一种防治新型鹅星状病毒的灭活疫苗及其制备方法

摘要

本发明公开了一种防治新型鹅星状病毒的灭活疫苗及其制备方法，所述灭活疫苗含有预防或治疗上有效量的灭活的鹅星状病毒株病毒液；所述鹅星状病毒株的保藏编号为CCTCC NO：V201808。本发明制备的新型鹅星状病毒灭活疫苗安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应，并且各项指标检测均稳定有效，利用本发明的灭活疫苗免疫雏鹅后，雏鹅可以获得较高的抗体水平，持续期长，可以有针对性的防治新型鹅星状病毒的感染与爆发，对鹅群提供有效的免疫保护；同时简化了疫苗的生产工艺，可以实现规模化生产。

权利要求

1.一种防治新型鹅星状病毒的灭活疫苗，其特征在于，所述灭活疫苗含有预防或治疗上有效量的灭活的鹅星状病毒株病毒液；所述鹅星状病毒株的保藏编号为CCTCC NO：V201808。

2.根据权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，所述鹅星状病毒株病毒液由如下方法制备而成：将保藏编号为CCTCC NO：V201808的鹅星状病毒株接种到鹅胚肾细胞中，对鹅星状病毒进行增殖培养后，通过冻融破碎细胞，收取上清液，并进行纯化，即得鹅星状病毒株病毒液。

3.根据权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，鹅星状病毒株病毒液灭活的方法为：加入终浓度为0.2%的甲醛，37℃搅拌灭活16h。

4.根据权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，所述灭活疫苗中还含有佐剂。

5.权利要求1-4任一项所述的灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将保藏编号为CCTCC NO：V201808的鹅星状病毒接种到鹅胚肾细胞中，对鹅星状病毒进行增殖培养后，通过冻融破碎细胞，收取上清液，并进行纯化，获得鹅星状病毒株病毒液；

（2）将鹅星状病毒株病毒液灭活，加入Tween- 80混合作为水相，以白油、硬脂酸铝和Span-80混合作为油相，将油相和水相按2:1混合均匀，乳化，得到防治新型鹅星状病毒的灭活疫苗；

所述水相中Tween- 80的终浓度为2%-4%。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，鹅星状病毒株病毒液灭活的方法为：加入终浓度为0.2%的甲醛，37℃搅拌灭活16h。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述白油、硬脂酸铝和Span-80的比例为94:2:6。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，油相和水相混合的方法为：将水相加入到油相中，6000rpm混合10min。

9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述乳化具体为：8000r/min乳化20min。

10. 保藏编号为CCTCC NO：V201808的鹅星状病毒在制备防治雏鹅痛风的灭活疫苗中的应用；所述雏鹅痛风是由鹅星状病毒引起的。

说明书

一种防治新型鹅星状病毒的灭活疫苗及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体涉及一种防治新型鹅星状病毒的灭活疫苗及其制备方法。

背景技术

[0002] 星状病毒(AStV)是一类无囊膜、呈球形、直径为28-30nm的单股正链RNA病毒，基因组具有感染性，长6.4-7.9kb，该病毒的感染具有一定的流行性，可引起人或动物的肠炎、腹泻，有的伴有呕吐和腹痛。星状病毒科根据感染宿主的不同可分为哺乳动物星状病毒属和禽星状病毒属，禽星状病毒可以引起禽类发生多种疾病，其临床表现因病毒毒株、毒力或感染宿主的不同而有差异。鹅星状病毒(Goose astrovirus，GAstV)，主要侵害幼龄雏鹅，该病已经在多个省份流行发生，使鹅的死亡率上升，极大危害我国养鹅业的健康发展。

[0003] 2017年2～12月，我国山东、安徽、江苏、辽宁、河南及广东等地雏鹅群爆发了一种以痛风为主要特征的传染性疾病。该病主要发生于5～20日龄的雏鹅，死亡率最高可达50％。患病雏鹅体腔及关节发生严重尿酸盐沉积，卧地倦动，采食困难，造成雏鹅生长缓慢，料肉比升高，肉鹅出栏合格率显著降低，对肉鹅养殖业造成严重经济损失。

[0004] 经研究发现，该病的爆发是由一种新型的鹅星状病毒感染所致，目前尚无疫苗可以进行预防；常规的抗病毒和抗菌治疗方法无效。而相较于弱毒疫苗，灭活疫苗比较安全、生产简单且易于保存。因此，急需研制一种安全高效能预防该新型鹅星状病毒的灭活疫苗。

发明内容

[0005] 针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种防治新型鹅星状病毒的灭活疫苗，用于预防鹅群爆发新型鹅星状病毒感染，从而弥补该疾病造成的严重经济损失。

[0006] 本发明的另一目的是提供该防治新型鹅星状病毒的灭活疫苗的制备方法。

[0007] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0008] 本发明是基于从具有痛风症状的患鹅肾脏、脾脏组织中分离得到的一株新型鹅星状病毒，保藏编号为CCTCC NO：V201808，在该分离株的基础上，研制了能够防治该新型鹅星状病毒的灭活疫苗。

[0009] 本发明的第一方面，提供一种防治新型鹅星状病毒的灭活疫苗，所述灭活疫苗含有预防或治疗上有效量的灭活的鹅星状病毒株病毒液；所述鹅星状病毒株的保藏编号为CCTCC NO：V201808。

[0010] 优选的，鹅星状病毒株病毒液由如下方法制备而成：

[0011] 将保藏编号为CCTCC NO：V201808的鹅星状病毒株接种到鹅胚肾细胞(GKC)中，对鹅星状病毒进行增殖培养后，通过冻融破碎细胞，收取上清液，并进行纯化，即得鹅星状病毒株病毒液。

[0012] 优选的，鹅星状病毒株病毒液灭活的方法为：加入终浓度为0.2％的甲醛，37℃搅拌灭活16h。

[0013] 进一步的，所述防治新型鹅星状病毒的灭活疫苗中还含有佐剂。

[0014] 本发明的第二方面，提供上述灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

[0015] (1)将保藏编号为CCTCC NO：V201808的鹅星状病毒接种到GKC细胞中，对鹅星状病毒进行增殖培养后，通过冻融破碎细胞，收取上清液，并进行纯化，获得鹅星状病毒株病毒液；

[0016] (2)将鹅星状病毒株病毒液灭活，加入Tween-80混合作为水相，以白油、硬脂酸铝和Span-80混合作为油相，将油相和水相按2:1混合均匀，乳化，得到防治新型鹅星状病毒的灭活疫苗。

[0017] 优选的，步骤(1)中，纯化的具体方法为离心浓缩纯化法

[0018] 优选的，步骤(2)中，鹅星状病毒株病毒液灭活的方法为：加入终浓度为0.2％的甲醛，37℃搅拌灭活16h。

[0019] 优选的，步骤(2)中，所述水相中Tween-80的终浓度为2％-4％。

[0020] 优选的，步骤(2)中，所述白油、硬脂酸铝和Span-80的比例为94:2:6。

[0021] 优选的，步骤(2)中，油相和水相混合的方法为：将水相加入到油相中，6000rpm混合10min。

[0022] 优选的，步骤(2)中，所述乳化具体为：8000r/min乳化20min。

[0023] 本发明的有益效果：

[0024] (1)本发明利用从发病雏鹅体内分离得到的一株新型鹅星状病毒，该新型鹅星状病毒株具有优异的免疫原性，将该毒株接种到对星状病毒易感的鹅胚肾细胞中，收获细胞毒液，灭活后乳化，可以得到一种安全、有效、可控的灭活疫苗，有利于当前大范围爆发的以痛风为主要症状的新型鹅星状病毒感染的防控。

[0025] (2)本发明制备的新型鹅星状病毒灭活疫苗安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应，并且各项指标检测均稳定有效，利用本发明的灭活疫苗免疫雏鹅后，雏鹅可以获得较高的抗体水平，持续期长，可以有针对性的防治新型鹅星状病毒的感染与爆发，对鹅群提供有效的免疫保护；同时简化了疫苗的生产工艺，可以实现规模化生产，具有很好的商品化开发前景。

附图说明

[0026] 图1：本发明的病毒分离株N-AStV-SDPY接种鹅胚病变：A正常生长状态下的鹅胚；B为SDPY分离株导致的鹅胚病变。

[0027] 图2：PCR鉴定结果；图中，M为2000bp Marker，泳道1为空白对照，泳道2为AstV，泳道3为AstV，泳道4为AIV，泳道5为NDV，泳道6为ARV，泳道7为GPV，泳道8为GpoV，泳道9为GoCV。

具体实施方式

[0028] 应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

[0029] 正如背景技术所介绍的，2017年起，我国山东、安徽、江苏、辽宁、河南及广东等地雏鹅群爆发了一种以痛风为主要特征的传染性疾病。该病的症状不同于以往的星状病毒感染，首次在鹅群中出现了痛风的症状，由此推知，该传染性疾病可能是由新型星状病毒所引起的。目前尚无能够有效控制该新型星状病毒感染的药物和方法。采用星状病毒灭活疫苗接种是防治该病感染与爆发的有效措施，但前提是需要分离获得免疫原性优异的鹅星状病毒毒株。

[0030] 由于星状病毒为RNA病毒，有多个分段，不同毒株间在抗原结构、致病性、细胞培养特性以及宿主特异性上存在一定的差异，在遗传进化时，容易发生变异，导致传统毒株制备的疫苗不能很好的防控当今流行的以痛风为主要症状的鹅星状病毒感染。

[0031] 本申请发明人从病死雏鹅的肝脏、脾脏和肾脏等组织中分离出一株新型病毒N-AStV-SDPY，经鉴定该新型病毒N-AStV-SDPY为鹅星状病毒。本发明对毒株N-AStV-SDPY进行了全基因组测序，并与现有报道的星状病毒进行了同源性分析和遗传进化分析，结果发现，毒株N-AStV-SDPY各基因片段的同源性均小于70％；遗传进化分析表明，毒株N-AStV-SDPY处于一个变异分支；以上结果说明：毒株N-AStV-SDPY不同于其他的星状病毒，为禽星状病毒属的一个新的种。并将该新型鹅星状病毒保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V201808。利用现有的鹅星状病毒制备成灭活疫苗进行免疫，对该新型鹅星状病毒的预防和治疗效果非常不理想。本发明在该分离株的基础上，研制出了能够防治该新型鹅星状病毒的灭活疫苗。

[0032] 在本发明的一个实施方案中，给出的防治新型鹅星状病毒的灭活疫苗由如下方法制备而成：

[0033] (1)将保藏编号为CCTCC NO：V201808的鹅星状病毒接种到GKC细胞中，对鹅星状病毒进行增殖培养后，通过冻融破碎细胞，收取上清液，并进行纯化，获得鹅星状病毒株病毒液；

[0034] (2)将鹅星状病毒株病毒液灭活，加入Tween-80混合作为水相，水相中Tween-80的终浓度为2％-4％；以白油、硬脂酸铝和Span-80按质量比为94:2:6混合作为油相，将油相和水相按2:1混合均匀，8000r/min乳化20min，得到防治新型鹅星状病毒的灭活疫苗。

[0035] 上述灭活疫苗的制备方法中，采用GKC细胞对病毒进行培养，该细胞系对本发明的新型鹅星状病毒具有非常好的易感性，可连续传代，也可悬浮培养，生长状态好，有利于病毒的增殖及疫苗生产。

[0036] 佐剂是指加入到疫苗制剂后能有效促进、增强或延长机体对抗原特异性免疫应答的物质。佐剂的选择是疫苗乳化工艺的基础，稳定的疫苗乳剂能有效提高动物抵抗疫病的能力。因此，选择合适的佐剂，确定最佳的水相与油相比例，对于疫苗的稳定性具有重要意义。

[0037] 为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

[0038] 本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。本发明实施例中未注明具体实验条件和方法的，通常按照常规条件，如J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)；D.L.斯佩克特等主编，科学出版社，2001，细胞实验指南；或者按照制造厂商建议的条件。

[0039] 实施例1：新型鹅星状病毒的发现和鉴定

[0040] 1.材料与方法

[0041] 1.1病料采集与处理：

[0042] 取病死雏鹅肝脏、脾脏和肾脏等组织，按照1:4的比例加入无菌的生理盐水进行匀浆处理，将匀浆液置于冰箱反复冻融3次，6000r/min离心15min后取上清液，经0.22μm滤器过滤细菌后-20℃保存备用。

[0043] 1.2主要试剂：

[0044] 鹅胚购于山东聊城某鹅场，RNA提取试剂盒购于北京康为世纪有限公司，普通琼脂糖凝胶回收试剂盒购于北京全式金公司，反转录试剂盒购于宝生物(大连)有限公司，2×Es Taq MasterMix购于北京康为世纪有限公司，DL2000Marker购于宝生物(大连)有限公司。

[0045] 1.3引物设计：

[0046] 根据美国国家生物技术信息中心建立的基因序列数据库Genbank上所有星状病毒基因序列设计扩增601bp片段的特异性引物一对，由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

[0047] 上游引物：5′-TGG TGG TGY TTY CTC AAR A-3′；

[0048] 下游引物：5′-GYC KGT CAT CMC CRT ARC A-3′。

[0049] 注：Y、K、M、R为简并碱基。其中Y代表C/T；K代表G/T；M代表A/C；R代表A/G。

[0050] 1.4病毒分离：

[0051] 将获取的组织样品处理液经绒毛尿囊腔途径无菌接种13日龄鹅胚，0.2mL/枚；并用无菌生理盐水设置阴性对照，37℃孵育。每天照胚两次，弃掉24h内死亡鹅胚，连续观察6天。将死亡鹅胚置4℃过夜处理后无菌收取尿囊液，并观察胚体变化。组织处理液盲传三代进行后续检测。

[0052] 1.5PCR鉴定：

[0053] 1.5.1RNA提取：

[0054] 将1.4中收获的病毒液按照RNA提取试剂盒说明书要求，提取病毒RNA，置于-20℃保存备用。

[0055] 1.5.2反转录获得cDNA：

[0056] 所用反转录试剂盒采用来自宝生物(大连)有限公司的货号为RR036A的PrimeScriptTMRT Master Mix，在200μLPCR反应管中依次加入5×PrimeScript RT Master Mix×2μL，步骤1.5.1中提取的待测样品Total RNA～2μL，使用RNase Free dH2O补充至10μl体系。置于PCR仪中进行反应，反应条件为37℃15min；85℃5s之后，4℃保存。

[0057] 1.5.3PCR扩增：

[0058] 采用20μL体系进行扩增：模板cDNA×2μL，上、下游引物各×1μL，2×Es Taq MasterMix×10μL，采用ddH2O补充至20μL体系。混匀并瞬离后置于PCR仪进行反应，反应条件为95℃，5min，之后95℃，45s，68℃，30s，72℃，45s进行30个循环，72℃，10min之后4℃保存备用。

[0059] 2.结果：

[0060] 2.1病毒分离：

[0061] 采集的阳性肝脏、肾脏混合组织匀浆经过处理，经绒毛尿囊腔途径无菌接种13日龄鹅胚，0.2mL/枚；并用无菌生理盐水设置阴性对照，37℃孵育。在接种鹅胚2-5天出现了鹅胚死亡(见图1)，同批次空白对照鹅胚正常。

[0062] 2.2PCR鉴定结果：

[0063] 用引物进行PCR扩增后的产物在1％琼脂糖凝胶中电泳后出现了与预期值601bp大小相符的特异性条带(图2)。表明分离株的细胞培养物中存在新型星状病毒(AstV)。另外对分离株进行的常规鹅源病毒检测，包括：禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、呼肠孤病毒(ARV)、鹅细小病毒(GPV)、鹅多瘤病毒(GpoV)及鹅圆环病毒(GoCV)，并未检测到其他病毒污染(图2)。

[0064] 最终分离得到一株稳定的毒株，将该毒株命名为N-AStV-SDPY。采用二代测序技术对毒株N-AStV-SDPY进行全基因组序列测定，全基因组序列如SEQ ID NO.1所示。然后与现有技术中已公布的星状病毒进行同源性比对和遗传进化分析。结果表明，毒株N-AStV-SDPY各基因片段的同源性均小于70％；遗传进化分析表明，毒株N-AStV-SDPY处于一个变异分支；以上结果说明：毒株N-AStV-SDPY不同于其他的星状病毒，为禽星状病毒属的一个新的种。

[0065] 将该病毒进行保藏，保藏编号为CCTCC NO：V201808。

[0066] 实施例2：灭活疫苗的制备

[0067] (1)病毒的增殖与收获：

[0068] 将分离鉴定后的新型鹅星状病毒接种到生长良好的GKC细胞中，对该病毒进行大量增殖，获取足够的病毒液。将获得的足量细胞病毒液置于-20℃冷冻，经两次冻融后，收取细胞病毒液。

[0069] (2)病毒的纯化：

[0070] 用已建立的PCR、RT-PCR等检测方法，检测获取的病毒液中是否含其他常见病毒。检测项目包括禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、鹅细小病毒(GPV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)等，并通过使用相应抗体与病毒液进行中和，对种毒进行纯化。

[0071] (3)病毒液的灭活：

[0072] 菌检合格的病毒液用甲醛进行灭活，其最佳的灭活条件为加入终浓度0.2％的甲醛，37℃搅拌灭活16h。

[0073] (4)疫苗的制备：

[0074] ①油相的准备：取10号药用白油、硬脂酸铝(Aluminum tristearate)、司班-80(Span-80)按94：2：6混合，搅拌混匀后，高温高压灭菌。

[0075] ②水相的准备：将灭活的抗原液加入吐温-80(Tween-80)，振荡混匀，使Tween-80彻底溶解，水相中Tween-80的终浓度为2-4％。

[0076] ③乳化：油相和水相按2：1的比例混合，在超净台内将2份油相加入组织匀浆机，缓慢地将1份水相，期间不断搅拌，水相全部加入后6000rpm混合10min，再8000r/min乳化20min，分装备用，即制备得到灭活疫苗。

[0077] 实施例3：灭活疫苗的质量检验

[0078] 将实施例2制备的灭活疫苗进行包括：剂型、离心稳定性、粘度、无菌和保存期的质量检验，具体方法参考《中华人民共和国兽药典》(2015版)。

[0079] 结果为：本发明制备的灭活疫苗的剂型为油包水型(W/O)；离心稳定性、粘度和无菌检查符合《中华人民共和国兽药典》(2015版)的规定。

[0080] 实施例4：灭活疫苗的安全性检验

[0081] 取6日龄雏鹅20只，随机均分为2组，每组10只。其中第1组为实验组，腿部肌肉注射实施例2制备的灭活疫苗，0.5mL/只，第2组为对照组，腿部肌肉注射等量灭菌白油佐剂，接种后每日观察各组动物的精神状态，以及注射部位是否出现红肿热痛等局部炎症反应，持续观察2周，2周后对试验动物进行解剖，观察注射部位疫苗吸收情况。

[0082] 结果：实验组出现短暂的精神沉郁，但很快恢复，持续观察两周，试验组和对照组生长发育均正常，精神状态良好，剖检试验组发现注射部位疫苗吸收良好，无红肿、组织坏死等炎症反应。结果证明试制疫苗安全无害，对动物生长无影响。

[0083] 实施例5：灭活疫苗的保护性检验

[0084] 取6日龄雏鹅20只，随机均分为2组，每组30只。其中第1组为免疫组，腿部肌肉注射实施例2制备的灭活疫苗，0.5mL/只；第2组为对照组，腿部肌肉注射等量灭菌白油佐剂，在免疫后10日，对两组雏鹅腿部注射0.2mL新型鹅星状病毒液，并分组隔离饲养，观察两组雏鹅的精神状况及死亡情况。

[0085] 结果：免疫组出现短暂的精神沉郁，但未表现出鹅星状病毒病的临床症状，未有雏鹅死亡；对照组的雏鹅在攻毒后出现明显的临床症状(痛风)，死亡只数为5只，结果显示，本发明制备的灭活疫苗的免疫保护率能达到100％。

[0086] 实施例6：灭活疫苗的免疫持续期测定

[0087] 取6日龄雏鹅20只，随机均分为2组，每组10只。其中第1组为免疫组，每只腿部肌肉注射实施例2制备的灭活疫苗，0.5mL/只；第2组为对照组，腿部肌肉注射等量灭菌白油佐剂；免疫后每隔两天采集血清采用间接ELISA检测抗体。

[0088] 结果发现，免疫组的抗体水平在第5天的时候开始显著升高，第10天达到高峰，此后30天内稍有下降但仍维持较高水平；而对照组的抗体水平在整个实验中均为阴性。说明本发明的灭活疫苗能够在短时间内快速达到高浓度的抗体水平，且免疫持续期长，能够为雏鹅提供快速、长期的免疫保护。

[0089] 以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。