；3-筛板；4-导液管；5-样品萃取架；51-样品萃取瓶放置孔；6-样品收集架；61-样品瓶放置孔；62-废液收集瓶放置孔；610-样品收集瓶；620-废液收集瓶；11-密封圈；12-样品。

具体实施方式

[0034] 下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细地说明，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0035] 实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

[0036] 实施例1

[0037] 选取基因编辑育种工厂的5个素材样品的新鲜烟叶为考察对象，包括如下步骤：

[0038] ①样品前处理：选取基因编辑育种工厂的5个素材样品的新鲜烟叶为考察对象，在-80℃下进行冷冻干燥，研磨后过40目筛，准确称取样品粉末0.1g于外套管中中，加入50mL水作为萃取剂，随后，将萃取瓶的内套管利用密封圈固定在外套管的口部，安装完毕后放入后放入50℃下加热超声20min；待萃取完成后，用力下压萃取瓶的内套管，此时萃取溶液就通过过滤筛板进入到导液管中，并从导液管流出，达到过滤样品的效果。从导液管的回弯向下口收集萃取液1-1.5mL，进行在线净化离子色谱分析。

[0039] ②离子色谱分析：在离子色谱分析柱前加入一个在线固相萃取净化柱，萃取柱填料为MCI-GEL，萃取容量为30mg；离子色谱条件：CarboPac PA1(4×250mm，5μm)碳水化合物分析柱；柱温：30℃；柱流速：1.5mL/min；进样量：2.0μL；流动相：0.20mol/L的氢氧化钠水溶液；等度洗脱；采用脉冲安培检测法检测，脉冲安培检测法条件为：以AgCl/Ag为参比电极，Au为工作电极，工作电位如下：0.00-0.40s，0.1V；0.41-0.42s，-2.0V；0.43s，0.6V；0.44-0.50s，-0.1V；积分区间为0.20-0.40s。采用峰面积法进行定量，通过样品中糖类物质的峰面积与标准工作曲线对比，即可确定烟草基因编辑素材水溶性糖的含量。5种烟草基因编辑素材样品中糖类物质的含量见表1。

[0040] 表1烟草基因编辑素材样品中糖类物质的含量

[0041]

[0042] 从表1中可以发现正常和不正常的素材各个糖的含量是不一样的，尤其是蔗糖和葡萄糖的差异较大，可以作为区分不同品质基因编辑素材的粗筛指标。

[0043] 实施例2

[0044] 以5种成品烟叶(见表2)为考察样品，测定其中糖类物质含量，包括如下步骤：

[0045] ①样品前处理：选取目前在用的5个成品烟叶为考察对象，烘箱中40℃烘干，然后粉碎并过40目筛；准确称取样品粉末0.1g于外套管中，加入50mL水作为萃取剂，随后，将萃取瓶的内套管利用密封圈固定在外套管的口部，安装完毕后放入后放入50℃下加热超声20min；待萃取完成后，用力下压萃取瓶的内套管，此时萃取溶液就通过过滤筛板进入到导液管中，并从导液管流出，达到过滤样品的效果。从导液管的回弯向下口收集萃取液1-
1.5mL，进行在线净化离子色谱分析。

[0046] ②离子色谱分析：在离子色谱分析柱前加入一个在线固相萃取净化柱，萃取柱填料为MCI-GEL，萃取容量为30mg；离子色谱条件：CarboPac PA1(4×250mm，5μm)碳水化合物分析柱；柱温：30℃；柱流速：1.5mL/min；进样量：2.0μL；流动相：0.20mol/L的氢氧化钠水溶液；等度洗脱；采用脉冲安培检测法检测，脉冲安培检测法条件为：以AgCl/Ag为参比电极，Au为工作电极，工作电位如下：0.00-0.40s，0.1V；0.41-0.42s，-2.0V；0.43s，0.6V；0.44-0.50s，-0.1V；积分区间为0.20-0.40s。采用峰面积法进行定量，通过样品中糖类物质的峰面积与标准工作曲线对比，即可确定烟草基因编辑素材水溶性糖的含量。

[0047] 5种成品烟叶测定结果如表2所示(本法)，并与行业标准分析方法(行标)进行比较，结果如表2所示。

[0048] 表2烟叶产品糖类分析结果(wt％)

[0049]

[0050] 从表2中可以看出本发明的检测结果与行业标准测定结果基本一致，但是本发明由于采用了高通量的检测技术：批量前处理技术和在线净化离子色谱分析，分析测试效率大大提高，在保证分析结果准确性的前提下，可以比常规方法提高5倍以上的测定效率。

[0051] 实施例3

[0052] 以5种白仂烟成品烟叶为考察样品，测定其中糖类物质含量，测定步骤和实施例1相同，样品中葡萄糖含量在1.28-2.84wt％之间，果糖含量在1.51-3.67wt％之间，蔗糖含量在0.57-1.68wt％之间。

[0053] 实施例4

[0054] 以5种香料烟成品烟叶为考察样品，测定其中糖类物质含量，测定步骤和实施例1相同，样品中葡萄糖含量在4.60-7.25wt％之间，果糖含量在5.04-8.67wt％之间，蔗糖含量在1.15-2.74wt％之间。