利用物理方法激活特异性免疫的微米刺球及其制备方法

摘要

本发明提供了一种利用物理方法激活特异性免疫的微米刺球，其结构为：表面由纳米尖刺结构包裹球状微粒而成的微米级微米刺球。本发明的微米刺球可以通过物理刺激激活免疫系统，安全性高、稳定性好。

权利要求

1.一种利用物理方法激活特异性免疫的微米刺球的制备方法，其特征在于制备步骤为：第一步：将二氧化钛溶解在氢氧化钠水溶液中，搅拌30分钟后，在120℃下加热24小时，反应后，待溶液冷却至室温，将沉淀产物离心分离，洗涤，干燥，得到钛酸钠粉末，其为一维的钛酸钠纳米结构束；

第二步：将所述钛酸钠粉末与氢氧化钠和过氧化氢混合反应，磁力搅拌和超声波处理

30分钟后，在150℃下加热8小时，将沉淀产物离心分离，洗涤，得到钛酸钠微米刺球；

第三步：将所述钛酸钠微米刺球在60℃真空中干燥，然后加入过量的硝酸水溶液搅拌，得到产物H-钛酸微米刺球；

第四步：将所述H-钛酸微米刺球离心分离，洗涤，干燥，在400℃下煅烧，形成二氧化钛微米刺球；

所述第一步中，二氧化钛和氢氧化钠水溶液的比例为每0.2-5g的二氧化钛加入50-

80ml的浓度为8-12M的氢氧化钠水溶液中；

所述第二步中，钛酸钠与氢氧化钠、过氧化氢的比例为每0.2-0.5g钛酸钠加入20ml浓度为0.2-2M的氢氧化钠水溶液、以及1-5ml浓度为20-30％wt的过氧化氢水溶液；

所述微米刺球的结构为：表面由纳米尖刺结构包裹球状微粒而成的微米级微米刺球；

所述微米刺球的所述纳米尖刺直径为10-100nm、长度为50-500nm，所述球状微粒的直径为

1-5μm。

2.根据权利要求1所述的方法制得的微米刺球用于制备激活特异性免疫的免疫佐剂的用途。

3.根据权利要求1所述的方法制得的微米刺球用于制备增强疫苗效果的免疫佐剂的用途。

说明书

利用物理方法激活特异性免疫的微米刺球及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于医疗用品领域，具体涉及一种利用物理方法激活特异性免疫的微米刺球及其制备方法。

背景技术

[0002] 随着免疫学的研究与发展，多种新型疫苗在预防和治疗疾病上取得了重大进展，但由于免疫原性差，机体产生特异性免疫应答比较困难，通常需要能够增强免疫原性的佐剂辅助。佐剂是疫苗的重要组成部分，是一种添加剂或者载体，通过改善特异性免疫响应的水平或者刺激非特异性免疫而诱导有效的特异性免疫，同时，对宿主必须具备无毒、安全等的特点。在传统意义上，佐剂的主要功能是加速产生持久的免疫响应，提高免疫低下体系的免疫响应，减少抗原用量，降低免疫成本，促进产生亲合力和中和能力强的抗体，激活特异性细胞免疫反应等。对免疫佐剂的选择取决于免疫的目的，其中非特异性免疫应答在联结特异性免疫与危险信号时起着重要作用，激活非特异性免疫系统的分子如toll-like receptor,TLR激动剂已被广泛用作疫苗佐剂以提高疫苗免疫，诱导机体产生强效且持久的免疫应答。但是仍然存在复杂的工作机制，其高度依赖于特定的疫苗类型，也可能导致不良的安全问题。为了提高免疫佐剂的安全性和稳定性，纳米技术为疫苗的研制和开发提供了新的可能性，纳米颗粒的生物学特性之一是容易被多种细胞摄取，而由于纳米颗粒在维度上与微生物相当，它们能够更好地被细胞吞噬，把抗原更多地带入到细胞中，从而增强蛋白和多肽引起的免疫响应。纳米颗粒还可以增加小分子抗原的尺寸，并对其表面进行修饰。同时，某些类型的纳米颗粒自身对免疫系统就具有刺激作用。因此，纳米颗粒有可能发展成为一类新型的纳米佐剂。

[0003] 同时，微生物侵入过程中，免疫系统可以感知到危险信号，启动对感染的级联反应，最终形成特异性免疫来控制。这些微生物危险信号被统称为病原体相关分子模式(PAMPs)，它的关键作用是可以及时通知免疫系统关于侵略者的性质，还有助于免疫系统形成特异性免疫反应，包括体液和细胞反应。目前已知的PAMPs由相应受体感测的各种生物化学或微生物材料组成。而微生物的生物化学信号作为非特异性免疫反应的主要刺激已经得到了很好的研究，但是目前微生物的物理结构是否也在免疫系统的激活中发挥作用仍然未知。许多微生物具有从其表面突出的纳米尖刺状结构，这对于它们的粘附和感染是至关重要的。例如，流感病毒的球核上包裹有蛋白质峰，而许多细菌和酵母菌则被多毛而坚硬的菌毛或菌毛所覆盖。

[0004] 虽然微生物通过菌毛粘附于宿主细胞能刺激宿主产生炎症反应，但是很少有研究探索单独的类菌毛的物理结构是否有助于激发免疫反应，因为表面结构不能从微生物表面的生物化学成分中分离出来。了解物理结构和纳米形貌如何激活免疫反应，不仅可以深入了解微生物与免疫系统之间相互作用的全部范围，而且还可以将物理刺激发展成为超越传统免疫佐剂的新方法。

[0005] 现有的物理激活免疫细胞的方法有以下两种:(1)二维平面基板上的垂直的人造微/纳米图案或纳米尖刺结构，此方法是将细胞与基板共同培养，在培养过程中，细胞与垂直纳米尖刺顶部产生相互作用，然而，由于二维基板的限制，这种方法不适用于体内，所以不能完全揭示纳米尖刺结构如何影响免疫系统，在平面基板上的垂直纳米结构也不适合基于溶液的在体内递送信号给宿主细胞，因此不能用作增强疫苗接种或免疫治疗的物理刺激；(2)光滑微粒，它们缺乏明显的微生物的纳米结构特征，不适于探究纳米表面形貌结构对免疫细胞激活的影响，也不能用作增强疫苗接种或免疫治疗的物理刺激。

发明内容

[0006] 为了克服上述现有技术所存在的局限以及缺点，本发明提出了一种可以通过物理刺激激活免疫系统的微米刺球，该微米刺球安全性高、稳定性好。

[0007] 为此，本发明采用以下技术方案：

[0008] 一种利用物理方法激活特异性免疫的微米刺球，其结构为：表面由纳米尖刺结构包裹球状微粒而成的微米级微米刺球。

[0009] 优选地，所述微米刺球由二氧化钛、硅、金、硅酸镁、氧化铝、氧化硅、高分子化合物中的任意一种或多种制得，最优选由二氧化钛制得。

[0010] 经调研发现二氧化钛在食品、化妆品和制药行业中被广泛使用，是安全记录非常好的添加剂。它具有良好的生物相容性，可作为生物惰性材料，在应用中可以单独凸显独特的纳米结构对生物的影响，同时排除化学-生物相互作用的潜在干扰。因此选择二氧化钛来制作微米刺球。

[0011] 其他类似的生物相容性良好、不易引起副反应的材料，例如Si、Au、硅酸镁、氧化铝，氧化硅、高分子化合物等，可制备成微粒表面附着有纳米尖刺的结构，若也可以通过物理刺激激活免疫应答，那么也可以作为免疫佐剂。

[0012] 本发明还提供了所述微米刺球的制备方法。该制备方法为两步水热法，具体包括以下步骤：

[0013] 第一步：将TiO2溶解在氢氧化钠水溶液中，搅拌30分钟后，在120℃下加热24小时，反应后，待溶液冷却至室温，将沉淀产物离心分离，洗涤，干燥，得到钛酸钠粉末，其为一维的钛酸钠纳米结构束。

[0014] 第二步：将所述钛酸钠粉末与氢氧化钠和过氧化氢水溶液混合反应，磁力搅拌和超声波处理30分钟后，在150℃下加热8小时，将沉淀产物离心分离，洗涤，得到钛酸钠微米刺球；

[0015] 第三步：将钛酸钠微米刺球在60℃真空中干燥，然后加入过量的HNO3水溶液搅拌，得到产物H-钛酸微米刺球。

[0016] 第四步：将H-钛酸微米刺球离心分离，洗涤，干燥，在400℃下煅烧，形成二氧化钛微米刺球。

[0017] 优选地，所述第一步中，二氧化钛和氢氧化钠水溶液的比例为每0.2-5g的二氧化钛加入50-80ml的浓度为8-12M的氢氧化钠水溶液中。最优选的比例为每2-3g二氧化钛加入50ml浓度为10M的氢氧化钠水溶液中。

[0018] 优选地，所述第二步中，钛酸钠与氢氧化钠、过氧化氢的比例为每0.2-0.5g钛酸钠加入20ml浓度为0.2-2M的氢氧化钠水溶液、以及1-5ml浓度为20-30％wt的过氧化氢水溶液。最优选的比例为每0.3g钛酸钠加入20ml浓度为1-1.5M的氢氧化钠水溶液、以及2ml浓度为30％wt的过氧化氢水溶液。

[0019] 该方法还可进一步包括以下步骤：将二氧化钛微米刺球放于无菌水中，通过离心机分离选择合适尺寸的微米刺球。本发明优选纳米尖刺直径约10-100nm、长度约50-500nm、微粒直径大小约1-5μm的微米刺球。

[0020] 在本发明的另一个方面，本发明还提供了所述微米刺球作为用于激活特异性免疫的免疫佐剂的用途。

[0021] 在本发明的又一个方面，本发明还提供了所述微米刺球作为用于增强疫苗效果的免疫佐剂的用途。

[0022] 本发明提出了一种可以利用物理刺激激活免疫系统的微米刺球结构，该结构不仅能最大程度的模拟微生物的表面纳米形貌，而且能在溶液中悬浮并与免疫细胞作用。经实验证明，该微米刺球结构既可以在体外触发免疫细胞的炎症反应，也可在体内增强免疫系统的特异性免疫。所以它可以作为物理刺激激活免疫应答。由于它在维度上与微生物相当，能够更好地被细胞吞噬，把抗原更多地带入到细胞中，从而增强蛋白和多肽引起的免疫响应，可以作为一种新型的安全性高、稳定性好、通过物理刺激激活免疫应答的免疫佐剂。

附图说明

[0023] 图1是根据本发明的微米刺球的模型图。

[0024] 图2是根据本发明的微米刺球的实物图。

具体实施方式

[0025] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详述，但本发明并不限于以下实施例。

[0026] 如图1所示，根据本发明的微米刺球为微米级，其是表面由纳米尖刺结构包裹球状微粒而成。

[0027] 以二氧化钛微米刺球为例，说明根据本发明的微米刺球的制备方法。该制备方法为两步水热法，具体步骤如下：

[0028] (1)第一步水热法：将TiO2(2-3g)溶解在NaOH(浓度10M/50ml)溶液中。将该悬浮液搅拌30分钟并转移到聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压釜中。将高压釜置于烘箱中并在120℃下加热24小时。反应后，待溶液冷却至室温，将沉淀产物离心分离，然后用去离子水洗涤至pH值为约10.5。再将沉淀产物在60℃真空中干燥。所得产物是一维的钛酸钠纳米结构束。

[0029] (2)第二步水热法：让钛酸钠粉末(0.3g)与NaOH水溶液(浓度1-1.5M/20ml)和H2O2(浓度30％/2ml)溶液的混合物反应。在磁力搅拌和超声波处理30分钟后，将悬浮液转移到聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压釜中，并在150℃下加热8小时。将沉淀产物离心分离，然后用去离子水洗涤至pH约为7。所得产物是钛酸钠微米刺球。

[0030] (3)将钛酸钠微米刺球在60℃真空中干燥，然后将产物用过量的HNO3(浓度0.01-1M，优选0.2-0.6M)溶液搅拌处理，得到产物H-钛酸微米刺球。

[0031] (4)将H-钛酸微米刺球离心分离，洗涤至少5次，干燥，在400℃下煅烧1小时，形成二氧化钛微米刺球。

[0032] (5)将二氧化钛微米刺球放于无菌水中，通过离心机分离可选择合适尺寸的微米刺球。本发明选择直径约10-100nm、长度50-500nm的纳米尖刺，微粒大小1-5um的微米刺球，如图2所示。

[0033] 以下通过实验验证本发明的微米刺球的安全性和诱导免疫效果。

[0034] 首先通过安全性检测，确认微米刺球佐剂对细胞的生命活性无影响，以确保后期对免疫细胞和免疫系统的刺激作用只与其结构有关，可排除生物-化学相互作用的干扰。然后通过对微米刺球佐剂对免疫细胞和免疫系统作用机理的研究，我们验证了微米刺球能有效的诱导炎性体活化，释放大量的IL-1β，即可通过物理结构激活免疫细胞的炎症反应；能上调树突细胞的CD40表达，促进其成熟向特异性免疫细胞呈递抗原；在体内还能增强CD8+T细胞的应答和Th1免疫应答。这是微米刺球可以作为新型免疫佐剂的理论基础。

[0035] 为了验证微米刺球佐剂-微米刺球增强疫苗的功能，我们将微米刺球加入疫苗中，用未添加的疫苗作对比，注射入小鼠体内，一段时间后检测小鼠体内血清中相应抗体的滴度变化。有添加微米刺球的疫苗作用的小鼠血清内抗体滴度明显高于未添加的小鼠，即微米刺球可通过物理刺激作为一种新型的安全性高，稳定性强的疫苗。

[0036] 实施例1：微米刺球佐剂对细胞生命活性的影响

[0037] 实验过程：

[0038] 步骤一：将刺激因子(M-CSF)与来自C57BL/6小鼠品系的骨髓细胞培养7天生成巨噬细胞(BMM)。

[0039] 步骤二：先将BMM细胞与0.005-0.8个颗粒/μm2的微米刺球共同培养一段时间。然后用不同染料对BMM细胞进行染色，如下：活细胞被钙黄绿素染成绿色，死细胞被溴化乙锭染成红色，细胞核被Hoechst染成蓝色，细胞核的数量即所有细胞的总数。

[0040] 实验结果：

[0041] (1)48小时后，超过90％的细胞存活良好，与无微米刺球情况下的对照组存活情况相当。而且用微米刺球处理的BMM显示出与对照组细胞类似的扩散形态。

[0042] (2)96小时后，与对照组的细胞相比，用微米刺球(0.04和0.08颗粒/μm2)处理的细胞没有显示明显的细胞毒性。

[0043] 这些结果表明，在测试的剂量下，微米刺球佐剂对BMM的生命活性没有影响。

[0044] 补充：粗糙微粒和纳米刺的制作方法——用超声波处理水中的微米刺球12小时以除去表面上的纳米刺。将溶液在5000rpm下离心2分钟，收集含有超声波破碎的纳米钉的上层溶液作为纳米刺样品、沉淀物为粗糙微粒；然后用无菌水洗涤。粗糙微粒重复用离心机处理和洗涤至少5次。

[0045] 实施例2：微米刺球佐剂刺激巨噬细胞产生炎症反应

[0046] 炎性体是检测微生物和环境刺激的主要天然免疫蛋白复合体之一，它的活化会促进炎性因子的释放，从而激活炎症反应。例如，炎性体的活化能使pro caspase-1裂解为成熟的caspase-1，而活化的caspase-1能够调控IL-1β的加工和分泌。

[0047] 实验过程：

[0048] 步骤一：先用LPS预处理BMMs以提高pro-IL-1β的水平，然后将BMMs分别与密度0.001至0.08个粒子/μm2的微米刺球、粗糙微粒以及纳米刺一起培养18小时(粗糙微粒和纳米刺均作对照)。

[0049] 步骤二：将密度0.001至0.08个粒子/μm2的微米刺球与caspase-1基因敲除小鼠品系的巨噬细胞共同培养18小时。

[0050] 实验结果：

[0051] (1)与空白对照组相比，微米刺球能有效的诱导大量IL-1β的释放，与炎性体活化导致的IL-1β释放的情况一致；而所有剂量的粗糙微粒和纳米刺都不能有效的诱导IL-1β的释放。

[0052] (2)微米刺球不能诱导caspase-1基因敲除小鼠品系的巨噬细胞释放IL-1β。

[0053] 这些结果表明微米刺球诱导IL-1β释放的机制与普通的炎症机制相同，依赖于caspase-1。微米刺球上的纳米刺可以激活炎症反应，而相同密度和大小的粗糙微粒和纳米刺却不能。(炎症的激活不可能是由微米刺球积聚的差异所致，因为粗糙微粒在细胞中的积累量高于微米刺球。)

[0054] 实施例3：微米刺球佐剂促进树突细胞成熟

[0055] 树突细胞是诱导特异性免疫反应的核心，而炎性体活化是促进树突细胞(DC)成熟的重要因素。

[0056] 实验过程：

[0057] 步骤一：首先用单磷酰脂质A(MPL)、无毒的LPS和FDA批准的疫苗佐剂预处理BMDC(来自小鼠骨髓的树突细胞)，以增加炎性体组分的基础水平；然后将微米刺球与BMDC一起孵育12小时，再分析树突细胞成熟标记CD40、CD80和CD86。

[0058] 步骤二：将微米刺球和MPL混合物中微米刺球的结构破坏，然后与BMDC一起孵育12小时，再分析树突细胞成熟标记CD40、CD80和CD86。

[0059] 步骤三：将微米刺球与缺少TLR信号通路中的两个关键蛋白(MyD88和TRIF)的BMDC一起孵育12小时，再分析树突细胞成熟标记CD40、CD80和CD86。

[0060] 步骤四：将微米刺球与caspase1基因敲除小鼠品系的BMDC一起孵育12小时，再分析树突细胞成熟标记CD40、CD80和CD86。

[0061] 实验结果：

[0062] (1)与单独用MPL处理的BMDC相比，微米刺球和MPL结合显著增强了CD40的表达，但对CD80和CD86的影响很小。

[0063] (2)如果微米刺球的结构被破坏(微米刺球结构被破坏成粗糙微粒和纳米刺)，则CD40的上调大大减少，这表明粗糙微粒、纳米刺和MPL结合处理的细胞中CD40的表达较低。

[0064] (3)在缺少TLR信号通路中的两个关键蛋白(MyD88和TRIF)的BMDC中，CD40的上调也受损，与用MPL通过TLR4激活先天性免疫应答一致。

[0065] (4)来自caspase1-/-小鼠的BMDC中，CD40的表达也受到微米刺球和MPL刺激，尽管程度略低，这可能是因为微米刺球引起的炎性体激活减少。

[0066] 这些结果表明：微米刺球诱导的IL-1β能够上调CD40，促进树突细胞成熟。

[0067] 实施例4：微米刺球佐剂在体内增强特异性免疫

[0068] CD40是一种重要的共刺激蛋白，能够将来自CD4+T细胞的“许可”信号转化为DC，促进蛋白质抗原交叉呈递进MHC I途径，这对于诱导细胞内病原体和癌细胞反应的CD8+T细胞是至关重要的。但是由于不充分的交叉呈现，广泛使用的灭活疫苗基本无法实现。以下实验用于探究微米刺球在体内引起强烈的CD8+T细胞免疫应答的可能机制。

[0069] 实验过程：用卵清蛋白(OVA)(一种模型蛋白疫苗)、MPL和微米刺球的结合作为疫苗佐剂(OVA+MPL+Spiky)注射入小鼠体内。通过测量IFNγ生成量评估Th1CD4+辅助性T细胞应答，IL-4生成量Th2CD4+辅助性T细胞应答。

[0070] 实验结果：结果显示IFNγ在纳米刺球刺激后7天显着增加，但是IL-4生成量所指示的Th2CD4+辅助性T细胞应答却无明显变化。

[0071] 1)组合(OVA+MPL+Spiky)可诱导更强的CD4+T细胞应答，与单独的MPL(OVA+MPL)或单独的微米刺球(OVA+Spiky)相比。

[0072] 2)OVA+MPL+Spiky诱导CD8+T细胞应答效果显著，而OVA+MPL和OVA+Spiky诱导CD8+T细胞反应都不会强于对照组(单独的OVA)。

[0073] 3)14天后，与其他组相比，OVA+MPL+Spiky增强了IgG2c的抗体滴度(Th1免疫应答的指标)，而没有进一步提高IgG1抗体滴度(Th2免疫应答的指标)。

[0074] 微米刺球对Th1免疫应答和CD8+T细胞应答的激活暗示了在接种和免疫治疗中微米刺球作为免疫佐剂的潜力。