诱导多能干细胞分化成造血干细胞的培养基及方法

摘要

本发明涉及一种诱导多能干细胞分化成造血干细胞培养基及方法，所述培养基包括第一阶段培养基和第二阶段培养基；所述方法包括依次使用第一阶段培养基、第二阶段培养对多能干细胞与OP9细胞分两个阶段进行共培养。与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：本发明通过采用上述两种特定成分和浓度的诱导多能干细胞分化成造血干细胞的培养基，依次对多能干细胞诱导分化，提高了多能干细胞向造血干细胞分化的效率。

权利要求

1.一种诱导多能干细胞分化成造血干细胞的培养基，其特征在于，包括第一阶段培养基和第二阶段培养基；

所述的第一阶段培养基为含5-15％胎牛血清、90-110μmol/L硫代甘油的a-MEM培养基中添加有终浓度为35-45ng/mL的SCF、终浓度为15-25ng/mL的BMP4、终浓度为15-25ng/mL的IL-3、终浓度为15-25ng/mL的VEGF、终浓度为15-25ng/mL的Flt3；

所述的第二阶段培养基为含5-15％胎牛血清、90-110μmol/L硫代甘油的a-MEM培养基中添加有终浓度为35-45ng/mL的SCF、终浓度为15-25ng/mL的BMP4、终浓度为15-25ng/mL的IL-3、终浓度为15-25ng/mL的VEGF、终浓度为15-25ng/mL的Flt3，以及终浓度为80-120ng/mL的UM171；所述第一阶段培养基中，所述SCF、BMP4、IL-3、VEGF、Flt3的终浓度比为(1.5-

2.5)：(0.5-1.5)：(0.5-1.5)：(0.5-1.5)：(0.5-1.5)；所述第二阶段培养基中，所述SCF、BMP4、IL-3、VEGF、Flt3、UM171的终浓度比为(1.5-2.5)：(0.5-1.5)：(0.5-1.5)：(0.5-1.5)：(0.5-1.5)：(4.5-5.5)。

2.根据权利要求1所述的诱导多能干细胞分化成造血干细胞的培养基，其特征在于，所述第一阶段培养基中，所述SCF、BMP4、IL-3、VEGF、Flt3的终浓度比为2：1：1：1：1；所述第二阶段培养基中，所述SCF、BMP4、IL-3、VEGF、Flt3、UM171的终浓度比为2：1：1：1：1：5。

3.根据权利要求1所述的诱导多能干细胞分化成造血干细胞的培养基，其特征在于，所述的第一阶段培养基为含10％胎牛血清、100μmol/L硫代甘油的a-MEM培养基中添加有终浓度为40ng/mL的SCF、终浓度为20ng/mL的BMP4、终浓度为20ng/mL的IL-3、终浓度为20ng/mL的VEGF、终浓度为20ng/mL的Flt3；

所述的第二阶段培养基为含10％胎牛血清、100μmol/L硫代甘油的a-MEM培养基中添加有终浓度为40ng/mL的SCF、终浓度为20ng/mL的BMP4、终浓度为20ng/mL的IL-3、终浓度为

20ng/mL的VEGF、终浓度为20ng/mL的Flt3，以及终浓度为100ng/mL的UM171。

4.一种诱导多能干细胞分化成造血干细胞的方法，其特征在于，包括：

将多能干细胞和OP9细胞先置于权利要求1至3任一项所述的第一阶段培养基中进行第一阶段的诱导分化，再置于权利要求1至3任一项所述的第二阶段培养基中进行第二阶段的诱导分化。

5.根据权利要求4所述的诱导多能干细胞分化成造血干细胞的方法，其特征在于，将多能干细胞和OP9细胞共同接种于第一阶段培养基记为第0天，所述第一阶段的诱导分化自第

0天开始至第3天结束，所述第二阶段的诱导分化自第4天开始至第14天结束。

6.根据权利要求4或5所述的诱导多能干细胞分化成造血干细胞的方法，其特征在于，所述第一阶段的诱导分化的第1天全量更换新鲜培养基，自所述第一阶段的诱导分化起第4天开始，隔天半量更换为新鲜的培养基。

7.根据权利要求4或5所述的诱导多能干细胞分化成造血干细胞的方法，其特征在于，所述OP9细胞是于含15-25％胎牛血清的α-MEM培养基中培养4-5d获得的。

8.根据权利要求4或5所述的诱导多能干细胞分化成造血干细胞的方法，其特征在于，所述OP9细胞与多能干细胞的数量比为(12-18):1。

9.根据权利要求8所述的诱导多能干细胞分化成造血干细胞的方法，其特征在于，所述OP9细胞与多能干细胞的数量比为12：1或者18:1。

10.根据权利要求4或5所述的诱导多能干细胞分化成造血干细胞的方法，其特征在于，所述多能干细胞为诱导多能干细胞。

说明书

诱导多能干细胞分化成造血干细胞的培养基及方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种诱导多能干细胞分化成造血干细胞的培养基及方法。

背景技术

[0002] 近年来，造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)越来越多地被应用到临床上来治疗血液系统恶性肿瘤、实体瘤、骨髓衰竭性疾病以及一些先天性疾病等，同时在儿科的血液病、遗传病、肿瘤的治疗中也表现出一定的应用发展前景。随着包括脐血和同源供体在内的干细胞移植替代来源的发展及新调理疗法的运用，极大地提高和改善了病人的愈后。来源于脐血的造血干细胞因含量丰富且扩增能力强、免疫原性低、采集方便和对供体无害等优势，在多种血液系统疾病的临床治疗中具有广阔应用前景。但是目前仅通过供体无偿献血方式所提供的脐血的供应量远远满足不了临床大量需求，因单份脐带血体积小，难以满足成年患者的治疗需要，严重制约了脐带血造血干细胞的临床应用。加之临床用血存在着HIV、HCV等病原体的污染风险，以及受移植失败、移植物抗宿主病(GVHD)和造血构建延迟等不利因素的影响，导致50％以上的患者终生残疾或无法治愈。所以，即使用造血干细胞治疗，也面临着一个比较严峻的问题：如何能有足够量的造血干细胞用于移植？[0003] 诱导多能干细胞是获得造血干细胞的重要来源之一。诱导多能干细胞(iPS)是一类通过基因转染等细胞重编程技术人工诱导获得的多能干细胞，其首先由日本科学家Yamanaka在2006年运用逆转录病毒转导的方法，将Sox2、Oct3/4、c-Myc和Klf4四个转录因子转入小鼠胚胎成纤维(Mouse Embryonic Fibrobalst)细胞中，从而诱导出的重编程为一类具有类似于胚胎干细胞(ES)多能性分化潜力的干细胞。利用人类诱导性多能干细胞(hiPSCs)能够在体外定向诱导分化成多种来自各个胚层的细胞，造血干细胞便是其中一种。通过使用hiPSCs定向分化出大量的造血干细胞为临床提供安全、有效的细胞来源，成为治疗相关血液疾病有希望的新方法之一。

[0004] 胚胎干细胞也是用于体外诱导分化成造血干细胞的多能干细胞。例如通将胚胎干细胞(ES)培养成拟胚体(embryoid body，EB)，再对拟胚体定向诱导，从而获得造血干细胞。

[0005] 造血干细胞的诱导分化方法还包括，培养以上多能干细胞，去除饲养层细胞或分化抑制因子后，将多能干细胞与不同的基质细胞共培养，如0P9细胞等，直接定向诱导分化为造血细胞。

[0006] 虽然体外诱导分化获得造血干细胞的方法多样，但是传统方法诱导分化造血干细胞的效率普遍较低。

发明内容

[0007] 基于此，有必要提供一种能够提高体外造血干细胞分化效率的培养基及方法。

[0008] 一种诱导多能干细胞分化成造血干细胞的培养基，包括第一阶段培养基和第二阶段培养基；

[0009] 所述的第一阶段培养基为含5-15％胎牛血清、90-110μmol/L硫代甘油的a-MEM培养基中添加有终浓度为35-45ng/mL的SCF、终浓度为15-25ng/mL的BMP4、终浓度为15-25ng/mL的IL-3、终浓度为15-25ng/mL的VEGF、终浓度为15-25ng/mL的Flt3；

[0010] 所述的第二阶段培养基为含5-15％胎牛血清、90-110μmol/L硫代甘油的a-MEM培养基中添加有终浓度为35-45ng/mL的SCF、终浓度为15-25ng/mL的BMP4、终浓度为15-25ng/mL的IL-3、终浓度为15-25ng/mL的VEGF、终浓度为15-25ng/mL的Flt3，以及终浓度为80-120ng/mL的UM171。

[0011] 在其中一些实施例中，所述第一阶段培养基中，所述SCF、BMP4、IL-3、VEGF、Flt3的终浓度比为(1.5-2.5)∶(0.5-1.5)∶(0.5-1.5)∶(0.5-1.5)∶(0.5-1.5)；所述第二阶段培养基中，所述SCF、BMP4、IL-3、VEGF、Flt3、UM171的终浓度比为(1.5-2.5)∶(0.5-1.5)∶(0.5-1.5)∶(0.5-1.5)∶(0.5-1.5)∶(4.5-5.5)。

[0012] 在其中一些实施例中，所述第一阶段培养基中，所述SCF、BMP4、IL-3、VEGF、Flt3的终浓度比为2∶1∶1∶1∶1；所述第二阶段培养基中，所述SCF、BMP4、IL-3、VEGF、Flt3、UM171的终浓度比为2∶1∶1∶1∶1∶5。

[0013] 一种诱导多能干细胞分化成造血干细胞的方法，包括：

[0014] 将多能干细胞和OP9细胞先置于上述的第一阶段培养基中进行第一阶段的诱导分化，再置于上述的第二阶段培养基中进行第二阶段的诱导分化。

[0015] 在其中一些实施例中，将多能干细胞和OP9细胞共同接种于第一阶段培养基记为第0天，所述第一阶段的诱导分化自第0天开始至第3天结束，所述第二阶段的诱导分化自第4天开始至第14天结束。

[0016] 在其中一些实施例中，所述第一阶段的诱导分化的第1天全量更换新鲜培养基，自所述第一阶段的诱导分化起第4天开始，隔天半量更换为新鲜的培养基。

[0017] 在其中一些实施例中，所述OP9细胞是于含15-25％胎牛血清的α-MEM培养基中培养4-5d获得的。

[0018] 在其中一些实施例中，所述OP9细胞与多能干细胞的数量比为(12-18)∶1。

[0019] 在其中一些实施例中，所述多能干细胞为诱导多能干细胞、胚胎干细胞，或者诱导多能干细胞和胚胎干细胞的混合物。

[0020] 与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：

[0021] 本发明通过采用上述两种特定成分和浓度的诱导多能干细胞分化成造血干细胞的培养基，依次对多能干细胞诱导分化，提高了多能干细胞向造血干细胞分化的效率。

[0022] 进一步地，本发明还通过对第一阶段培养基中SCF、BMP4、IL-3、VEGF、Flt3的终浓度比以及第二阶段培养基中SCF、BMP4、IL-3、VEGF、Flt3、UM171的终浓度比的优化，意外避免了含血清培养基使用过程中污染现象的发生，解决了细胞培养过程既需要血清组分又难以避免污染的矛盾。

附图说明

[0023] 图1是流式检测实施例1及其对比组的CD34+阳性率的结果图；

[0024] 图2是流式检测实施例2及其对比组的CD34+阳性率的结果图；

[0025] 图3是流式检测阴性组的CD34+阳性率的结果图；

[0026] 图4是实施例1及其对比组、实施例2及其对比组的阳性率柱状图。

具体实施方式

[0027] 以下结合具体实施例对本发明的诱导多能干细胞分化成造血干细胞培养基及方法作进一步详细的说明。本实施例采用的细胞均可来市购获得。

[0028] 实施例1

[0029] 本实施例提供诱导多能干细胞(iPS)分化成造血干细胞的培养基及方法。

[0030] 本实施例采用的培养基包括第一阶段培养基、第二阶段培养基：

[0031] 第一阶段培养基中，SCF、BMP4、IL-3、VEGF、Flt3的终浓度比为2∶1∶1∶1∶1，具体配方为：a-MEM培养基中加入终浓度为10％(v/v)的胎牛血清、终浓度为100μmol/L的硫代甘油(MTG)，以及加入终浓度为40ng/mL的干细胞因子(stem cell factor，SCF)、终浓度为20ng/mL的骨形态发生蛋白4(BMP4)、终浓度为20ng/mL的白细胞介素-3(IL-3)、终浓度为20ng/mL的VEGF、终浓度为20ng/mL的Flt3。

[0032] 第二阶段培养基中SCF、BMP4、IL-3、VEGF、Flt3、UM171的终浓度比为2∶1∶1∶1∶1∶5，具体配方为：a-MEM培养基中加入终浓度为10％(v/v)的胎牛血清、终浓度为100μmol/L的硫代甘油(MTG)，以及加入终浓度为40ng/mL的干细胞因子(stem cell factor，SCF)、终浓度为20ng/mL的骨形态发生蛋白4(BMP4)、终浓度为20ng/mL的白细胞介素-3(IL-3)、终浓度为20ng/mL的VEGF、终浓度为20ng/mL的Flt3、终浓度为100nm/mL的UM171。

[0033] 本实施例采用的诱导iPS分化成造血干细胞的方法包括：

[0034] (1)用含20％(v/v)胎牛血清的a-MEM培养基于60mm培养皿中培养OP9细胞(小鼠骨髓基质细胞)4-5天，然后将所得OP9细胞转移至第一阶段培养基中，获得OP9细胞的重悬液；

[0035] (2)将iPS细胞用DMEM/F12洗涤两遍后加入Dispase(分散酶)消化，待细胞克隆边缘出现卷缩后吸弃Dispase，用DMEM/F12培养基洗一遍，再加入1.5mL的DMEM/F12培养基，用枪头将克隆刮成均匀块状，然后移至离心管中等待其自然沉降，弃上清，加入1mL第一阶段培养基，获得iPS细胞的重悬液；

[0036] (3)接种当天记为第0天将步骤(2)得到的iPS细胞的重悬液接种入步骤(1)得到的OP9细胞的重悬液中，iPS细胞的OP9细胞的细胞数量比为1∶15，在37℃、5％CO2培养箱中培养一天，第1天全量换液以将死细胞及未贴壁细胞去除，之后培养两天(第2天、第3天)不用换液，第4天开始隔天半量换液以提高分化效率，在共培养第4天，更换为第二阶段培养基进行培养，在第14天收取造血干细胞。

[0037] 为了做比较，本实施例还设置了对比组，对比组与本实施例的区别仅在于，仅采用如下配方的培养基进行一次诱导分化：a-MEM培养基添加加入终浓度为10％(v/v)的胎牛血清、终浓度为100μmol/L的硫代甘油(MTG)。

[0038] 实施例2

[0039] 本实施例是实施例1的变化例，变化之处仅在于多能干细胞的种类选用胚胎干细胞(ES)。

[0040] 为了做比较，本实施例还设置了对比组，对比组与本实施例的区别仅在于，仅采用如下配方的培养基进行一次诱导分化：a-MEM培养基添加加入终浓度为10％(v/v)的胎牛血清、终浓度为100μmol/L的硫代甘油(MTG)。

[0041] 实施例3

[0042] 本实施例是实施例1的变化例，变化之处仅在于第一阶段培养基和第二阶段培养基的组分含量：

[0043] 第一阶段培养基中SCF、BMP4、IL-3、VEGF、Flt3的终浓度比为2.25∶1∶1∶1∶1，具体组分为：a-MEM培养基中加入终浓度为10％(v/v)的胎牛血清、终浓度为100μmol/L的硫代甘油(MTG)，以及加入终浓度为45ng/mL的干细胞因子(stem cell factor，SCF)、终浓度为20ng/mL的骨形态发生蛋白4(BMP4)、终浓度为20ng/mL的白细胞介素-3(IL-3)、终浓度为
20ng/mL的VEGF、终浓度为20ng/mL的Flt3；

[0044] 第二阶段培养基中SCF、BMP4、IL-3、VEGF、Flt3的终浓度比为2.25∶1∶1∶1∶1∶4.5，具体配方为：a-MEM培养基中加入终浓度为10％(v/v)的胎牛血清、终浓度为100μmol/L的硫代甘油(MTG)，以及加入终浓度为45ng/mL的干细胞因子(stem cell factor，SCF)、终浓度为20ng/mL的骨形态发生蛋白4(BMP4)、终浓度为20ng/mL的白细胞介素-3(IL-3)、终浓度为20ng/mL的VEGF，终浓度为20ng/mL的Flt3、终浓度为90ng/mL的UM171。

[0045] 实施例4

[0046] 本实施例是实施例1的变化例，变化之处仅在于：

[0047] (一)第一阶段培养基和第二阶段培养基的组分含量

[0048] 第一阶段培养基：a-MEM培养基中加入终浓度为10％(v/v)的胎牛血清、终浓度为100μmol/L的硫代甘油(MTG)，以及加入终浓度为35ng/mL的干细胞因子(stem cell factor，SCF)、终浓度为25ng/mL的骨形态发生蛋白4(BMP4)、终浓度为15ng/mL的白细胞介素-3(IL-3)、终浓度为25ng/mL的VEGF、终浓度为15ng/mL的Flt3。

[0049] 第二阶段培养基：a-MEM培养基中加入终浓度为10％(v/v)的胎牛血清、终浓度为100μmol/L的硫代甘油(MTG)，以及加入终浓度为35ng/mL的干细胞因子(stem cell factor，SCF)、终浓度为25ng/mL的骨形态发生蛋白4(BMP4)、终浓度为15ng/mL的白细胞介素-3(IL-3)、终浓度为25ng/mL的VEGF、终浓度为15ng/mL的Flt3、终浓度为80ng/mL的UM171。

[0050] (二)iPS细胞的OP9细胞的细胞数量比为1∶12。

[0051] 实施例5

[0052] 本实施例是实施例1的变化例，变化之处仅在于：

[0053] (一)第一阶段培养基和第二阶段培养基的组分含量

[0054] 第一阶段培养基：a-MEM培养基中加入终浓度为10％(v/v)的胎牛血清、终浓度为100μmol/L的硫代甘油(MTG)，以及加入终浓度为45ng/mL的干细胞因子(stem cell factor，SCF)、终浓度为25ng/mL的骨形态发生蛋白4(BMP4)、终浓度为25ng/mL的白细胞介素-3(IL-3)、终浓度为25ng/mL的VEGF、终浓度为25ng/mL的Flt3。

[0055] 第二阶段培养基：a-MEM培养基中加入终浓度为10％(v/v)的胎牛血清、终浓度为100μmol/L的硫代甘油(MTG)，以及加入终浓度为45ng/mL的干细胞因子(stem cell factor，SCF)、终浓度为15ng/mL的骨形态发生蛋白4(BMP4)、终浓度为25ng/mL的白细胞介素-3(IL-3)、终浓度为15ng/mL的VEGF，终浓度为25ng/mL的Flt3、终浓度为120ng/mL的UM171。

[0056] (二)iPS细胞的OP9细胞的细胞数量比为1∶18。

[0057] 实施例1-5的结果测试

[0058] CD34+阳性率的检测：取实施例及其对比组最终所得细胞，用DMEM/F12洗涤2遍后先用1mg/mL的胶原酶IV消化20min，再用0.25％的胰酶消化15-20min，然后中止消化；吹打细胞使其呈单细胞悬液，收集细胞到15mL离心管中1000r/min离心5min，弃上清后用1mL含2％(v/v)血清的PBS重悬，用100μm的无菌细胞筛网过滤一次，加入抗体CD34-PE-Cy7，4℃孵育30min后用含2％血清的PBS洗一遍。然后以5×106/ml的密度重悬细胞，使用FACSCalibur流式仪细胞仪检测并分析其分化效率。在检测过程中，以普通iPS细胞为阴性组，即未进行造血诱导分化的细胞或者是虽进行分化实验但是并未用流式抗体染色的细胞。

[0059] 污染情况的统计：每个实施例及其对比组、对比例1分别设50个重复，培养过程中记录受到污染的重复数，统计污染率。

[0060] 结果实施例1及其对比组测试结果如图1、图4所示，流式细胞分析发现实施例1的CD34+阳性率上升到32.07％(其对比组为4.96％)；实施例2及其对比组的测试结果如图2、图4所示，CD34+阳性率上升到30.14％(其对比组为6.36％)，分化效率明显上升。阴性对比组见图3。

[0061] 总体上来讲，各例的统计的测试结果见表1：

[0062]

[0063] 对比例1

[0064] 本对比例是实施例1的对比例，对比之处仅在于第一阶段培养基和第二阶段培养基的配方：

[0065] 第一阶段培养基：a-MEM培养基中加入终浓度为10％(v/v)的胎牛血清、终浓度为100μmol/L的硫代甘油(MTG)，以及加入终浓度为30ng/mL的干细胞因子(stem cell factor，SCF)、终浓度为10ng/mL的骨形态发生蛋白4(BMP4)、终浓度为30ng/mL的白细胞介素-3(IL-3)、终浓度为10ng/mL的VEGF、终浓度为30ng/mL的Flt3。

[0066] 第二阶段培养基：a-MEM培养基中加入终浓度为10％(v/v)的胎牛血清、终浓度为100μmol/L的硫代甘油(MTG)，以及加入终浓度为30ng/mL的干细胞因子(stem cell factor，SCF)、终浓度为10ng/mL的骨形态发生蛋白4(BMP4)、终浓度为30ng/mL的白细胞介素-3(IL-3)、终浓度为10ng/mL的VEGF、终浓度为30ng/mL的Flt3、终浓度为130ng/mL的UM171。

[0067] 结果：本对比例测得的CD34+阳性率为21.62％。

[0068] 对比例2

[0069] 本对比例是实施例1的对比例，对比之处仅在于：仅采用第二阶段培养基培养15天。

[0070] 结果：本对比例测得的CD34+阳性率为15.54％。

[0071] 对比例3

[0072] 本对比例是实施例1的对比例，对比之处仅在于：仅采用第一阶段培养基培养D14天。

[0073] 结果：本对比例测得的CD34+阳性率为26.42％。

[0074] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

[0075] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。