使用NANOG引入的源自羊水胎儿的间充质干细胞制备用于促进毛发生长的组合物的方法转让专利
申请号 : CN201680066819.5
文献号 : CN108603167B
文献日 : 2022-01-21
发明人 : 刘承权 , 全恩暻 , 朴正贤 , 尹愿真 , 孙多练
申请人 : 思特科技公司
摘要 :
权利要求 :
1.一种由Nanog过表达的源自羊水胎儿的间充质干细胞生产包括碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素类生长因子(IGF)、无翅型MMTV整合位点家族成员7A(Wnt7a)和血小板来源生长因子PDGF‑AA的人生长因子的方法,所述方法包括:(a)从由孕妇获得的羊水中分离胎儿细胞;
(b)通过在含有胎牛血清(FBS)、bFGF、硒和抗坏血酸的培养基中传代培养分离的所述胎儿细胞来获得源自羊水胎儿的间充质干细胞;
(c)通过将Nanog引入到所获得的源自羊水胎儿的间充质干细胞中来获得Nanog过表达的源自羊水胎儿的间充质干细胞;以及
(d)通过在无血清培养基中培养所获得的Nanog过表达的源自羊水胎儿的间充质干细胞1至5天来制备含有bFGF、IGF、Wnt7a和PDGF‑AA的条件培养基。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,在步骤(c)中,使用逆转录病毒载体引入Nanog。
3.一种制备用于促进毛发生长的组合物的方法,所述组合物包含条件培养基作为活性成分,所述条件培养基含有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素类生长因子(IGF)、无翅型MMTV整合位点家族成员7A(Wnt7a)和血小板来源生长因子PDGF‑AA,并且来自Nanog过表达的源自羊水胎儿的间充质干细胞,所述方法包括:(a)从由孕妇获得的羊水中分离胎儿细胞;
(b)通过在含有胎牛血清(FBS)、bFGF、硒和抗坏血酸的培养基中传代培养分离的所述胎儿细胞来获得源自羊水胎儿的间充质干细胞;
(c)通过将Nanog引入到所获得的源自羊水胎儿的间充质干细胞中来获得Nanog过表达的源自羊水胎儿的间充质干细胞;
(d)通过在无血清培养基中培养所获得的Nanog过表达的源自羊水胎儿的间充质干细胞1至5天来制备含有bFGF、IGF、Wnt7a和PDGF‑AA的条件培养基;以及(e)制备包含所制备的条件培养基作为活性成分的组合物。
4.根据权利要求3所述的方法,其中,在步骤(c)中,使用逆转录病毒载体引入Nanog。
说明书 :
使用NANOG引入的源自羊水胎儿的间充质干细胞制备用于促
进毛发生长的组合物的方法
技术领域
背景技术
干细胞(ES细胞),从胚胎期的原始生殖细胞中分离的胚胎生殖细胞(EG细胞)和从成人骨髓
中分离的多潜能成人祖细胞(MAPC细胞)。
细胞具有与骨髓来源的间充质干细胞相似的特征。
用的羊水细胞在测试后被处置,并且当患者同意时,可以将细胞用于研究而不处置,因此与
常规研究的其它成人干细胞相比,可以容易地获得大量的羊水细胞。
毛发乳头变得更小,毛发的厚度减小,毛发周期变短,并且新生长的毛发变得更薄。因此,当
秃发进行时,毛发变成蓬松的毛发,具有较短的生长周期,然后稍微生长后脱落。秃发的主
要原因是遗传,并且已知雄性激素睾酮参与秃发基因的表达。许多情况下,由于老龄化、压
力等原因脱发,不是因为遗传性秃发。众所周知,老龄化相关的脱发是由毛孔周围受毛细血
管压迫导致的血液循环不畅引起的,这是由于根据头皮细胞减少和头皮脂肪累积量的增
加,毛孔闭合导致的氧供应减少而产生的。另外,压力、不规则的生活方式和环境污染也被
认为会导致秃发。
证明在一定程度上是有效的适用生发剂米诺地尔和含有非那甾胺作为主要成分并由于对
雄性激素的活化具有抑制作用而表现出其作用的口服生发剂非那雄胺已被广泛用作在防
止脱发中效果优异的试剂。然而,上述生发剂在一定程度上有效地防止脱发,但对毛发生长
并没有表现出显著影响。也就是说,当停止使用生发剂时,脱发会再次发生,并且由于长期
使用,对副作用和成本增加有很大担忧。出于这个原因,大多数患者正在放弃治疗。
发生长作用是有效的。另外,本发明人通过体内实验证实了条件培养基对促进毛发密度和
毛发生长的作用,从而完成了本发明。
发明内容
胞生产的人生长因子。
人生长因子,以及其化妆品或药物组合物。
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素类生长因子 (IGF)、无翅型MMTV整合位点家族成
员7A(Wnt7a)和血小板来源生长因子 (PDGF‑AA)组成的组中的任一种或多种人生长因子的
方法,并且更具体地,涉及一种用于由Nanog过表达的源自羊水胎儿的间充质干细胞生产选
自由 bFGF、IGF、Wnt7a和PDGF‑AA组成的组中的任一种或多种人生长因子的方法,该方法包
括:
生长因子的条件培养基。
它组织中,并由此获得。由于由孕妇获得的羊水含有胎儿体内生成的各种化学物质,所以可
以生成人体内的大部分细胞,并且很容易进行采样。此外,证实了异质细胞存在于羊水中,
并且在这些细胞中,存在具有与成纤维细胞相同形状的均质MSC,这是MSC的特征。
培养条件可以根据细胞的类型来选择。培养基优选为细胞培养最低限度培养基(CCMM),通
常包括碳源、氮源和微量元素。这种CCMM包括Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、最小必需
培养基(MEM)、Eagle基础培养基(BME)、RPMI1640、F‑10、F‑12、α最小必需培养基(αMEM)、
Glasgow 最小必需培养基(GMEM)和Iscove改良Dulbecco培养基(IMEM)。另外,细胞培养最
低限度培养基(CCMM)可以包括抗生素,例如青霉素、链霉素或庆大霉素。
含FBS的低葡萄糖DMEM中培养细胞来获得,并且更优选地,通过在补充有4ng/ml的bFGF、
5ng/ml的硒、50μg/ml的抗坏血酸、 1%的L‑谷氨酰胺和1%的青霉素‑链霉素的10%FBS低
葡萄糖DMEM中培养细胞来获得,但是本发明并不限于此。
改变为功能特异性细胞。其中,受精卵的细胞是全能性的,并且正在发育成囊胚,可以区分
为内细胞团细胞和外细胞。内细胞团细胞可以生成胚胎体细胞和生殖细胞,这称为多能性。
内细胞团细胞也称为胚胎干细胞,并表达多能性特异性基因(重编程因子)。基因的具体实
例是Oct4、Sox2、 Nanog和Lin28。重编程是在体细胞中诱导这种多能性特异性基因表达的
技术,并且因此使细胞具有与胚胎干细胞相似的性质。根据这样的背景,本发明在各种重编
程因子中独立使用Nanog。因此,1)当引入多个外源基因时,存在对细胞特征变化的担忧,2)
当使用病毒引入多种因子时,难以成功构建细胞系,以及3)证实了当独立引入Nanog时,可
以连续维持细胞系(参见图15)。
一种含有选自由bFGF、IGF、Wnt7a和PDGF‑AA组成的组中的任一种或多种人生长因子以培养
Nanog过表达的源自羊水胎儿的MSC 的条件培养基。
培养溶液与培养基质混合而制备的培养基。该培养基使用从培养基中的分裂细胞提取的未
知生长因子,并广泛用于低密度细胞培养或原生质体培养。
地,提供了一种制备用于促进毛发生长的组合物的方法,该组合物包含条件培养基作为活
性成分,所述条件培养基含有选自由bFGF、IGF、 Wnt7a和PDGF‑AA组成的组中的任一种或多
种人生长因子,并且由Nanog过表达的源自羊水胎儿的MSC产生,该方法包括:
子的条件培养基;以及
factor and epidermal growth factor in hair development.J Invest Dermalto.101:
106S‑113S,1993)、IGF(Nicole等,IGF‑I signaling controls the hair growth cycle
and the differentiation of hair shafts.J Invest Dermalto 125:873‑882, 2005)、
PDGF‑AA(Tomita等,PDGF isoforms induce and maintain anagen phase of murine
hair follicles.Journal of dermatological science 43(2):105‑15,2006)或Wnt7a
(Kishimoto等,Wnt signaling maintains the hair‑inducing activity of the dermal
papilla.Genes&Development 14:1191‑1185,2000)已知作为刺激毛发生长的生长因子。
蛋白4(MIP4)、基质金属蛋白酶3(MMP3)、趋化因子(Rantes)、干扰素γ(IFNγ)、转化生长因
子β(TGFβ)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、肿瘤坏死因子受体Ⅰ(TNFRⅠ)、肿瘤坏死因子受体Ⅱ
(TNFRⅡ)、细胞间粘附分子1 (ICAM1)、血管细胞粘附分子1(VCAM1)、血管内皮生长因子、白
介素‑1β (IL‑1β)、白细胞介素‑1受体α(IL‑1Rα)、IL‑2、IL‑3、IL‑4、IL‑5、IL‑6、IL‑6R、 IL‑
7、IL‑8、IL‑12或IL‑15的生长因子,但已知这种生长因子促进毛发生长的效果尚未得到证
实。
的组合的表达水平显著增加,因此可以进一步提高增强毛发生长的效果。
在生长期随后的步骤中形成的形状,并且还证实了扩增长度多态性(ALP)、LEF、蛋白聚糖
(Versican)和Hey的mRNA在毛发生长期高度表达。
进毛发生长的组合物,其包含条件培养基作为活性成分,所述条件培养基含有选自由bFGF、
IGF、Wnt7a和PDFG‑AA组成的组中的任一种或多种人生长因子,并且由Nanog过表达的源自
羊水胎儿的MSC产生,更具体地,提供了一种通过制备用于促进毛发生长的组合物的方法制
备的用于促进毛发生长的组合物。
处理小鼠时的快速毛发生长,从而促进毛发生长、毛发再生和防止脱发。
剂、填充剂、金属离子掩蔽剂、螯合剂、防腐剂、维生素、封闭剂、润湿剂、精油、染料、颜料、亲
水型活化剂或亲液型活化剂或通常用于美容或皮肤病学领域的添加剂,例如通常用于脂质
囊泡或化妆品产品中的任何其它组分。该添加剂以美容或皮肤病学领域中通常使用的量引
入。
中获得的乳化剂、悬浮液、微乳化剂、微胶囊、微粒细胞或离子(脂质体)和非离子型囊泡分
散剂、霜剂、皮肤软化剂、洗剂、粉剂、药膏、喷雾剂或遮瑕膏。该组合物可以通过本领域常规
使用的方法制备。根据本发明的组合物还可以以还含有压缩推进剂的泡沫或气雾剂组合物
的形式使用。
面膜、粉剂、身体洗剂、身体霜、身体油、身体精华、头发营养液、护发素、头发精华、头发洗
剂、头发滋养洗剂、洗发水、染发液、头发护理剂、护发霜、头发滋养霜、头发保湿霜、头发按
摩霜、发蜡、头发气雾剂、头发发膜、头发滋养发膜、头发皂、头发清洁泡沫、头发油、头发干
燥制剂、头发保护护理剂、染发剂、烫头制剂、头发脱色剂、发胶、头釉、美发剂、头发啫喱、头
发保湿剂、头发摩丝或喷发定型剂。
剂,但本发明并不限于此。
并且通过将一种或多种化合物与至少一种或多种赋形剂例如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖或明
胶混合来制备。另外,除了简单的赋形剂之外,还可以使用润滑剂如硬脂酸镁、滑石粉等。用
于口服施用的液体制剂可以包括悬浮剂、内用液体、乳化剂、糖浆剂等,以及除了常用的简
单稀释剂如水或液体石蜡之外的各种赋形剂(如润湿剂、甜味剂、香料、防腐剂等)。胃肠外
施用制剂包括无菌水溶液、非水溶剂、悬浮剂、乳化剂、冻干剂和栓剂。作为非水溶剂或悬浮
溶剂,可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)、或可注射酯(如油酸乙酯)。作为栓剂
的基剂,可以使用Witepsol、Microgol、吐温61、可可油脂、月桂酸甘油酯或甘油明胶。
酸、硫酸、硝酸、磷酸、氢氟酸、氢溴酸、甲酸、乙酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、富马酸、马来酸、琥
珀酸、甲磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸或萘磺酸。
别、健康状况、饮食、施用时间、施用方法、施用途径、排泄速率和疾病的严重程度而变化。
下、子宫内、硬膜外或脑室内注射进行施用。
源的条件培养基的定量和定性损失,并且使得难以维持均一组合物,导致难以大规模生产
和条件培养基以及包含其作为一种有效成分的组合物的产业化。因此,本发明人引入重编
程技术以培养MSC。根据以前的研究,已知根据MSC中多能性因子的表达发生干细胞方面的
变化。在这方面,将各种多能性因子Oct4、Nanog和Lin28引入到羊水来源的MSC中,并且其中
可以看出Nanog引入的羊水来源的MSC可以建立为细胞系并且连续培养,但其它基因的引入
诱导细胞死亡,并难以连续培养细胞(参照图15)。此外,证实了 Nanog引入的羊水干细胞比
传统的羊水干细胞在增强细胞生长和保存干细胞方面的作用中进一步改善。
用。Nanog引入的羊水来源的MSC较少表达β‑半乳糖苷酶(图5左侧),并且表现出比羊水来源
的MSC更低表达水平的p53和p21(图 5右侧)。因此,证实了由于Nanog的引入,延长了羊水来
源的MSC的寿命的效果。另外,在Nanog引入的羊水来源的MSC中的多能性特异性标记物Oct4
和Sox2的表达增强(图7),因此即使通过引入Nanog,羊水来源的MSC的干细胞特性是保守
的。
和9),并且由于Nanog的引入,在羊水来源的 MSC中促进了毛发生长因子的分泌。
步骤时,证实了用Nanog引入的羊水来源的MSC的条件培养基处理的组显示出在生长期的后
续步骤中的形状(图13),并且在用Nanog 引入的羊水来源的MSC的条件培养基处理的组中
高度表达在生长期步骤中高度表达的扩增长度多态性(ALP)、LEF、蛋白聚糖和Hey的mRNA
(图14)。因此,证实了当应用Nanog引入的羊水来源的MSC的条件培养基时,在体外和体内表
现出毛发生长促进作用。
于通过培养Nanog引入的源自羊水胎儿的MSC而制备的条件培养基表现出毛发生长促进作
用,所以该细胞可以用作用于促进毛发生长的化妆品和药物组合物。
附图说明
养基,bs:含有bFGF和硒培养基,bvs:含有 bFGF、抗坏血酸和硒培养基;
水来源的MSC,右:AFSC:羊水来源的MSC, AF‑Nanog:Nanog引入的羊水来源的MSC;
来源的MSC,正常AF:羊水来源MSC,右:AF:羊水来源的MSC,AF‑N:Nanog引入的羊水来源的
MSC,RT(‑):能够检测引物之间二聚体形成的阴性对照;
水来源的MSC,AF‑N:Nanog引入的羊水来源的MSC;
的MSC而制备的条件培养基中显示bFGF和 PDGF表达水平的ELISA(底部)结果的图集合;AF:
羊水来源的MSC,AF‑N: Nanog引入的羊水来源的MSC,AF CM:通过培养Nanog引入的羊水来
源的 MSC而制备的条件培养基,AF‑N CM:通过培养Nanog引入的羊水来源的MSC 而制备的
条件培养基;
的MSC而制备的条件培养基,AF‑N CM:通过培养Nanog 引入的羊水来源的MSC而制备的条件
培养基,Minox(米诺地尔):阳性对照;
制备的条件培养基,AF‑N‑CM:Nanog引入的羊水来源的MSC而制备的条件培养基,Minox(米
诺地尔):阳性对照;
MSC;AF‑CM:通过培养羊水来源的MSC而制备的条件培养基,AF‑N‑CM:通过培养Nanog引入的
羊水来源的MSC而制备的条件培养基;
源的MSC而制备的条件培养基,AF‑N‑CM:通过培养Nanog引入的羊水来源的MSC而制备的条
件培养基,米诺地尔:阳性对照;
Nanog引入的羊水来源的MSC;AF‑CM:通过培养羊水来源的MSC而制备的条件培养基;AF‑N‑
CM:通过培养Nanog引入的羊水来源的MSC而制备的条件培养基,米诺地尔:阳性对照,逆转
录(RT):能够检测引物之间二聚体形成的阴性对照;以及
入Oct4,Nanog:仅引入Nanog,Lin28:仅引入Lin28, Oct4+Lin28:引入Oct4和Lin28,Oct4+
Nanog:引入Oct4和Nanog,O+N+L:引入Oct4、Nanog和Lin28。
具体实施方式
向本领域的普通技术人员描述本发明。
水中分离出的胎儿细胞传代培养来获得羊水胎儿来源的 MSC。培养基的这种条件与bFGF处
理、bFGF和硒处理、bFGF和抗坏血酸处理的条件相比表现出羊水来源的MSC的生长效果进一
步提高(图1)。
林固定,然后对细胞进行结晶紫染色20分钟。细胞用10%乙酸脱色,并通过使用Ultrospec
2100pro分光光度计测量595nm处的乙酸的吸光度来进行定量分析。
2)。
离的Nanog基因连接到pMXs载体(Cell Biolabs,日本)中,从而制造pMXs‑Nanog。使用转染
试剂将pMXs‑Nanog载体转染到 293GPG细胞中6小时。72小时后,产生具有Nanog基因的病
毒,并分离上清液,以2000rpm离心10分钟,并使用0.45μm过滤器过滤。将病毒引入到已生长
至80%融合6小时的羊水来源的MSC中,导致感染进入到细胞中。
色。
总RNA逆转录为cRNA。试管在45℃保持60分钟,在95℃保持5分钟,然后保存于‑20℃备用。使
用Taq聚合酶(Promega)和Nanog mRNA特异性引物(Exo‑Nanog正向:5'‑
GCTTGGATACACGCCGC‑3'(SEQ ID NO:2);和Exo‑Nanog反向:5'‑GATTGTTCCAGGATTGGGTG‑3'
(SEQ ID NO: 3)扩增cDNA。在94℃20秒、60℃30秒和72℃2分钟的35个循环中重复进行 RT‑
PCR,并进一步在72℃10分钟以进行最终合成。通过在1%琼脂糖凝胶中电泳分析PCR产物。
5分钟。用含有3%FBS的PBST封闭细胞1小时,以 1:50的比例用检测Nanog受体的抗体
(AF276,R&D)处理1小时。之后,用 0.5%PBST洗涤细胞3次,每次5分钟,然后将以1:200比例
稀释的荧光标记的二抗(Alexa Fluor 488山羊抗人IgG,#A11013,Invitrogen,美国)处理1
小时。用1:1000的4',6‑二脒基‑2‑苯基吲哚(DAPI)溶液处理5分钟以进行核染色后,以与上
述相同的方式用PBST洗涤细胞三次。之后,使用荧光显微镜(Olympus DP70)使样品可视化。
的过表达(图3)。
羊水来源的MSC以5×10 个细胞/孔的密度接种在6孔板中,接着过夜,用PBS洗涤,然后固
定。根据β‑半乳糖苷酶染色试剂盒(Cell Signaling Technology,Beverly,MA)的方案,将
pH值6.0X‑gal发色底物在37℃培养过夜,然后用放大倍数为100倍的显微镜(Olympus
DP70)观察颜色变化。
cDNA。用Taq聚合酶(Promega)和对p53、p21 和甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶(GAPDH)的mRNA特异性
的引物扩增cDNA。p53特异性引物是p53正向引物:5’‑CCTCACCATCATCACACTGG‑3’(SEQ ID
NO:4) 和p53反向引物:5’‑TTATGGCGGGAGGTAGACTG‑3’(SEQ ID NO:5),p21 特异性引物是
p21正向引物:5’‑GGAAGACCATGTGGACCTGT‑3’(SEQ ID NO: 6)和p21反向引物:5’‑
AGGCAGAAGATGTAGAGCGG‑3’(SEQ ID NO:7),并且GAPDH特异性引物是GAPDH正向引物: 5’‑
GTGGTCTCCTCTGACTTCAACA‑3’(SEQ ID NO:8)和GAPDG反向引物: 5’‑
CTCTTCCTCTTGTGCTCTTGCT‑3’(SEQ ID NO:9)。通过在1%琼脂糖凝胶中电泳分析PCR产物,
并使用基于GAPDH mRNA的Quantity One软件定量相对mRNA表达水平。
半乳糖苷酶表达较少(图5的左侧),并且p53和p21表达水平降低(图5的右侧)。因此,证实了
Nanog引入导致延长羊水来源的MSC 的寿命的效果。
(SEQ ID NO:10)和纤连蛋白反向引物: 5’‑TGAGTTCTGTGCTGCTACCTTC‑3’(SEQ ID NO:11),
MMP1特异性引物是 MMP1正向引物:5’‑TTGAGAAAGCCTTCCAACTCTG‑3’(SEQ ID NO:12)和
MMP1反向引物:5’‑CCGCAACACGATGTAAGTTGTA‑3’(SEQ ID NO:13), Snail特异性引物是
Snail正向引物:5’‑CTCCTTCGTCCTTCTCCTCTACTT‑3’ (SEQ ID NO:14)和Snail反向引物:
5’‑TCTTGACATCTGAGTGGGTCTG‑3’ (SEQ ID NO:15),并且Slug特异性引物是Slug正向引物:
5’‑GACCCTGGTTGCTTCAAGGACA‑3’(SEQ ID NO:16)和Slug反向引物: 5’‑
TTGTCATTTGGCTTCGGAGTGA‑3’(SEQ ID NO:17)。
有太大效果。
marrow,adipose tissue,heart and dermis.Stem cell rep 5(4):378‑386.(2009))。为
了证实多能性干细胞是否由于Nanog引入而在干细胞中表达,通过定量逆转录聚合酶链式
反应(qRT‑PCR)分析实施例2中制备的Nanog引入的羊水来源的MSC Oct4和Sox2的mRNA表达
水平。
性引物进行扩增。Oct4特异性引物是Oct4正向引物:5’‑GACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGG‑3’
(SEQ ID NO:18)和Oct4 反向引物:5’‑CTTCCCTCCAACCAGTTGCCCCAAAC‑3’(SEQ ID NO:19),
Sox2 特异性引物是Sox2正向引物:5’‑ACCAATCCCATCCACACTCACGCA‑3’(SEQ ID NO:20)和
Sox2反向引物:5’‑GCAAACTTCCTGCAAAGCTCCTACCG‑3’ (SEQ ID NO:21)。通过比较阈值(CT)
循环分析靶标mRNA的相对量(Johnson MR等,Anal Biochem 2000;278:175‑184)。
因的表达增加。
表达水平和蛋白表达水平。
CAGATTAGCGGACGCGGTGC‑3’(SEQ ID NO:22)和bFGF 反向引物:5’‑TCACGGATGGGTGTCTCCGC‑
3’(SEQ ID NO:23),IGF特异性引物是IGF正向引物:5’‑CCATGTCCTCCTCGCATCTCTTCT‑3’
(SEQ ID NO: 24)和IGF反向引物:5’‑CCATACCCTGTGGGCTTGTTGAA‑3’(SEQ ID NO: 25),
Wnt7a特异性引物是Wnt7a正向引物: 5’‑TCTTTCTCAGCCTGGGCATGGT‑3’(SEQ ID NO:26)和
Wnt7a反向引物: 5’‑TCCTATGACGATGATGGCGTCG‑3’(SEQ ID NO:27),并且PDFG‑AA特异性引
物是PDGF‑AA正向引物:5’‑CTGCCCATTCGGAGGAAGAGAA‑3’(SEQ ID NO:28)和PDGF‑AA反向引
物:5’‑TGGCACTTGACACTGCTCGTGTT‑3’ (SEQ ID NO:29)。通过CT方法分析靶标mRNA的相对
量。
钠‑聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS‑PAGE)显色30μg含有蛋白的上清液以分离蛋白。将蛋白转移
到硝酸纤维素膜上,用4%脱脂奶粉封闭。之后,用一抗如抗‑bFGF抗体(Santa Cruz
Biotechnology,美国)、抗‑IGF 抗体(Santa Cruz Biotechnology,美国)、抗‑Wnt7a抗体
(Santa Cruz Biotechnology,美国)和抗‑PDGF‑AA抗体(Millipore,德国)处理该膜,在4℃
培养过夜,并用TBST(添加0.1%吐温20的Tris缓冲盐水(TBS))洗涤。用小鼠和山羊来源的
抗鼠IgG抗体(山羊抗小鼠IgG;Santa Cruz Biotechnology,美国)作为二抗和含有1%牛血
清白蛋白(BSA)的TBST处理该膜,培养1小时,然后进行免疫印迹。作为比较表达程度的对
照,使用抗α‑微管蛋白抗体(R&D,美国) 作为一抗,通过与上述相同的方法证实α‑微管蛋白
的表达。
PDGF‑AA蛋白的量通过使用ELISA试剂盒 (RayBiotech)测量条件培养基中的蛋白含量来确
定。对于ELISA,制备条件培养基,将标准品和样品用生物素抗体处理1小时,然后用链霉亲
和素处理45分钟。之后,将标准品和样品用TMB底物试剂处理30分钟,然后用停止溶液处理
以停止反应。使用微孔板分光光度计通过测量450nm处的吸光度对结果进行定量分析。
羊水来源的MSC(图8),并且蛋白的表达水平与图8所示的结果相同(图9的上部)。另外,在
Nanog引入的羊水来源的MSC 的条件培养基中比在羊水来源的MSC的条件培养基(图9的底
部)中鉴定出更大量的蛋白。因此,证实了由于Nanog引入而导致促进了羊水来源的MSC中的
毛发生长因子的分泌。
源的MSC和Nanog引入的羊水来源的MSC中提取条件培养基,并用于处理毛囊细胞(毛囊皮肤
乳头细胞),然后每隔一天通过结晶紫染色测量细胞数以确定相对生长率。在样品制备成具
有相同数量的细胞后20分钟进行结晶紫染色,并以2或4天的间隔进行10%福尔马林固定。
之后,细胞用10%乙酸脱色,并通过使用Ultrospec 2100pro分光光度计测量595nm处的乙
酸的吸光度以定量分析。
此,体外证实了Nanog引入的羊水来源的MSC的条件培养基影响毛囊细胞的生长。
度,即生长期(在背部产生棕色或黑色毛发的时期)。作为阴性对照,每天用50μl羊水来源的
MSC条件培养基处理,并且作为阳性对照,每天用50μl 10μM/ml米诺地尔处理。
小鼠的表皮组织,分离细胞,用与实施例3中所述相同的方法分离细胞的总RNA,并逆转录为
cDNA,并使用Taq聚合酶(Promega) 和对ALP、LEF、蛋白聚糖和Hey mRNA特异性的引物扩增
cDNA。ALP特异性引物是ALP正向引物:5’‑TGGCCCTCTCCAAGACGTACAA‑3’(SEQ ID NO: 30)和
ALP反向引物:5’‑TGGTTCACTCTCGTGGTGGTCA‑3’(SEQ ID NO:31), LEF特异性引物是LEF正
向引物:5’‑CTTCCTTGGTGAACGAGTCTG‑3’(SEQ ID NO:32)和LEF反向引物:5’‑
GTGTTCTCTGGCCTTGTCGT‑3’(SEQ ID NO: 33),蛋白聚糖特异性引物是蛋白聚糖正向引物:
5’‑AACTAGCCGTTGGAGTGGATTC‑3’(SEQ ID NO:34)和蛋白聚糖反向引物: 5’‑
AAATGCTCTGTGGCTCTGGA‑3’(SEQ ID NO:35),Hey特异性引物是Hey 正向引物:5’‑
GCCGACGAGACCGGATCAATAA‑3’(SEQ ID NO:36)和Hey 反向引物:5’‑
TCCCGAAATCCCAAACTCCGAPCR‑3’(SEQ ID NO:37)。通过在1%琼脂糖凝胶中的电泳分析所得
产物,使用基于GAPDH mRNA的Quantity One软件定量相对mRNA表达水平。
囊组织(图12)。另外,在处理条件培养基后的第5天,在组织学分析中区分生长期的步骤时,
证实了用Nanog引入的羊水来源的MSC 的条件培养基处理组显示出在生长期的后期步骤中
的形状,从而证实了Nanog 引入的羊水来源的MSC的条件培养基比阳性对照米诺地尔具有
更好的毛发生长促进效果(图13)。另外,证实了ALP、LEF、蛋白聚糖和Hey在用Nanog引入的
羊水来源的MSC的条件培养基处理组中更高度地表达(图14)。
4(Addgene,质粒#17217)载体引入Oct4基因(NCBI GenBank登录号NM_002701.5),并使用
pMXs‑hLin28A(Addgene,质粒#47902) 载体引入Lin28基因(NCBI GenBank登录号NM_
024674.4),并通过与实施例2 中所述相同的方法进行这种引入。通过将病毒组合注入细胞
来进行多种基因的引入。存在6个实验组,例如①仅引入Oct4的组,②仅引入Nanog的组,③
仅引入Lin28的组,④引入Oct4和Lin28组合的组,⑤引入Oct4和Nanog组合的组,以及⑥引
入Oct4、Nanog和Lin28组合的组(O+N+L)。使用显微镜(Olympus DP70)以40倍放大率拍摄图
像。