一种烷氧基联苯α,β-不饱和酰胺类化合物、其制备方法及医药用途

摘要

本发明涉及一种烷氧基联苯α,β‑不饱和酰胺类化合物、其制备方法及医药用途，属于药物化学和药物治疗学领域。本发明提供的式I所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备与抗氧化有关疾病的药物方面的应用，特别是在制备抗炎药物或抗氧化药物方面的应用。

权利要求

1.式I所示的一种烷氧基联苯α,β-不饱和酰胺类化合物或其药学上可接受的盐：其中，

R1代表氢原子或氰基；

R2代表C1-C6烷基、苯基、苄基、苯乙基、苯丙基、取代C1-C6烷基、取代苯基、取代苄基、取代苯乙基、取代苯丙基或取代芳杂环，所述的取代C1-C6烷基、取代苯基、取代苄基、取代苯乙基、取代苯丙基或取代芳杂环可任意地由下述取代基单取代或多取代：C1-C4烷氧基、羟基、卤素或-(CH2)mNR3R4；

m代表1-3的整数；

R3或R4分别独立地代表C1-C6烷基，或NR3R4一起形成取代或非取代的5至7元脂肪杂环；

其取代基选自C1-C4烷基、苯基或苄基。

2.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R2代表下述基团：R5、R6或R7分别独立地代表氢原子、C1-C4烷氧基、卤素或-(CH2)mNR3R4；m代表1-3的整数；

n代表1-3的整数。

3.根据权利要求2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中，R5、R6或R7分别独立地代表氢原子、甲氧基、乙氧基、氟、氯或-(CH2)mNR3R4。

4.根据权利要求2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中，R5、R6或R7分别独立地代表氢原子、甲氧基或乙氧基。

5.根据权利要求2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中，m代表1或2。

6.根据权利要求2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中，n代表1或2。

7.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R2代表C1-C4烷基或取代C1-C4烷基，所述的取代C1-C4烷基可任意地由下述取代基单取代或多取代：甲氧基、乙氧基、羟基、氟或氯。

8.根据权利要求2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R3或R4分别独立地代表C1-C4烷基，或NR3R4一起形成取代或非取代的5至7元脂肪杂环；其取代基选自C1-C3烷基、苯基或苄基。

9.根据权利要求2所述的化合物或其药学上可接受的盐，所述5至7元脂肪杂环选自吗啉环、哌嗪环、吡咯环或哌啶环。

10.根据权利要求1、2、3或8所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中述化合物选自：(E)-5'-(3-(2-甲氧基苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

(E)-5'-(3-(3,4-二甲氧基苯乙基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

(E)-5'-(3-(3,4,5-三甲氧基苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

(E)-5'-(3-(4-甲氧基苄基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

(E)-5'-(3-(3-氯-4-氟苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

(E)-5'-(3-(4-甲氧基苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

(E)-5'-(3-丁氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

(E)-5'-(3-(3,4-二甲氧基苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

(E)-5'-(2-氰基-3-(2-甲氧基苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

(E)-5'-(2-氰基-3-(3,4-二甲氧基苯乙基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-

4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

(E)-5'-(2-氰基-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-

4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

(E)-5'-(2-氰基-3-(4-甲氧基苄基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

(E)-5'-(2-氰基-3-(3-氯-4-氟苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

(E)-5'-(2-氰基-3-(4-甲氧基苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

(E)-5'-(2-氰基-3-丁氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,

3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

(E)-5'-(2-氰基-3-(3,4-二甲氧基苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,

4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯。

11.根据权利要求10所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中述化合物选自：(E)-5'-(3-(2-甲氧基苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

(E)-5'-(3-(3,4-二甲氧基苯乙基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

(E)-5'-(3-(3,4,5-三甲氧基苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

(E)-5'-(3-(4-甲氧基苄基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

(E)-5'-(3-(4-甲氧基苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

(E)-5'-(3-丁氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

(E)-5'-(3-(3,4-二甲氧基苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

(E)-5'-(2-氰基-3-(2-甲氧基苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

(E)-5'-(2-氰基-3-(3,4-二甲氧基苯乙基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-

4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

(E)-5'-(2-氰基-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-

4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

(E)-5'-(2-氰基-3-(4-甲氧基苄基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

(E)-5'-(2-氰基-3-(4-甲氧基苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

(E)-5'-(2-氰基-3-丁氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,

3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

(E)-5'-(2-氰基-3-(3,4-二甲氧基苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,

4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯。

12.一种如权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，当R1为氢原子、X为-NH-时，通式I所示化合物的制备方法包括以下步骤a)或步骤b)：a)式VII化合物与丙二酸进行克脑文格尔反应生成化合物VIII，然后与取代苯胺反应生成通式I化合物；合成路线如下：b)式VIII化合物先与4-羟基苯胺进行酰胺化反应生成中间产物IX化合物，IX化合物再与甲醛及胺经Mannich反应生成通式I化合物；合成路线如下：当R1为氰基、X为-NH-时，通式I所示化合物的制备方法包括步骤c)或步骤d)：c)式化合物VII与氰乙酸反应生成产物X，然后通过一步酰氯化反应再与取代苯胺反应生成通式I化合物，合成路线如下：d)式化合物X与中间体对氨基苯酚反应生成化合物XI，XI化合物再与甲醛及胺经Mannich反应生成通式I化合物，合成路线如下：其中，n代表1-3的整数；R代表氢原子、C1-C4烷氧基、羟基、卤素或-(CH2)mNR3R4。

13.一种药物组合物，它以权利要求1、2、3或8所述的化合物或其药学上可接受的盐为活性成分或主要活性成分，辅以药学上可接受的载体。

14.权利要求1、2、3或8所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备与抗氧化有关疾病的药物方面的应用。

15.权利要求1、2、3或8所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备抗炎药物或抗氧化药物方面的应用。

说明书

一种烷氧基联苯α,β-不饱和酰胺类化合物、其制备方法及医

药用途

技术领域

[0001] 本发明属于药物化学和药物治疗学领域，具体涉及一种烷氧基联苯α,β-不饱和酰胺类化合物。该类化合物具有抗氧化的作用。本发明还涉及该类化合物的制备方法以及含有它们的药物组合。

背景技术

[0002] 氧化应激(Oxidative Stress)是指机体细胞遭受体内外环境刺激后，氧化和抗氧化防御系统之间的平衡被破坏，从而促进细胞内活性氧分子(ROS)、活性氮(RNS)和机体脂质过氧化物的大量产生和积累，造成机体组织细胞及蛋白和核酸等生物大分子损伤。此外，氧化应激的发生又可以增加炎性细胞因子的产生，进而刺激更多自由基的产生，进一步损伤组织细胞(Biochem Pharmacol,2015,95,156-169,Br J Pharmacol,2015,172,1087-1100,Toxicol Appl Pharmacol,2015,282,129-138,Kidney Int,2013,83,1029-1041)。而近年来文献调研显示，氧化应激是导致糖尿病肾病，肿瘤，心血管，免疫以及中枢神经性疾病的重要原因(Anal Bioanal Chem,2015,407,2569-2579,Eur J Pharmacol,2017,801,9-
18,Free Radic Biol Med,2017,106,38-52)。因而，通过研究开发应对氧化应激所引起的疾病的药物对于疾病的预防和治疗具有重要意义。

[0003] 研究显示，Keap1-Nrf2-ARE是参与调控氧化应激及炎症的重要信号通路(Med Res Rev,2016,36,924-964,Sci Rep,2015,5,12377)。Nrf2(Nuclear factor erythroid 2 p45-related factor 2)属于CNC亮氨酸拉链转录激活因子家族，与抗氧化反应、抗炎反应及细胞保护作用等密切有关。Keap1是Nrf2在细胞质中的结合蛋白，并与肌动蛋白结合锚定于胞浆中，其含有的IVR区富含半胱氨酸，是整个蛋白的功能调节区。稳态时，Nrf2水平主要受Keap1的负反馈调节，Keap1通过其BTB区结合泛素连接酶Cul3，将Nrf2泛素化降解到正常水平。在应激状态如氧化应激、化学应激、高氧等情况下，氧化剂或亲电体通过改变Keap1构象，扰乱Keap1与Nrf2之间的连接，使Nrf2游离出来，进入胞核与抗氧化反应元件ARE相互作用进而上调下游相关抗氧化基因如HO-1，NQO-1，SOD等的表达，发挥抗炎抗氧化的作用(Pharmacol Res,2015,91,104-114)。此外，Nrf2的激活也能够抑制核因子NF-κB的活性，从而抑制炎症的发生、发展。因此，Keap1-Nrf2-ARE信号通路成为了开发抗氧化及炎症小分子的重要靶标。

[0004] 研究表明，含有迈克尔受体的小分子，如查尔酮类化合物，是许多食用植物和中草药的主要成分，具有多种生物活性且安全性较高，研究发现其可通过激活Keapl-Nrf2-ARE通路，进而表现出一定的抗氧化和抗炎的活性(Org Biomol Chem,2015,13,3040-3047)。查尔酮结构中的α,β-不饱和酮结构是典型的迈克尔受体，含有该类结构的化合物通过与体内多种生物大分子亲核性基团(如Keap1中半胱氨酸残基的巯基)发生迈克尔加成反应，形成共价结合，进而调控相关信号通路，发挥疾病防治的作用(J Med Chem,2015,58,4738-4748)。并且，查尔酮结构中的迈克尔受体是一种软亲电子体，不宜被氨基、羟基类亲核体进攻，易于被巯基这类软亲核分子进攻(J Med Chem,2011,54,4147-4159)。其中研究最为深入的是齐墩果酸衍生物CDDO-Me，其通过构建两个迈克尔受体从而显示出较好的激活Nrf2活性，不过由于其三期临床出现致死案例而被迫中止(Nephrol Dial Transplant,2014,29 
119-124,J Med Chem,2016,59,2396-2409)。但其构建的迈克尔受体结构仍为设计预防DN的Nrf2激活剂提供一个新颖的思路。

[0005] 荜茇酰胺是一种带有两个α,β不饱和酰胺结构的天然生物碱，反式荜茇酰胺是自然界中的主要存在形式，对肿瘤细胞有较高的毒活性，可以通过靶向氧化还原反应途经来发挥抗肿瘤作用(Toxicology in Vitro,2009,23,1085-1091)。2015年，sun等人通过对荜茇酰胺结构修饰合成一系列衍生物，通过实验研究其抗炎活性，发现其结构中的两个迈克尔受体是发挥抗炎活性必不可少的结构体(Biochem Pharmacol,2015,95,156-169)。然而，即使荜茇酰胺具有多种生物活性，但其高细胞毒活性限制了其在细胞保护方面的应用(Antioxid Redox Signal,2010,13,1665-1678)。不过2015年，兰州大学Fang课题组为了降低细胞毒活性，通过去除荜茇酰胺结构中环上的迈克尔受体，合成了一系列荜茇酰胺类衍生物，首次研究其在神经保护功能方面的作用，研究结果显示改造后的化合物能够有效诱导II相解毒酶的表达，进而抑制H2O2或6-OHDA诱导的ROS的蓄积及PC12的细胞凋亡(J Med Chem,2015,58,5242-5255)。

[0006] 此外，研究发现含有烷氧结构的天然产物如五味子醇甲、五味子乙素、五味子丙素、联苯双脂、天然植物木蓼提取物等也具有很好的抗炎、抗氧化、抗肿瘤的生物活性(Drug Metab Dispos,2014,42,1982-1990,J Nat Prod,2016,79,3065-3071,中国药理学报,2016,37,382-389)。

[0007] 近年来对于Keap1-Nrf2-ARE发挥抗炎抗氧化作用的关注越来越多，但令人遗憾的是，真正能够进入临床用于治疗的却是很少。根据其作用机制研究，目前主要有三类药物(Journal of Medicinal Chemistry,2015,58,4738-4748)：(1)不可逆的共价药物，即通过共价键与其蛋白质靶标永久结合。此类不可逆的共价药物具有长的作用时间，高效力和高配体效率，但正是因为它们不可逆地结合于蛋白质靶标上，所以存在免疫介导的超敏反应的可能性，因此这样的药物不适用于慢性给药；(2)可逆的非共价药物，即通过非共价键(例如氢键，疏水效应和范德华力)与蛋白质靶标可逆结合。此类化合物不会形成永久性结合，因此适用于慢性给药，同时也就显示出中等的选择性和活性，以及具有较差的配体效率等缺点；(3)可逆共价药物，这类是最新的并且由于其独特性质而引起广泛的研究兴趣。目前，具有迈克尔受体的富马酸二甲酯(DMF)是Keap1/Nrf2/ARE通路的激活剂，是临床上用于治疗多发性硬化症的唯一药物。CDDO和甲基巴多索隆也属于这一类。此类化合物克服了不可逆共价和可逆非共价药物的缺点显示出较好的生物活性和化学反应性。尽管如此，由于缺乏反应性化合物与蛋白质靶标的可逆共价结合，所以可逆共价药物在很大程度上被忽视。

发明内容

[0008] 本发明的目的是在现有技术的基础上，以源自五味子丙素的烷氧基联苯类化合物联苯双酯(DDB)为先导物，在保留联苯双酯的烷氧基联苯药效团的基础上，利用新药设计的生物电子等排、骨架迁移及前药设计等原理，并通过改变迈克尔受体的电子云密度等使其更容易被Keap1的半胱氨酸残基的巯基进攻，进而设计合成了一系列烷氧基联苯α,β-不饱和酰胺类化合物。生物活性测试结果表明，该类化合物具有显著的激活Nrf2发挥抗氧化的效应，其活性显著高于阳性对照药物。

[0009] 本发明的另一目的是提供一种上述烷氧基联苯α,β-不饱和酰胺类化合物的制备方法。

[0010] 本发明的第三个目的是提供一种上述烷氧基联苯α,β-不饱和酰胺类化合物在医药方面的用途。

[0011] 本发明的技术方案如下：

[0012] 式I所示的一种烷氧基联苯α,β-不饱和酰胺类化合物或其药学上可接受的盐：

[0013]

[0014] 其中，

[0015] X代表-NH-，O或S原子；

[0016] R1代表氢原子、氰基、硝基、羟基或卤素；

[0017] R2代表C1-C6烷基、苯基、苄基、苯乙基、苯丙基、取代C1-C6烷基、取代苯基、取代苄基、取代苯乙基、取代苯丙基或取代芳杂环，所述的取代C1-C6烷基、取代苯基、取代苄基、取代苯乙基、取代苯丙基或取代芳杂环可任意地由下述取代基单取代或多取代：C1-C4烷氧基、3 4
羟基、卤素或-(CH2)mNRR；

[0018] m代表1-3的整数；

[0019] R3或R4分别独立地代表C1-C6烷基，或NR3R4一起形成取代或非取代的5至7元脂肪杂环；其取代基选自C1-C4烷基、苯基或苄基。

[0020] 在一种优选方案中，R1代表代表氢原子、氰基或卤素。

[0021] 在一种更优选方案中，R1代表代表氢原子或氰基。

[0022] 在一种优选方案中，其中R2代表下述基团：

[0023]

[0024] R5、R6或R7分别独立地代表氢原子、C1-C4烷氧基、卤素或-(CH2)nNR3R4。

[0025] 在一种更优选方案中，R5、R6或R7分别独立地代表氢原子、甲氧基、乙氧基、氟、氯或-(CH2)mNR3R4。

[0026] 在一种特别更优选方案中，R5、R6或R7分别独立地代表氢原子、甲氧基或乙氧基。

[0027] 在本发明中，m代表1-3的整数；优选地，m代表1或2。

[0028] 在本发明中，n代表1-3的整数；优选地，n代表1或2。

[0029] 在另一种优选方案中，其中R2代表C1-C4烷基或取代C1-C4烷基，所述的取代C1-C4烷基可任意地由下述取代基单取代或多取代：甲氧基、乙氧基、羟基、氟或氯。

[0030] 在一种优选方案中，R3和R4可相同或不同，R3或R4分别独立地代表C1-C4烷基，或NR3R4一起形成取代或非取代的5至7元脂肪杂环；其取代基选自C1-C3烷基、苯基或苄基。

[0031] 在一种更优选方案中，R3或R4分别独立地代表C1-C3烷基，或NR3R4一起形成取代或非取代的5至7元脂肪杂环，这些5至7元脂肪杂环包括但不限于吗啉环、哌嗪环、吡咯环或哌啶环；其取代基选自C1-C3烷基、苯基或苄基，例如甲基、苯基或苄基，特别是4-甲基或苯基。

[0032] 进一步地，在通式I所述化合物或其药学上可接受的盐中，所述化合物选自下列化合物：

[0033] (E)-5'-(3-(2-甲氧基苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

[0034] (E)-5'-(3-(3,4-二甲氧基苯乙基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

[0035] (E)-5'-(3-(3,4,5-三甲氧基苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

[0036] (E)-5'-(3-(4-甲氧基苄基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

[0037] (E)-5'-(3-(3-氯-4-氟苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

[0038] (E)-5'-(3-(4-甲氧基苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

[0039] (E)-5'-(3-丁氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

[0040] (E)-5'-(3-(3,4-二甲氧基苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

[0041] (E)-5'-(2-氰基-3-(2-甲氧基苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

[0042] (E)-5'-(2-氰基-3-(3,4-二甲氧基苯乙基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

[0043] (E)-5'-(2-氰基-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

[0044] (E)-5'-(2-氰基-3-(4-甲氧基苄基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

[0045] (E)-5'-(2-氰基-3-(3-氯-4-氟苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

[0046] (E)-5'-(2-氰基-3-(4-甲氧基苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

[0047] (E)-5'-(2-氰基-3-丁氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

[0048] (E)-5'-(2-氰基-3-(3,4-二甲氧基苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；

[0049] 更进一步地，通式I所述化合物进一步选自下列化合物

[0050] (E)-5'-(3-(2-甲氧基苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；(1a)

[0051] (E)-5'-(3-(3,4-二甲氧基苯乙基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；(1b)

[0052] (E)-5'-(3-(3,4,5-三甲氧基苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；(1c)

[0053] (E)-5'-(3-(4-甲氧基苄基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；(1d)

[0054] (E)-5'-(3-(4-甲氧基苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；(1e)

[0055] (E)-5'-(3-丁氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；(1f)

[0056] (E)-5'-(3-(3,4-二甲氧基苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；(1g)

[0057] (E)-5'-(2-氰基-3-(2-甲氧基苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；(2a)

[0058] (E)-5'-(2-氰基-3-(3,4-二甲氧基苯乙基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；(2b)

[0059] (E)-5'-(2-氰基-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；(2c)

[0060] (E)-5'-(2-氰基-3-(4-甲氧基苄基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；(2d)

[0061] (E)-5'-(2-氰基-3-(4-甲氧基苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；(2e)

[0062] (E)-5'-(2-氰基-3-丁氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；(2f)

[0063] (E)-5'-(2-氰基-3-(3,4-二甲氧基苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯。(2g)

[0064] 本发明公开了一种通式I所示化合物的制备方法，其直接以式VII化合物为原料进行制备，具体的方法为：

[0065] 当R1为氢原子、X为-NH-时，通式I所示化合物的制备方法包括以下步骤a)或步骤b)：

[0066] a)式VII化合物与丙二酸进行克脑文格尔反应生成化合物VIII，然后与取代苯胺反应生成通式I化合物；合成路线如下：

[0067]

[0068] b)式VIII化合物先与4-羟基苯胺进行酰胺化反应生成中间产物IX化合物，IX化合物再与甲醛及胺经Mannich反应生成通式I化合物；合成路线如下：

[0069]

[0070] 当R1为氰基、X为-NH-时，通式I所示化合物的制备方法包括步骤c)或步骤d)：

[0071] c)式化合物VII与氰乙酸反应生成产物X，然后通过一步酰氯化反应再与取代苯胺反应生成通式I化合物，合成路线如下：

[0072]

[0073] d)式化合物X与中间体对氨基苯酚反应生成化合物XI，XI化合物再与甲醛及胺经Mannich反应生成通式I化合物，合成路线如下：

[0074]

[0075] 其中，R为R5、R6或R7。

[0076] 本发明进一步公开了一种更具体的通式I所示化合物的制备方法：

[0077] 通式I所示化合物的制备方法包括如下步骤：将联苯双酯水解制得式II所示化合物7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5,5'-二甲酸，式II化合物与乙酸酐反应生成式III化合物，式III化合物与甲醇进行醇解反应生成式IV化合物7,7'-二甲氧基-5'-甲氧基羰基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-甲酸，式IV化合物与咪唑反应生成式V化合物5'-(1-羰基)咪唑-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯]-5-甲酸甲酯，式V化合物经NaBH4还原生成式VI化合物5'-(1-羟基)甲基-7,7'-二甲氧基-4,
4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-甲酸甲酯，式VI化合物经PCC氧化成中间产物VII化合物5'-甲酰基-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-甲酸甲酯，合成路线如下：

[0078]

[0079] 当R1为氢原子、X为-NH-时，通式I所示化合物的制备方法包括以下步骤a)或步骤b)：

[0080] a)式VII化合物与丙二酸进行克脑文格尔反应生成化合物VIII，然后与取代苯胺反应生成通式I化合物；合成路线如下：

[0081]

[0082] b)式VIII化合物先与4-羟基苯胺进行酰胺化反应生成中间产物IX化合物，IX化合物再与甲醛及胺经Mannich反应生成通式I化合物；合成路线如下：

[0083]

[0084] 当R1为氰基、X为-NH-时，通式I所示化合物的制备方法包括步骤c)或步骤d)：

[0085] c)式化合物VII与氰乙酸反应生成产物X，然后通过一步酰氯化反应再与取代苯胺反应生成通式I化合物，合成路线如下：

[0086]

[0087] d)式化合物X与中间体对氨基苯酚反应生成化合物XI，XI化合物再与甲醛及胺经Mannich反应生成通式I化合物，合成路线如下：

[0088]

[0089] 其中，R为R5、R6或R7。

[0090] 在由化合物Bifendate制备化合物VII或由化合物VII制备通式I化合物的反应中，所采用的溶剂有机溶剂选自二氯甲烷、乙腈、四氢呋喃、吡啶、氯仿、甲苯、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺或二氧六环中的一种或多种，优选采用二氯甲烷、乙腈、二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺或四氢呋喃；采用的反应温度为0℃至回流。

[0091] 在由化合物IV制备化合物V或化合物VIII制备化合物I反应中，所采用的缩合剂为HATU、HBTU、HOBt、EDCI、DMAP、DCC，优先采用EDCI、DMAP；采用的反应温度为室温。

[0092] 在由化合物V制备化合物VI的反应中，所采用的还原剂选自硼氢化钠、氢化锂铝，优先采用硼氢化钠；采用的反应温度为0℃至室温。

[0093] 在由化合物VI制备化合物VII的反应中，所采用的氧化剂选自二氧化锰、次氯酸钠、氯铬酸吡啶盐(PCC)或二氯铬酸吡啶盐(PDC)，优先采用氯铬酸吡啶盐(PCC)；采用的反应温度为室温。

[0094] 在由化合物VII制备化合物VIII或化合物X的反应中，所采用的碱为吡啶，哌啶，三乙胺，优先采用吡啶，采用的反应温度为70-115℃。

[0095] 这些中间体或目标化合物均可按照常规分离技术加以纯化，并且根据需要将其转化为与可药用酸的加成盐。

[0096] 除非另外说明，在说明书和权利要求中使用的以下术语具有下面讨论的含义：

[0097] “药学上可接受的盐”表示保留母体化合物的生物有效性和性质的那些盐。这类盐包括：

[0098] (1)与酸成盐，通过母体化合物的游离碱与无机酸或有机酸的反应而得，无机酸包括盐酸、氢溴酸、硝酸、磷酸、偏磷酸、硫酸、亚硫酸和高氯酸等，有机酸包括乙酸、三氟乙酸、丙酸、丙烯酸、己酸、环戊烷丙酸、羟乙酸、丙酮酸、草酸、(D)或(L)苹果酸、富马酸、马来酸、抗坏血酸、樟脑酸、苯甲酸、羟基苯甲酸、γ-羟基丁酸、甲氧基苯甲酸、邻苯二甲酸、甲磺酸、乙磺酸、萘-1-磺酸、萘-2-磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、酒石酸、柠檬酸、乳酸、肉桂酸、十二烷基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、天冬氨酸、硬脂酸、扁桃酸、琥珀酸、戊二酸或丙二酸等。

[0099] (2)存在于母体化合物中的酸性质子被金属离子代替或者与有机碱配位化合所生成的盐，金属例子例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子，有机碱例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺、奎宁等。

[0100] “药物组合物”指将本发明中的化合物中的一个或多个或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或前药与别的化学成分，例如药学上可接受的载体，混合。药物组合物的目的是促进给药给动物的过程。

[0101] “药用载体”或“药学上可接受的载体”指的是对有机体不引起明显的刺激性和不干扰所给予化合物的生物活性和性质的药物组合物中的非活性成分，例如但不限于：碳酸钙、磷酸钙、各种糖(例如乳糖、甘露醇等)、淀粉、环糊精、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁、丙烯酸聚合物或甲基丙烯酸聚合物、凝胶、水、聚乙二醇、丙二醇、乙二醇、蓖麻油或氢化蓖麻油或多乙氧基氢化蓖麻油、芝麻油、玉米油、花生油等。

[0102] “烷基”表示1-20个碳原子的饱和的脂烃基，包括直链和支链基团(本申请书中提到的数字范围，例如“1-20”，是指该基团，此时为烷基，可以含1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等，直至包括20个碳原子)。更优选的是，烷基是有1-10个碳原子的中等大小的烷基，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基等。最好是，烷基为有1-8或1-6个碳原子的低级烷基，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、异丁基或叔丁基等。烷基可以是取代的或未取代的。当是取代的烷基时，该取代基优选是一或多个，更优选1-3个，最优选1或2个取代基。

[0103] “亚烷基”表示与两个基团相连接的1-20个碳原子的饱和的脂烃基，包括直链和支链基团(本申请书中提到的数字范围，例如“1-20”，是指该基团，此时为亚烷基，可以含1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等，直至包括20个碳原子)。更优选的是，亚烷基是有1-10个碳原子的中等大小的亚烷基，例如亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚2-丙基、亚正丁基、亚叔丁基、戊基等。最好是，烷基为有1-8或1-6个碳原子的低级亚烷基。亚烷基可以是取代的或未取代的。当是取代的亚烷基时，该取代基优选是一或多个，更优选1-3个，最优选1或2个取代基。

[0104] “芳香杂环”或“杂芳基”表示5至12个环原子的单环或稠合环基团，含有一个、两个、三个或四个选自N、O或S的环杂原子，其余环原子是C，另外具有完全共轭的π电子系统。未取代的杂芳基地非限制性实例有吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、吡啶、嘧啶、喹啉、异喹啉、嘌呤、四唑、三嗪和咔唑。杂芳基可以是取代的或未取代的。当被取代时，取代基优选为一个或多个，更为优选为一个、两个或三个，进而更为优选一个或两个，独立地选自以下基团，包括：低级烷基、三卤烷基、卤素、羟基、低级烷氧基、巯基、(低级烷基)硫基、氰基、酰基、硫代酰基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、硝基、N-磺酰氨基、S-磺酰氨基。优选的杂芳基可选地被一个或两个取代基取代，取代基独立地选自卤素、低级烷基、三卤烷基、羟基、巯基、氰基、N-酰氨基、单或二烷基胺基、羧基或N-磺酰氨基。

[0105] “杂脂环基”表示单环或稠合环基团，在环中具有5到9个环原子，其中一个或两个环原子是选自N、O或S(O)m(其中m是0至2的整数)的杂原子，其余环原子是C。这些环可以具有一条或多条双键，但这些环不具有完全共轭的π电子系统。未取代的杂脂环基的非限制性实例有吡咯烷基、哌啶子基、哌嗪子基、吗啉代基等。

[0106] “羟基”表示-OH基团。

[0107] “硝基”表示-NO2基团。

[0108] “氰基”表示-CN基团。

[0109] “烷氧基”表示-O-(未取代的烷基)和-O-(未取代的环烷基)。代表性实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基等。

[0110] “卤素”表示氟、氯、溴或碘，优选为氟或氯。

[0111] “卤代烷基”表示卤素取代的烷基，优选如上所定义的卤素取代的低级烷基，它被一个或多个相同或不同的卤原子取代，例如-CH2Cl、-CF3、-CH2CF3、-CH2CCl3等。

[0112] “可选”或“可选地”意味着随后所描述的事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生和不发生的场合。例如，“杂芳基可选地被一个或两个取代基取代”意味着杂芳基的取代基可以但不必是一个，该说明包括杂芳基被一个取代基取代的情形和杂芳基被两个取代基取代的情形。

[0113] 本发明提供了一种药物组合物，它以本发明的化合物或其药学上可接受的盐为活性成分或主要活性成分，辅以药学上可接受的载体。

[0114] 本发明的化合物或其药学上可接受的盐可应用于制备与抗氧化有关疾病的药物方面。

附图说明

[0115] 图1是本发明代表化合物2a和2e抑制率；

[0116] 图2是本发明代表化合物2e活性氧检测实验结果；

[0117] 图3是本发明代表化合物2e荧光素酶报告基因检测实验结果；

[0118] 图4是本发明代表化合物能剂量依赖性(A)和时间依赖性(B)的提高抗氧化基因Nrf2的蛋白水平，以及剂量依赖性(C)和时间依赖性(D)的提高下游抗氧化合物酶NQO-1，HO-1，GCLM，GCLC等的蛋白水平；

[0119] 图5是本发明代表化合物2e能剂量依赖性的提高NQO-1(A)，HO-1(B)，GCLM(C)，GCLC(D)的基因表达，以及时间依赖性的提高NQO-1(E)，HO-1(F)，GCLM(G)，GCLC(H)的基因表达；

[0120] 图6本发明代表化合物2e的抗氧化活性可以通过DTT预处理来逆转；

[0121] 图7证实化合物2e对HBZY-1细胞发挥的保护作用取决于Nrf2激活及其下游基因表达，其中**P<0.01表示化合物组vs.H2O2模型组；##P<0.01表示化合物+H2O2组vs.化合物+H2O2+BSO组。

具体实施方式

[0122] 通过以下实施例并结合附图对本发明的烷氧基联苯α,β-不饱和酰胺类化合物作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。

[0123] 实施例1

[0124] 5'-(1-羰基)咪唑-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯]-5-甲酸甲酯(VI)

[0125] 将联苯双脂(30g)用300mL 10％的氢氧化钠分散，升高温度至120℃回流。反应约8h，反应液澄清，抽滤除去少量固体，滤液用浓盐酸调节pH至2-3产生白色固体，抽滤得白色固体中间体II约26g。将上述中间体II溶于约150mL乙酸酐，升高温度至150℃回流，反应约
10h，旋蒸除去乙酸酐得黄色油状中间体III约25g。在上述产物中加入约150mL甲醇，升温温度至90℃回流，反应约3h,得中间体IV约23.3g，收率为80％。

[0126] 将上述中间体IV(23.3g)，咪唑(5.8g,1.5eq)，DMAP(7.9g,1.2eq)，EDCI(12.4g,1.2eq)溶于约200mL二氯甲烷中，室温搅拌约5h，TLC监测反应。反应结束后，加水分散，二氯甲烷萃取，有机层依次用稀盐酸、蒸馏水、饱和食盐水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得油状物经硅胶柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝1:2,V/V)得25g中间体V，收率为
96％。该化合物为已知化合物。(Bioorganic&Medicinal Chemistry 20(2012)2540–2548)m.p.68-70℃；ESI-MS:m/z:477[M+Na]+.化合物V无需纯化直接投下一步反应。

[0127] 中间产物V(25g)溶于约180mL四氢呋喃，冷却至-5℃搅拌约20min，缓慢滴加溶于水的55％硼氢化钠(2g，1eq)，TLC监测反应。反应约3h完毕，稀盐酸调节pH至2-3，乙酸乙酯萃取，有机层依次用蒸馏水、饱和食盐水溶液洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得油状物经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷)得23.8g中间产物VI，收率为90％。该化合物为已知化合物。(Bioorganic&Medicinal Chemistry 20(2012)2540–2548)。m.p.126-128℃；ESI-MS m/z:
413[M+Na]+；1H-NMR(CDCl3,300MHz,δppm):3.71(s,3H,COOCH3),3.95(s,3H,ArOCH3),3.97(s,3H,ArOCH3),4.35(d,1H,CH2OH,J＝12Hz),4.40(d,1H,CH2OH,J＝12Hz),5.91-6.04(m,
4H,2×OCH2O),6.78(s,1H,Ar-H),7.33(s,1H,Ar-H).

[0128] 实施例2

[0129] 5'-甲酰基-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-甲酸甲酯(VII)

[0130] 化合物VI(1.5g,3.8mmol)置于恒压滴液漏斗中，用30mL的CH2Cl2溶解，然后缓慢滴入PCC(900mg,4.2mmol)的CH2Cl2混悬液(冰浴冷却)内，滴加完毕恢复至室温搅拌反应。TLC跟踪反应进程，反应结束后，反应液用硅藻土(或硅胶)过滤，滤液浓缩至干得粗品。快速硅胶柱层析分离纯化(PE/EtOAc＝3:1,V/V)得白色中间体VII(1.46g,98％)。该化合物为已知化合物。(Bioorganic&Medicinal Chemistry 20(2012)2540–2548)。m.p.179-181℃；1H-NMR(CDCl3,300MHz,δppm):3.68(s,3H,COOCH3),3.98(s,3H,ArOCH3),3.99(s,3H,ArOCH3),6.01-6.10(m,4H,2×OCH2O),7.32(s,1H,Ar-H),7.42(s,1H,Ar-H)；

[0131] 实施例3

[0132] (E)-5'-(3-(2-甲氧基苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯(1a)

[0133] 中间体VII(500mg，1.3mmol)和丙二酸(400mg，3.8mmol)混合，加入1ml DMF，吡啶(210μl)，室温搅拌约半小时，移至115℃油浴，有气泡产生。TLC跟踪反应进程，反应结束后，乙酸乙酯萃取，有机层分别用稀盐酸，水，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥。减压浓缩得粗品。快速硅胶柱层析(PE/EtOAc＝5:3-1:1，V/V)纯化得到白色化合物VIII(360mg)，收率65％。

[0134] 取化合物VIII(200mg，0.47mmol)，EDCI(100mg，0.5mmol)，DMAP(60mg，0.5mmol)，邻甲氧基苯胺(150mg，0.94mmol)混合溶于约2ml二氯甲烷中，室温搅拌。TLC跟踪反应进程，约3h反应结束。乙酸乙酯萃取，有机层分别用水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸得粗品。快速硅胶柱层析(PE/A＝1:2，V/V)纯化得到黄色化合物1a(110mg)，收率49％。m.p.215.9-217.4℃；ESI-TOF:m/z 588.1368[M+Na]+；1H NMR(CDCl3,400MHz,)δ8.43(s,
1H,-NH-),7.88(s,1H,Ar-H),7.46(d,J＝15.3Hz,1H,＝CH-),7.40(s,1H,Ar-H),7.07–7.01(m,1H,Ar-H),6.98(d,J＝4.7Hz,1H,Ar-H),6.94(d,J＝7.7Hz,1H,Ar-H),6.88(d,J＝
8.0Hz,1H,Ar-H),6.39(d,J＝15.3Hz,1H,＝CH-),6.02(s,2H,-CH2-),5.97(s,2H,-CH2-),
4.00(s,3H,-OCH3),3.98(s,3H,-OCH3),3.90(s,3H,-OCH3),3.67(s,3H,-OCH3)[0135] 实施例4

[0136] (E)-5'-(3-(3,4-二甲氧基苯乙基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯(1b)

[0137] 按照实施例3，由中间体VIII，3,4-二甲氧基苯乙胺制备化合物1b，产率50％。+ 1
m.p.98.8-99.7℃；ESI-TOF:m/z 616.1791[M+Na] ；H NMR(CDCl3,400MHz,)δ7.41(s,1H,-NH-),7.37(d,J＝15.4Hz,1H,＝CH-),6.89(s,1H,Ar-H),6.83(d,J＝9.0Hz,1H,Ar-H),
6.78–6.70(m,1H,Ar-H),6.73(s,1H,Ar-H),6.13(d,J＝15.5Hz,1H,＝CH-),6.02(dd,J＝
6.2,1.5Hz,2H,-CH2-),5.97(s,2H,-CH2-),5.53(s,1H,Ar-H),4.00(s,3H,-OCH3),3.96(s,
3H,-OCH3),3.89(s,3H,-OCH3),3.88(s,3H,-OCH3),3.67(s,3H,-OCH3),3.59–3.54(m,2H,-CH2-),2.80(t,J＝7.4Hz,2H,-CH2-).

[0138] 实施例5

[0139] (E)-5'-(3-(3,4,5-三甲氧基苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯(1c)

[0140] 按照实施例3，由中间产物VIII，3,4,5-三甲氧基苯胺制备化合物1c，产率53.1％。m.p185.3-186.9℃；ESI-TOF:m/z 618.1585[M+Na]+；1H NMR(CDCl3,400MHz,)δ7.46(s,1H,-NH-),7.43(s,1H,＝CH-),7.37(s,1H,Ar-H),6.87(s,2H,2×Ar-H),6.27(d,J＝15.2Hz,1H,＝CH-),5.99(d,J＝6.1Hz,2H,-CH2-),5.88(d,J＝11.4Hz,2H,-CH2-),3.96(s,3H,-OCH3),
3.89(s,3H,-OCH3),3.80(s,6H,2×-OCH3),3.79(s,3H,-OCH3),3.68(s,3H,-OCH3).[0141] 实施例6

[0142] (E)-5'-(3-(4-甲氧基苄基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯(1d)

[0143] 按照实施例3，由中间产物VIII，4-甲氧基苄胺制备化合物1d，产率57.5％。m.p.97.8-98.4℃；ESI-TOF:m/z 572.1525[M+Na]+；1H NMR(CDCl3,400MHz,)δ7.39(s,1H,-NH-),7.36(s,1H,＝CH-),7.20(s,1H,Ar-H),7.18(s,1H,Ar-H),6.85(s,2H,2×Ar-H),6.83(s,1H,Ar-H),6.16(d,J＝14.7Hz,1H,＝CH-),5.99(s,2H,-CH2-),5.93(s,2H,-CH2-),5.77(s,1H,Ar-H),4.41(s,2H,-CH2-),3.95(s,3H,-OCH3),3.91(s,3H,-OCH3),3.77(s,3H,-OCH3),3.64(s,3H,-OCH3).

[0144] 实施例7

[0145] (E)-5'-(3-(4-甲氧基苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯(1e)

[0146] 按照实施例3，由中间产物VIII，4-甲氧基苯胺制备化合物1e，产率36.1％。m.p.213.9-214.5℃；ESI-TOF:m/z 558.1367[M+Na]+；1H NMR(CDCl3,400MHz,)δ7.48(s,
1H,-NH-),7.47(s,1H,＝CH-),7.43(s,1H,Ar-H),7.39(s,1H,Ar-H),7.31(s,1H,Ar-H),
6.91(s,1H,Ar-H),6.86(s,1H,Ar-H),6.83(s,1H,Ar-H),6.29(d,J＝15.3Hz,1H,＝CH-),
6.01(dd,J＝6.4,1.1Hz,2H,-CH2-),5.92(dd,J＝10.9,1.3Hz,2H,-CH2-),3.98(s,3H,-OCH3),3.93(s,3H,-OCH3),3.79(s,3H,-OCH3),3.68(s,3H,-OCH3).

[0147] 实施例8

[0148] (E)-5'-(3-丁氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯(1f)

[0149] 按照实施例3，由中间产物VIII，正丁胺制备化合物1f，产率29.3％。m.p.162.6-163.7℃；ESI-TOF:m/z 508.1578[M+Na]+；1H NMR(CDCl3,400MHz,)δ7.37(s,1H,-NH),7.31(d,J＝15.5Hz,1H,＝CH-),6.87(s,1H,Ar-H),6.14(d,J＝15.5Hz,1H,＝CH-),5.99(d,J＝
3.0Hz,2H,-CH2-),5.94(s,2H,-CH2-),5.48(s,1H,Ar-H),3.96(s,3H,-OCH3),3.94(s,3H,-OCH3),3.64(s,3H,-OCH3),3.29(dd,J＝12.9,6.9Hz,2H,-CH2-),1.48(dd,J＝14.8,7.5Hz,
2H,-CH2-),1.33(dd,J＝15.1,7.4Hz,2H,-CH2-),0.91(t,J＝7.3Hz,3H,-CH3).[0150] 实施例9

[0151] (E)-5'-(3-(3,4-二甲氧基苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯(1g)

[0152] 按照实施例3，由中间产物VIII，3,4-二甲氧基苯胺制备化合物1g，产率59.3％。m.p.222.6-223.5℃ ESI-TOF:m/z 588.1481[M+Na]+；1H NMR(CDCl3,400MHz,)δ7.49(s,
1H,-NH-),7.46(d,J＝16.3Hz,1H,＝CH-),7.39(s,1H,Ar-H),7.32(s,1H,Ar-H),6.92(s,
1H,Ar-H),6.86(d,J＝8.6Hz,1H,Ar-H),6.79(d,J＝8.6Hz,1H,Ar-H),6.30(d,J＝15.5Hz,
1H,＝CH-),6.03–5.97(m,2H,-CH2-),5.95–5.91(m,2H,-CH2-),3.98(s,3H,-OCH3),3.94(s,
3H,-OCH3),3.87(s,3H,-OCH3),3.86(s,3H,-OCH3),3.68(s,3H,-OCH3).

[0153] 实施例10

[0154] (E)-2-氰基-3-(7,7'-二甲氧基-5'-(甲氧基羰基)-4,4'-二苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-基)丙烯酸(X)

[0155] 将化合物VII(5g)，氰乙酸(3.2g,3eq)，吡啶(2mL,2eq)混合溶于约5mL DMF，室温搅拌约1h，移至油浴开始升温至70℃搅拌，反应约3h，补加3eq氰乙酸，再经约6h，TLC检测反应，反应不完全，结束反应。乙酸乙酯萃取，有机层依次用稀盐酸，水，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得黄色油状物，经硅胶柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝5:3，V/V)得黄色固体中间产物X约3g，收率为51.2％。ESI-TOF:m/z 478.0737[M+Na]+；1H NMR(CDCl3,400MHz,)δ8.04(s,1H,Ar-H),7.99(s,1H,Ar-H),7.41(s,1H,Ar-H),6.10–5.92(m,4H,2×-CH2-),5.29(s,1H,-OH),4.00(s,6H,2×-OCH3),3.68(s,3H,-OCH3)

[0156] 实施例11

[0157] (E)-5'-(2-氰基-3-(2-甲氧基苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯(2a)

[0158] 将上述产物X(200mg)溶于约2mL二氯甲烷，滴加5d DMF，溶解澄清，冰浴条件下缓慢滴加草酰氯30d，反应约30min，取样TLC检测，减压浓缩除去残留的草酰氯，加入DCM再次减压浓缩得中间产物。用约2mL干燥的1,4-二氧六环溶解上述产物，开始缓慢滴加至溶于约1mL 1,4-二氧六环的2-甲氧基苯胺中，并开始升温至90℃回流，反应过程中有黄色固体生成，TLC监测反应，反应约4h处理，反应结束。乙酸乙酯萃取，有机层依次用稀盐酸，水，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得黄色固体混合物，重结晶或经硅胶柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝5:1-1:2，V/V)得目标化合物2a，收率77.4％。m.p.211.6-211.8℃；
ESI-TOF:m/z 583.1323[M+Na]+；1H NMR(CDCl3,400MHz,)δ8.80(s,1H,-NH-),8.31(d,J＝
8.0Hz,1H,＝CH-),8.18(s,1H,Ar-H),7.86(s,1H,Ar-H),7.41(s,1H,Ar-H),7.10(t,J＝
7.5Hz,1H,Ar-H),6.97(d,J＝7.7Hz,1H,Ar-H),6.91(d,J＝8.0Hz,1H,Ar-H),6.03(s,2H,-CH2-),5.99(s,2H,-CH2-),4.03(s,3H,-OCH3),3.99(s,3H,-OCH3),3.94(s,3H,-OCH3),3.68(s,3H,-OCH3).

[0159] 实施例12

[0160] (E)-5'-(2-氰基-3-(3,4-二甲氧基苯乙基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯(2b)

[0161] 按照实施例11，由中间产物X，3,4-二甲氧基苯乙胺制备化合物2b，产率79.8％。m.p.138.3-139.7℃；ESI-TOF:m/z 641.1743[M+Na]+；1H NMR(CDCl3,400MHz,)δ8.07(s,
1H,-NH-),7.76(s,1H,＝CH-),7.38(s,1H,Ar-H),6.81(d,J＝8.0Hz,1H,Ar-H),6.74(s,1H,Ar-H),6.71(d,J＝5.2Hz,1H,Ar-H),6.34(s,1H,Ar-H),5.99(s,2H,-CH2-),5.94(s,2H,-CH2-),3.98(s,3H,-OCH3),3.96(s,3H,-OCH3),3.86(s,3H,-OCH3),3.85(s,3H,-OCH3),3.65(s,3H,-OCH3),3.60–3.47(m,2H,-CH2-),2.79(t,J＝6.9Hz,2H,-CH2-)

[0162] 实施例13

[0163] (E)-5'-(2-氰基-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯(2c)

[0164] 按照实施例11，由中间产物X，3,4,5-三甲氧基苯胺制备化合物2c，产率58.8％。m.p.206.9-207.1℃；ESI-TOF:m/z 643.1536[M+Na]+；

[0165] 1H NMR(CDCl3,400MHz,)δ8.17(s,1H,-NH),7.84(s,1H,＝CH-),7.82(s,1H,Ar-H),7.40(s,1H,Ar-H),6.84(s,2H,2×Ar-H),6.02(s,2H,-CH2-),5.98(s,2H,-CH2-),4.02(s,
3H,-OCH3),3.98(s,3H,-OCH3),3.85(s,6H,2×-OCH3),3.81(s,3H,-OCH3),3.67(s,3H,-OCH3).

[0166] 实施例14

[0167] (E)-5'-(2-氰基-3-(4-甲氧基苄基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯；(2d)

[0168] 按照实施例11，由中间产物X，4-甲氧基苄胺制备化合物2d，产率39.6％。m.p.159.8-160.3℃；ESI-TOF:m/z 597.1473[M+Na]+；1H NMR(CDCl3,400MHz,)δ8.12(s,
1H,-NH),7.76(s,1H,＝CH-),7.39(s,1H,Ar-H),7.22(s,1H,Ar-H),7.20(s,1H,Ar-H),6.87(s,1H,Ar-H),6.85(s,1H,Ar-H),6.53(s,1H,Ar-H),5.98(d,J＝15.6Hz,4H,2×-CH2-),
4.45(d,J＝4.9Hz,2H,-CH2-),3.98(s,3H,-OCH3),3.97(s,3H,-OCH3),3.78(s,3H,-OCH3),
3.66(s,3H,-OCH3)

[0169] 实施例15

[0170] (E)-5'-(2-氰基-3-(4-甲氧基苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯(2e)

[0171] 按照实施例11，由中间产物X，4-甲氧基苯胺制备化合物2e，产率63.2％。m.p.185.1-185.4℃；ESI-TOF:m/z 583.1329[M+Na]+；

[0172] 1H NMR(CDCl3,400MHz,)δ8.18(s,1H,-NH),7.87(s,1H,＝CH-),7.82(s,1H,Ar-H),7.45(s,1H,Ar-H),7.43(s,1H,Ar-H),7.39(s,1H,1H),6.87(s,1H,Ar-H),6.85(s,1H,Ar-H),6.01(s,2H,-CH2-),5.97(s,2H,-CH2-),4.00(s,3H,-OCH3),3.96(s,3H,-OCH3),3.78(s,
3H,-OCH3),3.67(s,3H,-OCH3).

[0173] 实施例16

[0174] (E)-5'-(2-氰基-3-丁氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯(2f)

[0175] 按照实施例11，由中间产物X，正丁胺制备化合物2f，产率28.4％。m.p.145.9-147.3℃；ESI-TOF:m/z 533.1532[M+Na]+；1H NMR(CDCl3,400MHz,)δ8.09(s,1H,-NH-),7.78(s,1H,＝CH-),7.40(s,1H,Ar-H),6.27(s,1H,Ar-H),6.02(s,2H,-CH2-),5.97(s,2H,-CH2-),4.00(s,3H,-OCH3),3.97(s,3H,-OCH3),3.67(s,3H,-OCH3),3.35(q,J＝5.7Hz,2H,-CH2-),1.54(d,J＝7.8Hz,2H,-CH2-),1.37(dd,J＝15.0,7.4Hz,2H,-CH2-),0.93(t,J＝
7.3Hz,3H,-CH3).

[0176] 实施例17

[0177] (E)-5'-(2-氰基-3-(3,4-二甲氧基苯基)氨基-3-氧代-1-丙烯基)-7,7'-二甲氧基-4,4'-二苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基-5-甲酸甲酯(2g)

[0178] 按照实施例11，由中间产物X，3,4-二甲氧基苯胺制备2g，产率64.1％。m.p.>240℃；ESI-TOF:m/z 613.1429[M+Na]+；1H NMR(CDCl3,400MHz,)δ8.17(s,1H,-NH),7.87(s,1H,＝CH-),7.81(s,1H,Ar-H),7.39(s,1H,Ar-H),7.27(d,J＝2.4Hz,1H,Ar-H),6.98(dd,J＝8.6,2.4Hz,1H,Ar-H),6.81(d,J＝8.7Hz,1H,Ar-H),6.01(s,2H,-CH2-),5.98(s,2H,-CH2-),
4.00(s,3H,-OCH3),3.96(s,3H,-OCH3),3.87(s,3H,-OCH3),3.85(s,3H,-OCH3),3.67(s,
3H,-OCH3).

[0179] 实施例18

[0180] 下面是本发明的代表化合物的部分药理试验及结果：

[0181] 1、MTT毒性评价

[0182] 采用MTT法测定目标化合物对HBZY-1细胞的细胞毒性。实验分为模型组，给药组。将HBZY-1细胞接种于96孔板，每孔加入100μL细胞悬液(每孔3000个细胞)，于37℃，5％CO2培养箱培养24h；加入不同浓度的化合物继续培养24h；孵育完成后每孔加入MTT 20μL(5mg/mL)，37℃孵育4h，弃培养基加150μL DMSO充分溶解，摇床10分钟轻轻地混匀，用酶标仪检测λ＝490nm处OD值，计算抑制率。

[0183] 抑制率(％)＝阴性对照组OD值-实验组OD值×100％

[0184] 生存率(％)＝100％–抑制率(％)

[0185] 实验结果表明目标化合物对大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)的IC50值均大于200μM，提示这些化合物的安全性较高，对HBZY-1细胞增殖抑制作用较小。

[0186] 2、抗氧化活性评价

[0187] 采用MTT法检测目标化合物的抗氧化活性，实验分为正常组、模型组和给药组。将HBZY-1细胞接种于96孔板，每孔加入100μL细胞悬液，于37℃，5％CO2培养箱培养24h；加入含有不同浓度化合物(或含有DMSO的培养基，模型组)的培养基100μL继续孵育2h后，于每孔中加入H2O2(浓度600μM)；置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h；于每孔中加入20μL MTT(5mg/mL)，在培养箱中继续培养4h；弃上清，每孔加入150μL DMSO，摇床10min轻轻地混匀；λ＝490nm，酶标仪读出每孔的OD值，计算抑制率(同上)。

[0188] 实验结果显示，经H2O2(600μM)孵育24h后，HBZY-1细胞的生存状态显著受损，生存率仅为61.34％。HBZY-1细胞经目标化合物(1.5、3和6μM)预处理2h后，再用H2O2(600μM)共孵育24h，HBZY-1细胞的生存率会有显著提高，结果表明，这些目标化合物可以剂量依赖性的缓解H2O2诱导的细胞氧化损伤，且抗氧化作用显著高于先导物DDB(高浓度6μM下，细胞生存率仅有66.15％)的。从表1可以看出，在高浓度(6μM)下，化合物1a、2a、2e和2f组的HBZY-1细胞生存率分别为90.64％、99.22％、97.20％、95.29％，表明这些化合物具有显著的抗氧化作用。值得注意的是，即使在低浓度(1.5μM)时，化合物2a和2e组的细胞生存率仍然高达92.93％和91.21％，表现出最好的抗氧化作用。此外，将抗氧化活性最好的化合物2a结构中的烷氧基联苯简化为烷氧基苯基后，抗氧化活性显著降低。结果提示，烷氧基联苯结构在化合物的抗氧化活性中发挥重要的作用。此外，在α,β不饱和酰胺结构中的α位引入氰基，可以显著提高化合物的抗氧化活性(2a-g vs.1a-g)，该实验结果和文献报道一致，即在迈克尔受体的α位引入吸电子基团可以提高化合物的抗氧化活性。

[0189] 表1靶化合物对H2O2诱导氧化的细胞保护活性

[0190]

[0191] 综合上述实验结果可以发现，目标化合物中的2a和2e抗氧化活性最好。化合物2a和2e结构类似，且抗氧化活性相当，本发明又进一步检测了两个化合物的细胞毒性，从结果可以看出2a对HBZY-1细胞的毒性显著高于2e的(如图1所示)。

[0192] 2、流式细胞仪检测ROS水平

[0193] 由于发生氧化应激时，比较显著的就是细胞内ROS水平升高，本发明使用DCFH-DA法检测H2O2诱导的ROS积聚程度。DCFH-DA染料本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，在活性氧存在的条件下，DCFH被氧化生成荧光物质DCF，绿色荧光强度与细胞内活性氧水平成正比，实验结果以检测DCF荧光强度来初步评价化合物1a-g和2a-g是否具有抑制ROS积聚的作用，其中以白藜芦醇为阳性对照。实验结果显示化合物1a-g和2a-g可以剂量依赖性地减弱H2O2诱导ROS积聚，其中化合物2e效果显著(如图2所示)，且呈现出剂量依赖性。

[0194] 3、荧光素酶报告基因检测

[0195] 为了评价化合物1a-g和2a-g是否具有激活Nrf2信号传导作用，本发明选择用萤光素酶报告基因实验来测定荧光素酶活性以评估Nrf2水平。将HEK293细胞接种到T-25培养瓶中，培养至70％的汇合度。将构建好的ARE-LUC病毒加入培养瓶中，8h后更换培养基，继续培养72h后，将细胞消化下来，接种至12孔板中，待密度至70％后，加相应的药物处理16h，吸尽细胞培养液后用1×PBS润洗2遍后加入细胞裂解液于振荡器上室温裂解20min以裂解充分，向裂解液中加入底物，混匀后上机检测荧光。

[0196] 实验结果(图3)显示，化合物2e可以剂量依赖性的提高HEK293细胞中的Nrf2水平，其他化合物如1a-g、2a-d、2f和2g具有类似的实验效果。上述结果表明化合物1a-g和2a-g可能是通过激活Nrf2发挥抗氧化作用的。

[0197] 4、Western blot检测化合物2e对Nrf2及其下游抗氧化物酶蛋白表达的影响[0198] 研究表明，发生氧化应激时，Nrf2从Keap1上解离易位至细胞核，与抗氧化元件ARE结合，上调下游抗氧化物酶的表达来发挥抗氧化作用。因此，本发明通过Western blot来评估化合物1a-g和2a-g对Nrf2以及下游抗氧化物酶表达的影响。实验结果显示(图4)，化合物2e(1.5、3和6μM)作用于HBZY-1细胞24h后，可剂量依赖性提高HBZY-1细胞核内Nrf2以及下游抗氧化物酶蛋白的表达，且活性显著高于阳性对照物白藜芦醇。化合物2e(6μM)作用于HBZY-1细胞不同时间(0、3、6、12和24h)后，细胞核内Nrf2以及下游抗氧化物酶蛋白的表达呈现出时间依赖性增加，其他化合物如1a-g、2a-d、2f和2g具有类似的实验效果。上述结果进一步证实，化合物1a-g和2a-g通过激活Nrf2以及上调下游抗氧化物酶表达进而发挥抗氧化作用的。

[0199] 5、PCR检测活性化合物2e对Nrf2及其下游抗氧化物酶基因表达的影响[0200] 为了进一步确证化合物的抗氧化机制，本发明使用定量PCR检测了化合物对Nrf2调控的下游抗氧化物酶基因表达的影响。结果显示，化合物2e(1.5、3和6μM)作用于HBZY-1细胞24h后，可以剂量依赖性提高HO-1、NQO-1、GCLM和GCLC的基因表达(图5A-D)，且作用显著高于阳性对照物白藜芦醇。其他化合物如1a-g、2a-d、2f和2g具有类似的实验效果。此外，化合物2e(6μM)作用于HBZY-1细胞不同时间(0、3、6、12和24h)后，细胞内Nrf2调控的下游抗氧化物酶基因的表达呈现出时间依赖性提高，且12h时活性达到峰值(图5E-H)，其他化合物如1a-g、2a-d、2f和2g具有类似的实验效果。这一结果进一步证实了化合物1a-g和2a-g是通过激活Nrf2，上调下游抗氧化物酶的表达来发挥抗氧化作用的。

[0201] 6、化合物1a-g和2a-g抗氧化作用机制的进一步确证

[0202] 研究显示，迈克尔受体可以与Keap1的活性半胱氨酸残基结合，导致Nrf2的解离和核易位，这种结合方式通常可以通过DTT(一种含巯基的迈克尔受体消除剂)来猝灭。因此，本发明通过Western blotting与DTT联用来评价化合物1a-g和2a-g是否通过其迈克尔受体和Keap1结合诱导Nrf2的激活。实验结果显示(图6)，浓度为6μM的化合物2e诱导Nrf2的表达增加可以通过DTT预处理来逆转，这意味着化合物2e至少可以部分地以迈克尔受体结合方式诱导Nrf2的激活。此外，因为化合物2e诱导而减少的Keap1也可以通过DTT的作用表达增加。其他化合物如1a-g、2a-d、2f和2g具有类似的实验效果。这一结果表明了化合物1a-g和2a-g是通过靶向Keap1进而激活Nrf2发挥抗氧化活性。

[0203] 为了进一步证实化合物1a-g和2a-g对HBZY-1细胞发挥的保护作用取决于Nrf2激活及其下游基因表达，我们使用葫芦巴碱(TRG)(Nrf2抑制剂)，锌原卟啉IX(ZnPP)(HO-1抑制剂)和L-丁硫氨酸-(S，R)-亚磺酰亚胺(BSO)(GCL抑制剂)做细胞实验。实验结果显示，用TRG，ZnPP和BSO预处理明显减弱化合物2e的细胞保护活性(见图7)。以上结果证实化合物2e可通过激活Nrf2来改善H2O2诱导的HBZY-1细胞死亡，表明其可有效激活Nrf2，上调下游抗氧化物酶HO-1，GCL等的表达，从而作为间接抗氧化剂。其他化合物如1a-g、2a-d、2f和2g具有类似的实验效果。