一种牡蛎细胞凋亡基因SMAC基因及其在制备病理检测诊断试剂中的应用转让专利
申请号 : CN201810300697.2
文献号 : CN108586596B
文献日 : 2020-02-14
发明人 : 向志明 , 秦艳平 , 马海涛 , 李军 , 张扬 , 肖述 , 张跃环 , 喻子牛
申请人 : 中国科学院南海海洋研究所
摘要 :
本发明公开一种牡蛎细胞凋亡基因SMAC基因及其在制备病理检测诊断试剂中的应用。本发明发现了该物种细胞凋亡的标志性基因SMAC基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第50至1006bp所示。该基因编码的氨基酸序列(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)具有高度的物种特异性，在牡蛎属内氨基酸序列的相似性在60％‑88％，进化关系比较近，而与其他物种同源蛋白的相似性则在30％以下，因而进化关系比较远。定量PCR实验表明，SMAC基因在溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)感染后显著上调，可以作为检测牡蛎细胞凋亡情况的标准，对于牡蛎疾病的预防提供一个积极而准确的警戒信号，防止了灾害的扩大。
权利要求 :
1.SMAC蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.编码权利要求1所述的SMAC蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，其为SMAC基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第50至1006bp所示。
4.一种检测权利要求3所述的SMAC基因的表达量的检测试剂在制备牡蛎疾病预防警戒试剂中的应用，所述的牡蛎疾病是由溶藻弧菌或葡萄球菌感染引起的疾病。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的牡蛎疾病预防警戒试剂是检测牡蛎细胞凋亡情况的试剂。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述的牡蛎是香港巨牡蛎。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的检测牡蛎细胞凋亡情况的试剂是由于溶藻弧菌和/或葡萄球菌感染牡蛎后检测牡蛎细胞凋亡情况的检测试剂。
8.一种权利要求3所述的SMAC基因的检测引物；
所述的SMAC基因的检测引物为：
ChSMAC-F:5'-AAAACTAGCTCTGAGGCTGATAATA-3'ChSMAC-R:5'-ATAACGAATACAAGAACAGGCATAA-3'。
9.权利要求8所述的SMAC基因的检测引物在制备检测权利要求3所述的SMAC基因的表达量试剂中的应用。
10.权利要求3所述的SMAC基因作为牡蛎细胞凋亡标志性基因在制备检测由溶藻弧菌或葡萄球菌感染引起的牡蛎细胞凋亡情况的试剂中的应用。
说明书 :
一种牡蛎细胞凋亡基因SMAC基因及其在制备病理检测诊断试
剂中的应用
技术领域：
[0001] 本发明涉及贝类免疫与细胞凋亡的分子机理，更具体涉及一种从弧菌刺激后的香港巨牡蛎(Crassostrea hongkongensis)血细胞差减杂交文库中筛选出来的SMAC(second mitochondria -derived activator of caspases)基因的核苷酸序列、氨基酸序列及其制备方法和该基因的用途。背景技术：
[0002] 我国是世界上最大的牡蛎养殖国家，据统计，其年产量占世界总产量的80％以上。依据2015中国渔业统计年鉴统计，该年度牡蛎的养殖面积达到14.15万公顷，产量约为
457.34万吨，因此，牡蛎的养殖在我国沿海经济社会发展中占据举足轻重的地位，是一个重要的支柱产业；香港巨牡蛎主要分布在我国广西至福建的部分沿海河口和海湾区域,是华南沿岸的最重要的牡蛎养殖品种。我国海洋贝类的发展是以传统养殖为主，养殖面积广、能耗高的，产量因各种条件变化而波动，而且，由于缺乏有效的疾病检测手段，随着养殖规模的扩大，对于牡蛎养殖的风险也越来越大。在牡蛎养殖中，大规模死亡事件频繁发生，其死亡率高达70％-80％，有的养殖场的几乎全部死光。引起牡蛎死亡的原因很多，其中致病菌及寄生虫的侵害加重了牡蛎死亡情况，而恶劣的环境胁迫，也是诱导牡蛎死亡的一个重要因素。因此，建立实时的牡蛎养殖病害的预防和监测机制，是人们所亟待解决的问题之一。
457.34万吨，因此，牡蛎的养殖在我国沿海经济社会发展中占据举足轻重的地位，是一个重要的支柱产业；香港巨牡蛎主要分布在我国广西至福建的部分沿海河口和海湾区域,是华南沿岸的最重要的牡蛎养殖品种。我国海洋贝类的发展是以传统养殖为主，养殖面积广、能耗高的，产量因各种条件变化而波动，而且，由于缺乏有效的疾病检测手段，随着养殖规模的扩大，对于牡蛎养殖的风险也越来越大。在牡蛎养殖中，大规模死亡事件频繁发生，其死亡率高达70％-80％，有的养殖场的几乎全部死光。引起牡蛎死亡的原因很多，其中致病菌及寄生虫的侵害加重了牡蛎死亡情况，而恶劣的环境胁迫，也是诱导牡蛎死亡的一个重要因素。因此，建立实时的牡蛎养殖病害的预防和监测机制，是人们所亟待解决的问题之一。
[0003] 细胞凋亡是检测个体生存状态的一个重要的标志，而任何胁迫在机体内的反应，都可能使细胞凋亡这一生理机制活化，因而，细胞凋亡标志性基因的遴选，对于建立机理预防机制具有重要的意义。SMAC(second mitochondria-derived activator of caspases)是细胞凋亡的标志性基因，是指线粒体内除细胞色素C外，第二个被发现的通过激活半胱氨酸蛋白酶Caspases来调节细胞凋亡的蛋白。细胞内含有大量的Caspases，它们的活性位点均包含半胱氨酸残基，能够特异性的切割靶蛋白天冬氨酸残基上的肽键，从而诱导细胞凋亡。正常条件下，细胞质中的Caspases蛋白与凋亡抑制蛋白IAPs(inhibit apoptosis proteins)结合，维持细胞的稳定结构，不会活化细胞凋亡。在某些情况下，细胞接到凋亡信号时，SMAC会从线粒体释放至细胞质，与IAPs结合，使其丧失caspase抑制活性，活化Caspases蛋白，从而启动细胞的凋亡，因此，检测胞质内SMAC是判定细胞凋亡的金标准。发明内容：
[0004] 本发明的第一个目的是提供一种贝类细胞凋亡相关的基因序列-SMAC基因。
[0005] 本发明的贝类细胞凋亡相关的基因序列-SMAC基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第50至1006bp所示，其编码318个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0006] 本发明在香港巨牡蛎转录组测序的基础上，发现了该物种细胞凋亡的标志性基因SMAC基因。通过RACE技术，我们获得了cDNA全长1153bp(具体如SEQ ID NO.1所示)，5'非编码区长49bp，3'非编码区长147bp并含有多聚腺苷酸加尾信号(ATTAAA)和多聚腺苷酸尾巴，开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第50至1006bp所示，命名为SMAC基因。该基因编码的含318个氨基酸的蛋白序列(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)，命名为SMAC蛋白，其具有高度的物种特异性，在牡蛎属内氨基酸序列的相似性在60％-88％，进化关系比较近，而与其他物种同源蛋白的相似性则在30％以下，因而进化关系比较远。定量PCR实验表明，SMAC基因在溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)感染后显著上调，可以作为检测牡蛎细胞凋亡情况的标准，对于牡蛎疾病的预防提供一个积极而准确的警戒信号，防止了灾害的扩大。
[0007] 因此，本发明的第二个目的是提供检测SMAC基因的表达量的检测试剂在制备牡蛎疾病预防警戒试剂中的应用。
[0008] 所述的牡蛎疾病预防警戒试剂是检测牡蛎细胞凋亡情况的试剂。
[0009] 所述的牡蛎是香港巨牡蛎。
[0010] 所述的检测牡蛎细胞凋亡情况的试剂优选是由于溶藻弧菌和/或葡萄球菌感染牡蛎后检测牡蛎细胞凋亡情况的检测试剂。
[0011] 本发明的第三个目的是提供一种上述SMAC基因的检测引物；
[0012] 所述的SMAC基因的检测引物为：
[0013] ChSMAC-F:5'-AAAACTAGCTCTGAGGCTGATAATA-3'
[0014] ChSMAC-R:5'-ATAACGAATACAAGAACAGGCATAA-3'。
[0015] 本发明的第四个目的是提供上述SMAC基因的检测引物在制备检测SMAC基因的表达量试剂中的应用。
[0016] 优选，还包括有内参基因GAPDH的检测引物，具体为：
[0017] ChGAPDH-F:5'-GGATTGGCGTGGTGGTAGAG-3'
[0018] ChGAPDH-R:5'-GTATGATGCCCCTTTGTTGAGTC-3'。
[0019] 本发明的第五个目的是提供一种SMAC基因的定量检测方法，其特征在于，是以牡蛎总RNA的反转录产物为模板，以上述SMAC基因的检测引物为引物，利用定量PCR检测SMAC基因的表达量。
[0020] 优选，还利用基因GAPDH作为内参。
[0021] 优选，所述的定量PCR的反应体系为：
[0022]
[0023] 反应程序为：95℃5min，1个循环；95℃10s，56.5℃10s，72℃20s，45个循环。
[0024] 本发明的第六个目的是提供上述SMAC基因作为牡蛎细胞凋亡标志性基因在制备检测牡蛎细胞凋亡情况的试剂中的应用。
[0025] 本发明人发现了一个香港巨牡蛎细胞凋亡的标志性基因-SMAC基因，其在溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)感染后显著上调，可以作为检测牡蛎细胞凋亡情况的标准，对于牡蛎疾病的预防提供一个积极而准确的警戒信号，防止了灾害的扩大。该技术的应用，将进一步提升养殖贝类的种质创新能力，支撑产业的高效可持续性发展。附图说明：
[0026] 图1是SMAC蛋白的结构分析；
[0027] 图2是SMAC蛋白的组织分布。实时定量PCR实验结果表明SMAC蛋白在各个组织中均有表达，在血细胞中表达量最高。不同小写字母表示样品间差异显著。
[0028] 图3是溶藻弧菌刺激诱导SMAC基因的表达。病原菌刺激后，血细胞中SMAC基因的表达显著上调。星号(**)指示和对照组差异极其显著。
[0029] 图4是葡萄球菌刺激诱导SMAC基因的表达。病原菌刺激后，血细胞中SMAC的表达显著上调。星号(**)指示和对照组差异极其显著。具体实施方式：
[0030] 以下实施是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0031] 实施例1：
[0032] 1.RNA提取及反转录
[0033] a).香港巨牡蛎细胞或组织加Trizol后，采用组织研磨器研磨，室温放置5min，使其充分裂解。
[0034] b).12,000rpm离心5min，弃沉淀。
[0035] c).按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。
[0036] d).4℃12,000g离心15min。
[0037] e).吸取上层水相，至另一离心管中。
[0038] f).按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混匀，室温放置5-10min。
[0039] g).4℃12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。
[0040] h).按1ml 75％乙醇/ml Trizol加入75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。
[0041] i).4℃8,000g离心5min，尽量弃上清。
[0042] j).室温晾干或真空干燥5-10min。
[0043] k).可用50ul H2O，TE buffer或0.5％SDS溶解RNA样品，55-60℃,5-10min。
[0044] l).在室温孵育15min之后，加入250μLDNase Stop Solution(DSA)，在13,000×g离心1min。
[0045] m).重复步骤a-j,加100μL无核酸酶水，然后，在13,000×g离心1min，弃离心柱，使用分光光度计测量所收集的溶液中的RNA的浓度，分装后，贮存于-80℃。
[0046] n).第一条链cDNA的合成
[0047] 1)DNase I消化
[0048] 按照如下组分分别将各组的RNA加入到PCR离心管中
[0049] RNA 1μg10XDNaseIbuffer 1.2μL
DNaseI 1μL
SterileH2O Upto12μL
DNaseI 1μL
SterileH2O Upto12μL
[0050] 2)用枪头轻轻吹打混匀并稍作离心；37℃，15min,消化RNA中的DNA[0051] 3)加入1μL EDTA混匀，65℃，10min使DNase I失活
[0052] 4)按照如下组分依次加到离心管：
[0053]
[0054] 用枪头轻轻吹打混匀并稍作离心，放置于37℃，30min；
[0055] 5)85℃，5s使反转录酶失活，然后4℃短期保存，-20℃长期保存。
[0056] 2、差减杂交文库构建
[0057] 差减杂交文库使用PCR-Select cDNA Subtraction Kit(Clontech,USA)试剂盒进行构建。香港巨牡蛎受弧菌刺激8h后，收集血细胞，按照上述的方法提取血细胞总RNA，并使用同样的方法提取对照组(未受弧菌处理)血细胞总RNA。以刺激后香港巨牡蛎作为tester，对照组作为driver，进行扣除杂交。将差减杂交后的cDNAs亚克隆到pGEM-Teasy vector(Promega,USA)并转化到Escherichia coli JM109(Promega,USA)感受态细胞。随机挑选2000个克隆并进行测序。
[0058] 3.SMAC基因全长的克隆
[0059] 依据步骤2所得到的克隆测序，通过BLASTEN等生物软件分析并确定SMAC序列，再以此序列为模版，通过GeneRacerTM RACE Ready cDNA试剂盒(Invitrogen,USA)进行该基因的5'/3'RACE，具体操作参照说明书。得到RACE序列后，通过拼接，获得该基因的全长cDNA(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，分析其编码区，其编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第50至1006bp所示，命名为SMAC基因，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，命名为SMAC蛋白，通过SMART在线软件(http://smart.embl-heidelberg.de/)，对其编码氨基酸序列分析，分析表明该基因编码的蛋白具有SMAC蛋白家族的特征性结构域(图1)。
[0060] 4.实时定量PCR
[0061] 进行实时定量PCR所使用的试剂盒为LightCycler 480SYBR Green I(Roch)，所使用的仪器为LightCycler 480 System(Roche)，所使用的模板为总RNA的反转录产物，所使用的内参GAPDH，所使用的引物有：
[0062] 针对SMAC基因：ChSMAC-F:5'-AAAACTAGCTCTGAGGCTGATAATA-3'
[0063] ChSMAC-R:5'-ATAACGAATACAAGAACAGGCATAA-3'
[0064] 针对内参GAPDH基因：ChGAPDH-F:5'-GGATTGGCGTGGTGGTAGAG-3'
[0065] ChGAPDH-R:5'-GTATGATGCCCCTTTGTTGAGTC-3'
[0066] qRT-PCR实验采用Light-Cycler 480II System(Roche)进行反应体系如下：
[0067]
[0068] 热循环条件如下：95℃5min，1个循环；95℃10s，56.5℃10s，72℃20s，45个循环。使用2－ΔΔCT方法对转录本进行相对定量。实验组和对照组均设置3个平行反应。
[0069] 5.组织分布及样品处理
[0070] 分别提取5只香港巨牡蛎的各个组织的总RNA(见步骤1)并反转录为cDNA，得到反转录产物，采用Real-time PCR技术检测了SMAC基因在香港巨牡蛎的淋巴细胞，腮，触唇，性腺，消化腺，外套膜，围心腔，闭壳肌中的分布情况。结果显示它在各个组织中广泛表达，其中外套膜中表达量最低，在血淋巴表达最高(图2)。
[0071] 取正常香港巨牡蛎，分别注射1.0×109个活的病原菌，以PBS为参照，在不同的时间点以5个一组的方式取样，提取血细胞的总RNA并反转录为cDNA，见步骤1。依此为模版，进行样品的Real-time PCR检测，结果发现溶藻弧菌(图3)，葡萄球菌(图4)感染都引起SMAC基因的显著上调表达。