氨基酸酯化合物在制备抗CVB3病毒药物中的应用

摘要

本发明公开了一种氨基酸酯化合物在制备抗CVB3病毒药物中的应用，属于抗病毒药物技术领域。本发明通过大量的生物学实验验证，发现氨基酸酯化合物(甘氨酸乙酯、L‑亮氨酸甲酯、L‑丙氨酸甲酯、L‑丙氨酸叔丁酯、β‑丙氨酸乙酯、D‑亮氨酸甲酯、甘氨酸叔丁酯、β‑丙氨叔丁酯、L‑亮氨酸叔丁酯)能够抑制CVB3病毒在细胞内的复制增殖，并能强烈抑制CVB3病毒引起的细胞病变效应，提高感染细胞的存活率，其可用于制备抗CVB3病毒药物或治疗由CVB3病毒感染所引起的疾病的药物。本发明发现了氨基酸酯化合物新的制药用途，为开发抗CVB3病毒药物提供了新的方向。

权利要求

1.一种氨基酸酯化合物在制备抗CVB3病毒药物中的应用，其特征在于：所述的氨基酸酯化合物为甘氨酸乙酯、L-亮氨酸甲酯、L-丙氨酸甲酯、L-丙氨酸叔丁酯、β-丙氨酸乙酯、D-亮氨酸甲酯、甘氨酸叔丁酯、β-丙氨叔丁酯、L-亮氨酸叔丁酯。

说明书

氨基酸酯化合物在制备抗CVB3病毒药物中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及抗病毒药物技术领域，具体涉及氨基酸酯化合物在制备抗CVB3病毒药物中的应用。

背景技术

[0002] 柯萨奇病毒(Coxsaekievirus，CV)是小核糖核酸病毒(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus)成员，其感染可引起多种疾病，如手足口病、无菌性脑膜炎、脑炎、心肌炎、流行性肌炎痛、疱疹性咽峡炎等。已报道的CV共有29个血清型，根据其对乳鼠的致病特点及对细胞敏感性的不同，可将其分为A和B两组，即CVA(CVA1-22,24)和CVB(CVB1-6)。以CVBs的感染最为常见，其中CVB3是CVB六个血清型中致病性最强的一型，是病毒性心肌炎最主要的致病原因。据美国疾病预防控制中心(CDC)统计数据发现，CVB(1-6型)每年可导致约500万人患肠道系统疾病，其中10％-20％是由CVB3引起的急性心肌炎。近年来CVB3引起手足口病的趋势也在上升，在我国也有很多CVB3引发疾病流行的报道。目前对于柯萨奇病毒感染无特效药物，临床尚无有针对性的治疗手段。

[0003] 氨基酸酯是一类具有生物活性的有机化合物。氨基酸酯可用做羧基的活化和保护基团、药物或药物中间体、食品添加剂等，广泛应用于化工、医药、食品等诸多领域(Schu J,et.al.Bull Austral Math Soc，1991，43，153)。例如：氨基酸酯取代聚膦腈引入药物控释领域，该类聚合物的水解产物(磷酸盐、氨、以及氨基酸和醇)对哺乳动物细胞的增殖无不利影响，且可以通过引入不同种类、性质和数目的氨基酸酯取代基制得物理性质和降解性能大不相同、甚至完全相反的聚合物(Allcock H R,et.al.Chemistry and Application of Polyphosphazenes，2003，Chapter 1)；与用作生物医药及组织工程的传统材料相比，氨基酸酯取代聚膦腈最具有潜在的生物医用价值(Lakshmi St Katti D S,et.al.Advanced Drug Delivery Reviews,2003,55,467-482)；在前期研究中，我们设计合成了氨基酸酯高喜树碱A环10位引入氨基酸酯基以期增强其水溶性和抗肿瘤活性，体外抗肿瘤活性研究表明多个化合物优于阳性对照药，部分化合物在浓度100μg/mL时的抑制率甚至达到了100％(You L,et.al.Chinese Chemical Letters,2008,19,811-813)。然而氨基酸酯对于CVB3病毒的抑制活性到目前却未见报道。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于开发新的特异有效的抗CVB3药物，提供氨基酸酯化合物在制备抗柯萨奇病毒B3型(CVB3)药物中的应用。

[0005] 本发明通过大量的生物学实验验证，发现氨基酸酯化合物能够抑制CVB3病毒在细胞内的复制增殖，并能强烈抑制CVB3病毒引起的细胞病变效应，提高感染细胞的存活率。由此表明氨基酸酯化合物可以用于制备抗CVB3病毒感染的特异治疗药物。基于该发现，本发明提供了氨基酸酯化合物的如下制药用途：

[0006] 一种氨基酸酯化合物在制备抗CVB3病毒药物中的应用，所述的抗CVB3病毒包括抑制CVB3的复制增殖。

[0007] 一种氨基酸酯化合物在制备治疗由CVB3病毒感染所引起的疾病的药物中的应用，所述的疾病包括与CVB3病毒感染有关的手足口病、无菌性脑膜炎、脑炎、心肌炎、流行性肌炎痛、疱疹性咽峡炎等。

[0008] 所述氨基酸酯化合物包括甘氨酸乙酯(1)、L-亮氨酸甲酯(2)、L-丙氨酸甲酯(3)、L-丙氨酸叔丁酯(4)、β-丙氨酸乙酯(5)、D-亮氨酸甲酯(6)、甘氨酸叔丁酯(7)、β-丙氨叔丁酯(8)、L-亮氨酸叔丁酯(9)，这些化合物的化学结构式如下所示：

[0009]

[0010] 一种抗CVB3病毒药物，包括上述氨基酸酯化合物中的一种，或两种、多种的组合；进一步地，还包括这些氨基酸酯化合物药剂学可接受的辅料和载体。

[0011] 一种治疗由CVB3病毒感染所引起的疾病的药物，包括上述氨基酸酯化合物中的一种，或两种、多种的组合；进一步地，还包括这些氨基酸酯化合物药剂学可接受的辅料和载体。

[0012] 上述抗CVB3病毒药物或治疗由CVB3病毒感染所引起的疾病的药物的剂型包括颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂、分散剂。

[0013] 本发明具有以下优点和有益效果：

[0014] (1)氨基酸酯化合物的抗CVB3病毒活性未见报道，对其抗CVB3病毒活性的开发具有一定的导向作用。

[0015] (2)从结构相似的化合物中寻找抗CVB3药物，易于通过构效关系研究寻找到其作用靶点，为进一步药物开发提供一定的借鉴意义。

附图说明

[0016] 图1是不同氨基酸酯化合物对于CVB3作用的Hep-2细胞存活率影响的结果图。

[0017] 图2是甘氨酸乙酯(1)、L-亮氨酸甲酯(2)、β-丙氨酸乙酯(5)对于CVB3引起的Hep-2细胞CPE的抑制效应图。

[0018] 图3是β-丙氨酸乙酯(5)对于CVB3子代病毒产量抑制作用的结果图。

具体实施方式

[0019] 以下实施例用于进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

[0020] 实施例1氨基酸酯化合物抗CVB3活性分析

[0021] 所测试氨基酸酯化合物包括甘氨酸乙酯(1)、L-亮氨酸甲酯(2)、L-丙氨酸甲酯(3)、L-丙氨酸叔丁酯(4)、β-丙氨酸乙酯(5)、D-亮氨酸甲酯(6)、甘氨酸叔丁酯(7)、β-丙氨酸叔丁酯(8)、L-亮氨酸叔丁酯(9)。

[0022] (1)化合物对于宿主Hep-2细胞的毒性

[0023] 将Hep-2细胞铺板96孔板，在37℃、5％CO2培养箱培养长满单层后，弃去细胞培养液，分别加含不同浓度测试化合物(利巴韦林作为阳性对照药物)的细胞维持液继续培养，48h后显微镜目测并分别记录其细胞毒性，MTT法测定细胞存活率。MTT法具体步骤为：每孔加入MTT 30μL(5mg·mL-1)，孵育3-4h后去掉上清液，加入50μL的DMSO溶解沉淀。用酶标仪在
490nm处读取所对应的吸光度(OD490值)。

[0024] 用SPSS 11.5软件计算药物对于细胞的半数中毒浓度(Median cyctoxic concentration，CC50)。

[0025] 细胞存活率＝(药物组平均OD490值/细胞对照组平均OD490值)×100％。

[0026] (2)化合物对于CVB3的抑制活性

[0027] 将Hep-2细胞铺板96孔板，在37℃、5％CO2培养箱培养长满单层后，弃去培养液，100TCID50的CVB3病毒液感染细胞1.5h，加入不同浓度的测试化合物(利巴韦林作为阳性对照药物)孵育细胞。待继续培养约48h，病毒对照孔出现90％左右的CPE病变时，显微镜下观察细胞病变效应(CPE)。CPE的观察记录方法：无细胞病变记做-，25％以下细胞病变记做+，
25％-50％细胞病变记做++，50％-75％细胞病变记做+++，75％以上细胞病变记为++++。

[0028] CPE观察完毕后，利用MTT方法检测化合物对CVB3的抑制率。MTT方法具体步骤为：每孔加入MTT 30μL(5mg·mL-1)，孵育3-4h后去掉上清液，加入50μL的DMSO溶解沉淀。用酶标仪在490nm处读取所对应的吸光度(OD490值)。

[0029] 用SPSS 11.5软件计算药物的半数有效浓度(Concentration for 50％of maximal effect，EC50)。

[0030] 利用如下公式计算药物对CVB3的抑制率。

[0031]

[0032] (3)化合物的治疗指数(SI)

[0033] SI＝CC50/EC50，治疗指数越高，说明抗病毒潜力越大。

[0034] 结合细胞病变效应分析和MTT测定细胞存活率检测方法，对抗CVB3活性进行评估，结果见表1、图1和2。

[0035] 氨基酸酯化合物的细胞毒性及抗CVB3活性测试结果见表1。浓度依赖的氨基酸酯化合物对于CVB3作用的Hep-2细胞存活率的影响如图1所示。

[0036] 表1

[0037]

[0038] 结果表明这些氨基酸酯化合物对CVB3均有一定的抑制活性，其中化合物1(甘氨酸乙酯)、2(L-亮氨酸甲酯)、5(β-丙氨酸乙酯)具有较高的治疗指数，其抑制活性和阳性对照化合物利巴韦林基本相当。

[0039] 化合物1(甘氨酸乙酯)、2(L-亮氨酸甲酯)、5(β-丙氨酸乙酯)抑制CVB3引起的Hep-2细胞CPE效应如图2所示。CVB3感染的Hep-2细胞变圆，从细胞板壁脱离，而50μg/mL化合物1(甘氨酸乙酯)、2(L-亮氨酸甲酯)、5(β-丙氨酸乙酯)处理则可以很好的保护CVB3引起的细胞病变效应，表现出优良的抗CVB3活性。

[0040] 实施例2化合物5(β-丙氨酸乙酯)对于CVB3子代病毒产量的抑制

[0041] 对数生长期的Hep-2细胞铺板96孔板，长满单层后100TCID50 CVB3感染细胞，37℃孵育1.5h后移去病毒液，PBS洗涤三次，加入含50μg/mL的化合物5(β-丙氨酸乙酯)的细胞维持液。分别于12h和36h收集细胞和上清培养液，-20℃和37℃三次冻融裂解后，TCID50方法测定CVB3病毒滴度。

[0042] 结果如图3所示，病毒感染12h，可以检测到明显的子代病毒滴度，感染36h后，子代病毒滴度呈现大幅增长。而50μg/mL的5号化合物处理的Hep-2细胞相对于病毒对照组，12h时呈现出一定的抑制作用，直到36h病毒滴度无明显增加，表现出强烈的抑制效应，相对于病毒对照组下降约2.68log。

[0043] 通过上述实施例可知，氨基酸酯化合物有较强的抗CVB3活性，可以强烈抑制CVB3病毒引起的Hep-2细胞病变效应，大幅降低子代病毒产量。其中甘氨酸乙酯、L-亮氨酸甲酯、β-丙氨酸乙酯具有较高的治疗指数，有潜力制备临床上有效对抗CVB3感染的药物。

[0044] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。