桃转录因子PpERF.A16基因、蛋白、其重组表达载体及应用

摘要

本发明公开了桃转录因子PpERF.A16及其应用。该基因属于ERF家族成员，其核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.1所示，编码区序列长度为966bp，编码321个氨基酸，其编码的氨基酸序列为序列表SEQ ID NO.2所示。在基因组和RNA SEQ分析的基础上，对乙烯生物合成基因、1‑氨基环丙烷‑1‑羧基合酶和氧化酶和AP2/ERF转录因子进行了分离和分析。经生物学功能验证，表明PpERF.A16基因具有促进乙烯合成的功能。PpERF.A16基因的发现，为促进乙烯合成的分子育种提供新的基因资源，为实施绿色农业提供新的遗传资源，该资源的开发利用有利提高桃果实的商品价值和市场竞争力，延长果实的货架期，有利于降低农业成本和实现环境友好。

权利要求

1.桃转录因子PpERF  .A16基因在促进桃乙烯合成中的应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示。

2.重组表达载体在促进桃乙烯合成中的应用，所述重组表达载体以pCAMBIA1301为载体，将权利要求1所述的桃转录因子PpERF  .A16基因插入到Xbal酶切位点和HindIII酶切位点之间。

说明书

桃转录因子PpERF.A16基因、蛋白、其重组表达载体及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及桃转录因子PpERF.A16基因、蛋白、其重组表达载体及应用，属于植物基因工程领域。

背景技术

[0002] 果实成熟是指在果实生长发育停止后发生的一系列生理生化反应的复杂有序过程，色泽、风味、香气、质地等多方面多会发生变化，并且果实成熟直接影响到果品的商品价值、采后储藏和市场竞争力。(Giovannoni，2004；Li et al.，2010；田世平，2013)。根据果实在成熟过程中是否出现出现呼吸峰，被分为呼吸跃变型和呼吸非跃变型(Leli E Vre J，1997)。番茄、苹果、香蕉、桃等在果实成熟过程中呼吸强度骤然上升，乙烯释放量增加，均为跃变型果实。葡萄、柑橘、草莓柠檬等在成熟过程中呼吸强度和乙烯释放量没有显著上升，均为非跃变型果实。

[0003] 乙烯是植物体内一种重要的内源激素。果实生长发育和成熟的过程都与乙烯有密切关系。乙烯合成基本途径：蛋氨酸(Methionine，Met)→S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)→1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-amino cyclopropane-1-carboxylic acid,ACC)→乙烯。其中，ACC合成酶(ACS)和ACC 氧化酶(ACO)是两个关键酶。(Hoffman et al，1984；殷学仁，2009；韩延超， 2016)。呼吸跃变型果实的成熟伴随大量乙烯释放。乙烯产生后，随即开启其信号转导之路。首先乙烯与受体结合(ETR)，ERF进一步激活下游的乙烯的三重反应(CTR)，EIN2(Ethylene insensitive 2)和EIN3/EILs(Ethylene insensitive 3/Ethylene insensitive 3-like)位于CTR下游，是乙稀信号传导途径中的正调因子，可以结合乙烯响应因子ethylene response factor(ERF)的转录因子(ERF TFs)上游区域(Alexander and Grierson 2002；Guo and Ecker 2003；Solano et al.1998,Gu et al.2017)。ERF是乙烯信号转导途径上最后的调控因子，可以结合多个乙烯响应基因的启动子，从而调控乙烯反应。

[0004] ERF家族是植物体特有的转录因子，广泛存在植物中。据报道ERF转录因子在植物的生长发育、果实成熟、新陈代谢和抗逆过程中发挥着重要作用。其主要特点是含有核定位信号、具有DNA结合功能的ERF/AP2结构域、转录调控功能。拟南芥中将ERF家族划为5个亚家族：ERF、AP2、DREB、RAV和其他。 (Sakuma et al.,2002)。ERF蛋白作为转录因子可以通过特异性的结合启动子的顺式作用元件GCC-box、DRE/CRT来调控基因的表达(Ohme-Takagi and Shinshi, 1995；Solano et al.,1998；Xiao et al.,2013.韩延超,2016)。目前在番茄、香蕉、苹果、番木瓜、龙眼，猕猴桃等果实成熟过程中均有报道ERF作为乙烯信号转导途径的最后调控因子，可以直接调控下游基因，例如ACO、ACS、PG、EXP 和PSY(Han et al.2016；Lee et al.2012；Liu et al.2014.)。在番茄中，Tournier等人最早从番茄中分离出5个ERF基因,即LeERF1～LeERF4和LeERF3b(Tournier et al.,2003)。Zhang.等人已经验证了LeERF2可以结合LeACO3基因启动子中的 GCC-box来调控并促进乙烯合成(Zhang et al.,2009)；在苹果中，MdERF3可以促进MdACS2的转录表达，MdERF2可以直接抑制MdACS2和MdERF3表达； (Li et al.,2016)；在番木瓜中，通过对ERFs进行q RT-PCR分析发现，CpERF2 和CpERF3的表达在番木瓜成熟进程中变化非常明显，说明它们与番木瓜果实成熟有紧密联系(Li et al.,2013)；在香蕉中，MaERF9和MaERF11都可以通过结合MaACO启动子中GCC-box顺式作用元件分别促进和抑制MaACO的表达 (Xiao et al.,2013)。中国专利文献CN107686840A公开了从梨中分离克隆得到的 Py ERF3基因，用于促进梨果皮花青苷的生物合成。中国专利文献CN106047890A 公开了调控柑橘果皮脱绿的关键乙烯响应因子CitERF6，可调控叶绿素降解。

[0005] 目前，针对桃果实成熟性状的研究还相对较少，仅参与调控桃果实软化性状的PG(polygalacturonase，多聚半乳糖醛酸酶)基因和参与调控桃果实成熟性状的乙烯上游合成基因ACS和ACO已获初步确认。而其它与桃果实成熟表型相一致的结构基因和转录因子至今尚无报道。因此，本研究通过对AP2/ERF基因家族的基因组和转录组数据以及PG、ACS和ACO基因家族的分析，试图分离出调控果实成熟的ERF基因。此外，通过农杆菌介导瞬时转法对桃果实中的ERF 基因进行了沉默和过表达，并对其与成熟相关基因的相互作用进行了研究。

发明内容

[0006] 本发明目的是提供一种与果实成熟相关的桃转录因子PpERF.A16基因，属于ERF家族成员，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码区序列(CDS) 长度为966bp，编码321个氨基酸，编码的蛋白其氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示，等电点为5.05，分子量为79.72KD。

[0007] 本发明还提供了含有本发明所述PpERF.A16基因的重组表达载体。

[0008] 所述的重组表达载体，优选以pCAMBIA1301为出发载体，所述PpERF.A16 基因的插入点为Xbal和HindIII之间。

[0009] 本发明还提供了含有本发明所述PpERF.A16基因的宿主菌。

[0010] 以及克隆本发明所述PpERF.A16基因的cDNA序列的引物对，上游引物 PpERF.A16-F1序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物PpERF.A16-R1序列如SEQ ID NO.4所示。

[0011] 本发明的另一目的是提供该基因的应用。

[0012] 包括PpERF.A16基因在促进桃乙烯合成中的应用。

[0013] 以及重组表达载体在促进植株乙烯合成中的应用。

[0014] 利用软件和转录组数据构建系统发育树并对相关基因进行qRT-PCR分析。

[0015] 利用qRT-PCR技术分析，PpACS.A1,PpACO.A1和PpERF.A16与果实成熟有关。

[0016] 构建PpERF.A16超表达载体和沉默载体，通过农杆菌介导瞬时转化桃果实中表明，pPr.A16的超表达和沉默分别增加和减少PpACS.A1,PpACO.A1基因的乙烯产量和表达水平。

[0017] 利用双荧光素酶报告基因系统分析了PpERF.A1和PpACS.A1,PpACO.A1基因的互做关系，结果表明PpERF.A1和PpACS.A1,PpACO.A1基因的启动子相互作用。

[0018] 利用酵母单杂交分析揭示了PpERF.A1通过结合它们的启动子介导PpACS.A1 和PpACO.A1表达。

[0019] 与现有技术比，本发明具有以下优点和效果：

[0020] PpERF.A16基因的发现，为促进乙烯合成的分子育种提供新的基因资源，为实施绿色农业提供新的遗传资源，该资源的开发利用有利于提高桃果实的商品价值，延长果实货架期，有利于降低农业成本和实现环境友好。

附图说明

[0021] 图1为桃、苹果、草莓、木瓜、柑橘和葡萄内的ACS基因的系统进化树。

[0022] 图2为桃、苹果、草莓、木瓜、柑橘和葡萄内的ACS基因的系统进化树。

[0023] 图3为从桃、苹果、草莓、番木瓜、桔子和葡萄中分离出AP2/ERF转录因子的系统进化树。

[0024] 图4为ACS基因对桃果实成熟的响应

[0025] (A)桃树ACS基因的表达分析；

[0026] (B)qRT-PCR检测果实成熟前后PpPACS.A1的表达水平；

[0027] 标准误差和方差分析由t检验计算。双星代表在P值＜0.01的水平上有显著差异。NS和ZH是南山甜桃和朝晖两个栽培品种，S1、S2、S3和S4分别是小果、石坚、成熟、成熟阶段的果实。

[0028] 图5为ACS基因的染色体定位。

[0029] 图6为ACO基因对桃果实成熟的响应

[0030] (A)桃树ACO基因的表达分析；

[0031] (B)qRT-PCR检测果实成熟前后PpACO.A1.1.1和PpACO.A3的表达水平。

[0032] 图7为ACO基因的染色体定位。

[0033] 图8为桃果实成熟过程中ERF基因的鉴定

[0034] (A)从桃中分离到的ERF基因的表达分析；

[0035] (B)qRT-PCR检测PpERF.A16、PpERF.A29和PpERF.A31.1在成熟前后果实中的表达水平。

[0036] 图9为ERF基因的染色体定位。

[0037] 图10为本发明克隆基因PpERF.A16超表达和沉默载体分别通过农杆菌瞬时转化侵染桃果实后乙烯释放量分析示意图。

[0038] 图11为本发明克隆基因PpERF.A16超表达和沉默载体分别通过农杆菌瞬时转化侵染桃果实后PpERF.A16和PpACS.A1、PpACO.A1.1的qRT-PCR表达量分析图。小写字母a、b、c代表P值＜0.05的显著差异。

[0039] 图12为本发明克隆基因PpERF.A16与PpACS.A1、PpACO.A1.1启动子中 GCC-box相结合的示意图。

[0040] 图13为双荧光素酶报告基因系统分析克隆基因PpERF.A16对PpACS.A1、 PpACO.A1.1启动子的调节作用。其中九个生物复制用于双荧光素酶分析。小写字母a和b代表P值＜0.05的显著差异。

[0041] 图14为酵母单杂实验结果PpERF.A16和PpACS.A1、PpACO.A1.1之间的相互作用。

具体实施方式

[0042] 以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下描述和实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且爱不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

[0043] 实施例1构建系统发育树和相关基因qRT-PCR分析

[0044] 1、从桃基因组数据库(Rosaceae、http://www-RuxaA.Org)和其他果树(包括苹果、草莓、番木瓜、桔子和葡萄)(http://PosiZoM.jig.doe.gov)下载ACS、 ACO和ERF家族成员的核苷酸序列和氨基酸序列。所有的基因在美国国家生物信息技术中心(NCBI；HTTPS://www.NcB.NLM.NIH.GOV/)中进行了预测，并将预测基因分类。所下载的氨基酸序列通过CulsTAL X对齐，使用软件MEGA 6 构建基于邻接(NJ)的系统发生树。结果表明：

[0045] 1.1从桃基因组中检测到6个ACS基因家族成员，可分为A、B、C三个组， A和C组由两个亚组组成(图1)。这些基因被命名为PpACS.A1、PpACS.A2、 PpACS.B1、PpACS.B2、PpACS.C1和PpACS.C2(表1)。

[0046] 1.2从桃基因组中分离到36个ACO基因家族成员，可分为A、B和C三个组，每组分别包含7，2，7个亚组(图2)，并将这些基因命名(表2)。

[0047] 1.3从桃基因组中得到106个AP2/ERF转录因子，可分为A、B两组，A组与由56个簇组成的亚家族ERF相同，B组包含亚家族AP2、RAV和soloist，分别由5,1，5个簇组成(图3)。

[0048] 2、根据转录组数据，采用南山甜桃和朝晖两个品种，在果实发育期(S1-S3) 和成熟(S4)期转录水平上分析ACS、ACO和AP2/ERF基因。

[0049] 2.1在两个品种南山甜桃和朝晖中PpACS.A1的在果实成熟期的表达量中比果实生长发育期的表达量要高(图4A)。此外，qRT-PCR检测表明在所有12 个桃品种中，PpACS.A1在果实成熟中的表达水平高于果实成熟前期的表达水平 (图4B)。这些结果表明，定位于2号染色体上的PpACS.A1(图5)与桃果实成熟有关。

[0050] 2.2表达分析表明在南山甜桃和朝晖两个品种中，两个基因PpACO.A1.1.1 和PpACO.A3在果实成熟期的表达量比果实生长发育期表达量高，表明这两个基因可能参与果实成熟(图6A)。然而，qRT-PCR检测表明，在12个品种的成熟果实中发现PpACO.A3的表达水平较高，果实成熟期中的PpACO.A1.1.1表达水平高于果实成熟前的表达水平(图6B)。因此，定位于3号染色体上的 PpACO.A1.1.1基因(图7)与桃果实成熟有关。

[0051] 2.3表达分析表明在两个品种南山甜桃和朝晖中，三个ERF基因PpERF.A16、PpERF.31.1和PpERF.A29在成熟果实中的表达量均高于果实发育期的表达量(图8A)，表明这三个基因可能与果实成熟有关。然而，qRT-PCR检测表明在12个品种的成熟果实中发现，PpERF.31.1和PpERF.A29在果实成熟前期和果实成熟期中表达水平相似，而PpERF.A16在果实成熟时期表达量高于果实成熟前期(图8B)。因此，位于第8染色体末端的PpERF.A16(图9)很可能参与调节果实成熟。

[0052] 实施例2PpERF.A16基因分离克隆与载体构建

[0053] 1、采用多酚多糖类物质的植物总RNA提取试剂盒(购自TIANGEN公司，按照试剂盒说明书操作)从桃的果肉中抽提RNA，经反转录得到的第一链cDNA 用于扩增PpERF.A16基因全长。扩增基因引物对为：PpERF.A16-F1：(SEQ ID NO.3)；PpERF.A16-R1：(SEQ ID NO.4)。50ul的反应体系中包括2ul上述引物，17ul ddH2O，25ul 2×Buffer,1ul dNTP,2ul cDNA模板，1ul高保真酶(Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase)(购自Vazyme公司)。PCR反应在eppendor pcr 扩增仪上按以下程序完成：95℃，预变性3分钟，95℃变性30秒，60℃退火
30 秒，72℃延伸1分钟，30个热循环，循环完成后72℃延伸10分钟，20℃5分钟。

[0054] 2、PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，将产生的目的条带按照AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒说明书操作回收。回收纯化后的PCR产物和已用XbaI和HindIII 双酶切完成的pCAMBIA1301通过重组酶进行重组(购自Vazyme公司)，重组体系按照一步克隆重组试剂盒说明书操作。将重组产物采用热击法(参照《分子克隆实验手册》第三版，科学出版社，2002)转化大肠杆菌DH5ɑ，均匀涂在含有50mg/L卡娜霉素的LB固体平板上，筛选阳性克隆，挑取6个阳性克隆测序。测序结果表明，本发明扩增的目的片段长度为966bp，其核苷酸序列为序列表 SEQ ID NO.1所示。通过序列比对分析，确定该序列是本发明需要的目的基因。

[0055] 实施例3PpERF.A16基因超表达和沉默载体的构建

[0056] 1、根据pCAMBIA-1301载体的多克隆位点和PpERF.A16基因的编码区序列上的酶切位点分析，选择XbaI和HindIII作为内切酶。按照一般设计引物原则用Primer 5.0软件设计出带有酶切位点的引物，其引物对序列如下所示：

[0057] PpERF.A16-F1：ttggatccAGGAATGTGTGGCGGTGCTAT(SEQ ID NO.3)

[0058] PpERF.A16-R1：aatctagaTTACGGAGCAGAAACGCGGTCG(SEQ ID NO.4)

[0059] 以测序正确的保存菌液提取质粒为模板，进行含有限制性内切酶位点基因的克隆。PCR扩增的退火温度为60℃，PCR反应体系及扩增程序同实施例1。pCAMBIA-1301载体用和两个酶(购自NEB公司)进行双酶切，酶切总体系为50ul：载体质粒5ul，CutSmart Buffer缓冲液5ul，和各1ul，ddH2O 38ul。放于37℃酶切3-4小时，酶切产物用AxyPrep清洁试剂盒进行纯化。(操作过程按照说明书进行)。将PCR产物和纯化后双酶切产物重组连接，并转化大肠杆菌DH5ɑ，均匀涂在含有50mg/L卡娜霉素的LB固体平板上，筛选阳性克隆，抽提质粒进行酶切及PCR鉴定，测序结果确定没有读码框突变，获得含有插入片段的重组载体，将其命名为超表达载体pCAMBIA1301-PpERF.A16。应用冻融法将重组质粒导入农杆菌EHA105中。

[0060] 2、根据PSAK-277载体的多克隆位点和PpERF.A16基因的编码区序列上的酶切位点分析，选择KpnI和XbaI作为内切酶。设计引物方法和构建 PSAK277-RNAi-PpERF.A16沉默载体方法均同上。并将沉默载体质粒利用电激法转入农杆菌GV3101中。

[0061] 设计出带有酶切位点的引物，其引物对序列如下所示：

[0062] PpERF.A16-F2：ccgaattcAGGGGTTGACCTCCATGAATCTTGT(SEQ ID NO.5)[0063] PpERF.A16-R2：tcggtaccAGAGATCACCAACCATGCCTT(SEQ ID NO.6)

[0064] 实施例4桃果实的瞬时转化

[0065] 分别挑取含超表达载体pCAMBIA1301-PpERF.A16的农杆菌单菌落于含有卡那霉素和利福平抗性的液体培养基中、沉默载体PSAK277-RNAi-PpERF.A16 的农杆菌单菌落于含有壮观霉素和利福平抗性的液体培养基中，同时以含空载体 pCAMBIA1301和PSAK277的农杆菌为对照。28℃，220rpm培养24-48h。然后，将各农杆菌在含40ml液体培养基的三角瓶中扩大培养至OD600为0.8-1.0。离心机4℃条件下，5000g，离心10分钟，弃上清收集菌液，然后重新悬浮于侵染液中(10mM Mgcl2,10mM MES,pH＝5.7,200μM乙酰丁香酮)，5000g，离心10分钟，弃上清收集菌液，并重复一次。最后用侵染液悬浮放置TY-80B小摇床(南京普阳)每分钟60rpm摇3h，静置1h。

[0066] 3、取上述各菌液用1ml注射器注射桃果实霞晖6号，桃果实在商品采收前 7天收集。所有的分析都是通过三个生物学重复获得的，每个生物学重复至少包含四个桃果实。

[0067] 实施例5qRT-PCR分析瞬时转化桃果实中PpERF.A16、PpACS.A1和 PpACO.A1.1的表达水平

[0068] 取细菌覆盖的果肉进行qRT-PCR检测。采用多酚多糖类物质的植物总RNA 提取试剂盒(购自TIANGEN公司，按照试剂盒说明书操作)从案例3中被侵染的桃果肉中抽提RNA，经反转录得到cDNA。qRT-PCR是在LigthtCycler 480II/96 热循环中进行的。试剂盒是LightCycler 480SYBR Green I Master及qPCR 96孔板均有Roche公司提供。qPCR反应体系：SYBR Green I Master 10ul，ddH20 4ul，正向引物2.5ul，反向引物2.5ul，cDNA 1ul。反应程序为:95℃变性15s，60℃退火30s，45个循环。所有分析均由三个独立的生物学重复完成。桃Ppa008668m 基因作为内参基因。所有引物序列都在表3中。qRT-PCR结果显示在注射含 PpERF.A16超表达载体的果肉中PpACS.A1和PpACO.A1.1的表达量上升(图 10)，在注射含PpERF.A16沉默载体的果肉中PpACS.A1和PpACO.A1.1的表达量下降(图11)。这些结果表明，pERF.A16可以通过刺激pPACS.A1和 PpACO.A1的活性来介导乙烯生物合成。

[0069] 实施例6乙烯测量

[0070] 使用乙烯探测器测量了每个被侵染的果实乙烯的释放量(购自深圳普利通电子科技有限公司)。在室温下至少六个已被侵染的桃果实被独立地放入一个3 升的密闭罐中3小时，然后用软木塞把罐子密封起来，用软管输送气体。在对乙烯检测器进行零校准后，探头与软管连接以接收释放的气体。测定释放的乙烯产量，并将浓度显示在监视器上。结果显示注射含PpERF.A16超表达载体的桃果实乙烯的释放量高于注射含PpERF.A16沉默载体的桃果实乙烯的释放量。(图12) 表明PpERF.A16具有促进乙烯合成的作用。

[0071] 实施例7原生质体分离和双荧光素酶测定

[0072] 1、从桃霞晖6号果肉中扩增ACS和ACO启动子密码子上游2000bp序列，扩增产物插入到PGRILII0800-LUC载体中，并构建PGRILII0800-LUC-ACS和 PGRILII0800-LUC-ACO两个载体。构建载体的方法同实施例2。

[0073] 扩增引物序列为

[0074] PpACS.A1-F：tgggtaccTGCAGTATGTCCGTTCCTTGGC(SEQ ID NO.7)

[0075] PpACS.A1-R：tcaagcttGGTTCCAAAGAATACTCACACACAAG(SEQ ID NO.8)

[0076] PpACO.A1.1-F：tgggtaccAAGAGACATATCAGGTGATGAAAGAACG(SEQ ID NO.9)[0077] PpACO.A1.1-R：tcaagcttGTGAAGTGGAGTTTGGTGTGG(SEQ ID NO.10)

[0078] 2、从3至5周龄的每天光照8小时的植物中提取的原生质体。将重组质粒转入原生质体暗培养18小时。使用双荧光素酶 报告分析系统(购自PROMEGA 公司)对已转入重组质粒的原生质体进行处理(按照试剂盒说明书进行具体操作)，用酶标仪进行进行荧光强度检测。在三个独立的试验中进行测量，每个试验三个生物学重复(n＝9)。结果表明PpERF.A1和PpACS.A1,PpACO.A1.1基因的启动子相互作用(图13)。

[0079] 实施例8酵母单杂交

[0080] 从桃果肉中克隆出ACS和ACO基因启动子中克隆了2条约2000bp的序列。预测GCC-box元件。将含有GCC-box的片段连接pAbAi载体中。同时，将分离的PpERF.A16基因的全长序列插入到pGADT7载体中。酵母单杂交(Y1H) 检测使用酵母单杂交文库筛选系统进行。结果表明PpERF.A1通过结合 PpACS.A1和PpACO.A1的启动子介导其表达(图14)。所有引物均在表4中列出。

[0081] 表1：桃中分离的ACS基因

[0082]

[0083] 表2：桃中分离的ACO基因

[0084]

[0085]

[0086] 表3：桃qPCR的引物

[0087]Gene Forward primer(5’→3’) Reverse primer(5’→3’)
PpACS.A1 GAGTTCAGAAAGGCTGTGGCTATG ATCCCAAGTCTCGGTAAAATGCT
PpACO.A1.1 AGGTCAATGATATGGACTGGGAAAG AGGGTTGGGACAAGGAGGGTAG
PpERF.A16 GGGGTTCGAGTTTGGCTTGGT GGAATGTCGTCGTCTTCGTTGG
内参 AAGGCTAAGATCCAAGACAAAGAG CCACGAAGACGAAGCACTAAG

[0088] 表4：载体构建的引物

[0089]

[0090] 参考文献

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