生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸及其用途转让专利
申请号 : CN201680069978.0
文献号 : CN108603206B
文献日 : 2022-03-18
发明人 : 全进佑 , 文准玉 , 朴陈承 , 崔秀眞 , 洪国基 , 金贞贤 , 朴惠民 , 洪昭妍
申请人 : CJ第一制糖株式会社
摘要 :
权利要求 :
1.产生生物基N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸的方法,其包括:(a) (i)通过微生物发酵产生L‑蛋氨酸前体;和(ii)通过酶促转化从所述L‑蛋氨酸前体产生L‑蛋氨酸;以及(b) 利用N‑酰基转移酶或产生所述N‑酰基转移酶的微生物乙酰化所述L‑蛋氨酸,其中所述N‑酰基转移酶选自恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)来源的N‑酰基转移酶(ppmat)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的N‑酰基转移酶(bsmat)和肠杆菌(Enterobacter sp.)638来源的N‑酰基转移酶(entmat)。
2.如权利要求1所述的方法,其中所述L‑蛋氨酸前体是O‑乙酰基‑L‑高丝氨酸或O‑琥珀酰基‑L‑高丝氨酸。
3.如权利要求1所述的方法,其中所述酶促转化通过选自以下的至少一种酶来进行:胱硫醚‑γ‑合酶、O‑乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶和O‑琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶。
4.产生生物基N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸的方法,其包括:(a) 通过微生物发酵产生L‑蛋氨酸;和(b) 利用N‑酰基转移酶或产生所述N‑酰基转移酶的微生物乙酰化所述L‑蛋氨酸,其中所述N‑酰基转移酶选自恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)来源的N‑酰基转移酶(ppmat)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的N‑酰基转移酶(bsmat)和肠杆菌(Enterobacter sp.)638来源的N‑酰基转移酶(entmat)。
5.如权利要求1‑4中任一项所述的方法,其中所述方法包括在步骤(b)供给乙酰辅酶A。
6.产生生物基N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸的方法,其包括通过直接发酵具有N‑酰基转移酶活性的、产生N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸的微生物来产生所述生物基N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸,其中所述N‑酰基转移酶选自恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)来源的N‑酰基转移酶(ppmat)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的N‑酰基转移酶(bsmat)和肠杆菌(Enterobacter sp.)638来源的N‑酰基转移酶(entmat)。
7.如权利要求6所述的方法,其包括在微生物发酵过程中将生物基L‑蛋氨酸供给至培养基。
8.如权利要求1‑7中任一项所述的方法,其中构成所述生物基N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸的碳中的50%至100%是源自生物资源的碳。
9.制造饲料添加剂或饲料组合物的方法,包括以下步骤:(1) 通过权利要求1‑8中任一项所述的方法制备生物基N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸或其盐;以及
(2)将步骤(1)的生物基N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸或其盐与动物饲料混合。
10.提高动物的产乳量、乳脂或乳蛋白、或体重增加效果的方法,包括以下步骤:根据权利要求9所述的方法制备饲料添加剂或饲料组合物;以及将所述饲料添加剂或饲料组合物饲喂给动物。
说明书 :
生物基N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸及其用途
技术领域
背景技术
酸、必需营养元素,已经进行了许多尝试来提高诸如收获率和肉质的特征。然而,由反刍动
物消化的大部分氨基酸中的60%至70%是通过反刍胃(更具体而言是瘤胃)中的微生物的
消化过程而自主消耗,而一些未消化的氨基酸仅在小肠中被消化或吸收。因此,虽然在反刍
动物的饲料中添加了氨基酸,但不能获得诸如养猪和养家禽的效果,因此,有必要开发瘤胃
保护型氨基酸,其绕过瘤胃,同时能够被反刍动物消化。
要性或改进的绕过瘤胃的新技术及其材料。
石油的材料,这相应地导致有限资源的消耗和环境问题(美国专利第7960575号)。
离的。然而,它具有的一些缺点在于从D/L‑蛋氨酸混合物中仅分离出L‑蛋氨酸需要高成本。
用乙酰辅酶A(乙酰‑CoA),但尚未证实N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸是否基本上制备为酶反应产物或
该基因转化体产生的产物。此外,由于该方法成本高以及低产率,该方法难以商业化。
发明内容
可行性。结果,本申请的发明人通过乙酰化生物基L‑蛋氨酸,以高产率产生了生物基L‑蛋氨
酸,并在经济上开发了其产生方法,且没有环境污染的担心。从而完成了本申请。
(b)乙酰化L‑蛋氨酸。
酸。
业中非常有效地使用。特别是,通过该方法产生的N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸作为饲料添加剂显示
出显著的效果,因为N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸能够绕过瘤胃。
前体产生L‑蛋氨酸;以及(b)乙酰化L‑蛋氨酸。
等,特别是指石油资源以外的环保资源。
方法。因此,该方法作为一种环保且经济的方法在工业上非常有效。
物菌株,并且还指能够在其中积累L‑蛋氨酸前体的菌株。能够产生L‑蛋氨酸前体的菌株可
以指产生O‑琥珀酰基‑L‑高丝氨酸或O‑琥珀酰基‑L‑高丝氨酸的菌株。
状杆菌(Corynebacteria sp.)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)、钩端螺菌(Leptospira
sp.)、沙门氏菌(Salmonellar sp.)、短杆菌(Brevibacteria sp.)、Hypomononas sp.、色杆
菌(Chromobacterium sp.)、诺卡氏菌(Norcardia sp.)、真菌或酵母;具体而言,菌株可以
是属于埃希氏菌、棒状杆菌、钩端螺旋体和酵母菌的微生物菌株;更具体地,它可以是属于
埃希氏菌的微生物菌株;最具体而言,菌株可以是大肠杆菌,但不限于此。
前体的菌株来进行发酵。
这种培养方法。培养方法的实例可以包括分批培养、连续培养和补料分批培养,但不限于
此。
体而言,生物碳源可以包括碳水化合物,例如糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、淀粉和
纤维素;脂肪,如大豆油、葵花油、蓖麻油、海狸油和椰子油;脂肪酸,如棕榈酸、硬脂酸和亚
油酸;醇,如甘油和乙醇;和有机酸,如乙酸,但不限于以上。这些碳源可以单独使用或组合
使用。氮源的实例可以包括:有机氮源,如蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆
(CSL)和豆粉;以及无机氮源,如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝
酸铵。这些氮源可以单独使用或组合使用。培养基可进一步包括作为磷源的磷酸二氢钾、磷
酸氢钾和相应的含钠盐。培养基可以包括金属,如硫酸镁或硫酸铁。另外,可以包括氨基酸、
维生素和适当的前体。培养基或前体可以按分批培养或连续培养的形式加入到培养物中。
泡剂可防止形成气泡。此外,为了保持培养基中的有氧条件,可以向培养物中加入氧气或含
有氧气的气体(例如空气)。通常,培养温度可以是20℃至45℃,特别是25℃至40℃。可以持
续培养直至L‑蛋氨酸前体的产生达到预期水平,并且培养时间可以是10小时至160小时,但
不限于此。
酸硫化氢解酶和O‑琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶,但不限于此。具体而言,酶转化是指在向
L‑蛋氨酸前体或含有其的发酵培养基中添加甲硫醇时与酶反应的过程,但不限于此。
蛋氨酸的菌株”是指在生物体中产生L‑蛋氨酸的原核或真核微生物菌株,并且因此是指能
够在菌株中积累L‑蛋氨酸的菌株。
菌、诺卡氏菌、真菌或酵母;具体而言,微生物菌株属于埃希氏菌、棒状杆菌、钩端螺旋体和
酵母;更具体地说,微生物菌株属于埃希氏菌;最具体而言,菌株可以是大肠杆菌,但不限于
此。另外,上述菌株可以包括韩国专利10‑1140906号中公开的菌株。
任何方法。
过渡金属基催化剂的乙酸。此外,对于应用非质子溶剂的中等反应条件,可以使用乙酰卤作
为乙酰化化合物。在本申请中,高温可以指70℃至100℃,具体地,80℃至90℃,但不限于此。
乙酰基‑L‑蛋氨酸的酰基转移酶。例如,乙酰化酶可以是L‑氨基酸N‑酰基转移酶MnaT
(YncA)、N‑乙酰谷氨酸合酶(ArgA)、推定的乙酰转移酶(YjdJ)、推定的乙酰转移酶(YfaP)、
推定的乙酰转移酶(YedL)或推定的乙酰转移酶(YjhQ),但不限于此。
转化体被培养后使用,或者在破坏转化的菌株时收集上清液使用。此外,在通过使用二甲苯
的预处理过程来增加菌株中细胞壁的渗透性之后,乙酰化可以通过供应L‑蛋氨酸诱导,而
不破坏转化的菌株。
野生型菌株;使用具有通过人工突变来提高乙酰化酶活性的特征的突变体;或使用由于过
表达能够诱导L‑蛋氨酸乙酰化的酶而改良的转化菌株。即,可以使用任何具有乙酰化酶活
性的、产生N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸的微生物而没有限制。此外,N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸的产生可能
通过乙酰化反应来实现,不仅使用微生物中生物合成的L‑蛋氨酸,而且使用在发酵期间从
外部来源提供的L‑蛋氨酸。
糖或乙酸来进行,以便可以将足够量的乙酰辅酶A供应给微生物。
L‑蛋氨酸。因此,本申请提出了与制备石油基N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸的常规方法完全不同的新
范例。
转化的菌株的直接发酵、或转化反应,可以显著提高N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸的产生能力。此外,
基于此,还可以显著提高表现出低的N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸产生能力的生物学产生方法的效
率。
源于O‑乙酰基‑L‑高丝氨酸或O‑琥珀酰基‑L‑高丝氨酸,O‑乙酰基‑L‑高丝氨酸指通过发酵
生物碳源获得的蛋氨酸前体。
(119.12g/mol)、甲基硫醇(48.11g/mol)和乙酸(59.04g/mol)组成。在缀合过程中,L‑高丝
氨酸中的羟基和甲硫醇中的氢分离,乙酸中的羟基和L‑高丝氨酸中的氢分离,以制备最终
的N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸。L‑高丝氨酸是使用生物资源通过发酵获得的,并且具有N‑乙酰基‑
L‑蛋氨酸中全部分子量的至少50%(L‑高丝氨酸119.12g/mol—H2O 18.01g/mol=
101.11g/mol,该数值表示N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸的分子量的至少50%)。此外,在使用乙酰化
酶的情况下,N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸中的生物衍生碳的含量将会增加,因为乙酸也来源于生物
来源(不含水的L‑高丝氨酸101.11g/mol+没有羟基的乙酸42.04g/mol=143.15g/mol,它具
有N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸的至少75%)。
生的。也就是说,在碳中存在三种同位素( C、C、C),但大部分 C(放射性碳)不存在于石
14 14
油材料碳源中。因此,基于 C仅存在于生物来源碳中的科学事实,进行 C的含量分析以确
定该物质是否是生物来源的。
如核苷酸、氨基酸、钙、磷酸盐、有机酸等,但不限于此。
饲料添加剂,并且本申请的饲料添加剂可对应于根据“家畜和鱼类饲料管理法”的补充饲
料。
维、药物副产品、油和脂肪、淀粉、葫芦(gourds)和谷物副产品;以及动物饲料如蛋白质、无
机材料、油脂、矿物质、单细胞蛋白质、动物浮游生物和食物残渣。这些可以单独使用或以两
种或更多种的组合使用。
别适用于具有瘤胃的反刍动物。家养牛可以是其代表性实例,但不限于此。
用作反刍动物的饲料添加剂,但不限于此。
饲料反刍,并第二次对其进行咀嚼的过程,并且能够进行这种反刍的胃被称为反刍胃。由于
微生物以共生的方式生活在瘤胃中,所以瘤胃具有降解动物通常不会消化的植物纤维素的
能力,并且这种降解的纤维素可以用作能量。
个反刍胃的室,因为瓣胃和皱胃没有完全分化。
用。整体考虑上述因素来施用能够以最小量达到最大效果的量而没有副作用是重要的,并
且此外,本领域普通技术人员可以容易地确定。
培养基和微生物两者来制备颗粒制剂。本领域普通技术人员可以进行适当选择来实施颗粒
形成过程,但不限于此。
占20%至30%;大于1000μm但小于或等于1300μm的粒径占60%至70%;以及大于1300μm的
粒度占5%,但不限于此。
添加选自稀释剂和游离N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸的至少一种并混合来形成混合浓缩物;将粒径
为200μm至500μm的颗粒种子注入造粒机中,通过从造粒机下部喷洒所述混合浓缩物来包覆
所述颗粒种子,并通过增加颗粒种子的尺寸来形成洋葱形颗粒,从而颗粒尺寸小于或等于
500μm的范围为0%至5%,大于500μm但小于或等于1000μm为20%至30%,大于1000μm但小
于或等于1300μm为60%至70%,并且大于1300μm为5%。
量);
浓缩物,同时施加热空气以形成流化床来进行造粒。
物,或微生物属于具有高脂肪含量的耶氏酵母,但不限于此。
基的干燥,并且增加所获得的产品的吸湿性,因此可以在减少微生物量的条件下培养微生
物。然而,在本申请中,N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸的含量可以通过混合过程进行调整,并且由于造
粒过程的特殊特征而使产品表面被压实。因此,发酵条件不一定限于上述条件。
所述饲料添加剂或饲料组合物如上所述。
0.1wt.%至10wt.%的范围将其混入。
实施例
基高丝氨酸的菌株,作为产生L‑蛋氨酸前体的菌株。将这些菌株接种在含有抗生素的LB平
板培养基上,然后在31℃下培养过夜。之后,将单菌落接种到含有抗生素的LB培养基(10mL)
中,在31℃下培养5小时,然后在含有L‑蛋氨酸前体的种子培养基(200mL)的锥形瓶(100mL)
中稀释100倍。另外,在31℃、200rpm的条件下培养3小时至10小时后,将种子培养液体培养
基接种于发酵罐(5L)中,使用批次补料发酵法培养50小时至100小时。产生L‑蛋氨酸前体的
主要发酵培养基的组成如下表1所示。
葡萄糖(g/L) 10.1 40 600
MgSO4·7H2O(g/L) 0.5 4.2
酵母提取物(g/L) 10 3.2
KH2PO4 3 3 8
硫酸铵(g/L) 6.3
NH4Cl(g/L) 1
NaCl(g/L) 0.5
Na2HPO4·12H2O(g/L) 5.07
DL‑蛋氨酸(g/L) 0.5 0.5
L‑异亮氨酸(g/L) 0.05 0.5 0.5
L‑苏氨酸(g/L) 0.5 0.5
泥被称为滞留物。
酶)(韩国专利第10‑1250651号)和甲硫醇,以包含具有O‑乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶活性
的酶的菌株或上述酶的形式。
硫酸将pH值调为4.0至5.5时浓缩晶体。为了获得更高纯度的L‑蛋氨酸,在该实施例中,加入
硫酸以将pH值调为4.0至5.5,然后进一步将占L‑蛋氨酸总量0.5wt.%至2wt.%的活性碳加
入,在50℃混合1小时至2小时。此后,进行过滤以去除活性炭和杂质。浓缩滤液直至L‑蛋氨
酸的浓度达到150g/L至200g/L,然后使用晶体分离装置获得晶体。然后将从晶体分离得到
的母液再浓缩一次,以获得第二晶体。此外,将第二晶体溶解,然后将溶解的晶体重新加入
pH值已被调节至4.0至5.5之间的L‑蛋氨酸反应液中。此外,上述过程重复使用。从而获得
95.0wt.%至99.9wt.%的L‑蛋氨酸。
液。在搅拌溶液30分钟后,当L‑蛋氨酸颗粒均匀分散时,加入浓硫酸(0.133g,98.5%)和蒸
馏水(0.666g),上述反应物部分转变成浆液状态,同时白色晶体从反应物中提取出来。此
时,在继续搅拌的同时,向其中缓慢注入能够将L‑蛋氨酸的胺基团乙酰化的化合物,如乙酸
酐(14.4g,0.141mol和97%),并将热量施加到配有冷凝管的烧瓶。当施加热量同时使用冷
却装置将冷凝管的温度保持在0℃以下时,蒸发的乙酸乙酰酯通过冷凝管回流到烧瓶中。此
时,反应物的温度保持在83℃。当反应进行20分钟时,处于浆液状态的反应物的颜色缓慢转
化成澄清黄色液体。此时,收集反应物并将其迅速冷却。
乙酰酯洗涤收集的N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸,然后使用真空过滤器再次纯化。此后,使用减压干
燥装置在‑0.1MPa、50℃将收集的N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸干燥1小时。观察到干燥时收集的N‑乙
酰基‑L‑蛋氨酸的质量为19.448g(纯化产率=77.8%),并且还观察到通过HPLC分析鉴定的
纯度为95.8%,并且剩余的L‑蛋氨酸的纯度为0.6%。
基含量。
来源的N‑酰基转移酶(bsmat)、肠杆菌(Enterobacter sp.)638来源的N‑酰基转移酶
(entmat)、假弧菌(Pseudovibrio sp.)FO‑BEG1来源的N‑酰基转移酶(pvmat)、解脂耶氏酵
母来源的N‑酰基转移酶(ylmat)、谷氨酸棒杆菌来源的N‑酰基转移酶(cgmat)和大肠杆菌来
源的N‑酰基转移酶(YncA)。N‑酰基转移酶的作用是将来自乙酰辅酶A的乙酰基传递至底物。
这样的酶反应可通过以下的酶来实施:如N‑乙酰谷氨酸合酶(ArgA)、推定的乙酰基转移酶
(YjdJ)、推定的乙酰基转移酶(YfaP)、推定的乙酰基转移酶(YedL)和推定的乙酰基转移酶
(YjhQ),并且进一步地,可用其中基于序列同源性高的具有酰基转移酶的其他能力的酶来
实施所述反应。
重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中后,将得到的细菌接种到含有卡那霉素的LB平板培养基
上,并在37℃培养过夜。将得到的菌落中的一个接种到含有卡那霉素的液体LB培养基(3mL)
中并培养过夜后,使用Plasmid Miniprep试剂盒(Bioneer,韩国)获得重组质粒。通过测序
(Macrogen,韩国)验证所获得的重组质粒的序列信息,并且每个重组质粒分别命名为:
pUCtk‑ppmat、pUCtk‑bsmat、pUCtk‑entmat、pUCtk‑pvmat、pUCtk‑ylmat、pUCtk‑cgmat和
pUCtk‑yncA。
(DE3)/pUCtk‑entmat、BL21(DE3)/pUCtk‑pvmat、BL21(DE3)/pUCtk‑ylmat、BL21(DE3)/
pUCtk‑cgmat和BL21(DE3)/pUCtk‑yncA。
cgmat和BL21(DE3)/pUCtk‑yncA的各菌落中的一个接种于含有卡那霉素(25mg/L)和1%葡
萄糖(w/v)的液体LB培养基(3mL),并在37℃下培养8小时(种子培养物)。之后,将每种种子
培养液接种在相同的培养基(50mL)上并培养过夜。
虑到酰基转移酶的大小接近19kDa,通过顺序过滤获得酶浓缩物;通过Amicon Ultra
(Millipore,Ireland)30‑kDa截留膜,然后通过10‑kDa截留膜重新过滤,并获得过滤器上的
剩余浓缩物。将浓缩物注入到填充有Q琼脂糖的HiTrap Q FF柱(GE,USA)中,并且使用NaCl
浓度梯度(80、100、150、200、300、500mM的顺序)纯化分离酰基转移酶。稀释的酶通过Amicon
Ultra 10‑kDa截留膜重新浓缩。使用SDS‑PAGE确认酰基转移酶的过表达和纯化程度。为了
测定通过纯化的酰基转移酶的N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸的产生能力,将酶浓缩物加入含有乙酰
辅酶A(20mM)和蛋氨酸(20mM)的磷酸盐缓冲液(pH7.0,50mM)。在37℃反应1小时后,使用
HPLC测定生成的N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸的量。
养基中未纯化的L‑蛋氨酸。另一方面,为了在产酰基转移酶细菌中提供足够量的乙酰辅酶
A,通过添加葡萄糖或乙酸,代谢工程方法是可能的,并且可以通过改进发酵过程来提高N‑
乙酰基‑L‑转移酶的产量。
产率产生L‑蛋氨酸,并且通过各种乙酰化方法使用简单、方便的方法制备N‑乙酰基‑L‑蛋氨
酸。上面的实施例是实施以上方法的代表方案。
pUCtk‑cgmat和BL21(DE3)/pUCtk‑yncA中的各菌落中的一个接种到含有卡那霉素(25mg/L)
和1%葡萄糖(w/v)的液体LB培养基(3mL)中,37℃培养8小时。之后,将培养基(500μL)接种
到含有卡那霉素(25mg/L)、1%葡萄糖(w/v)和2%蛋氨酸(w/v)的液体LB培养基(50mL)中,
然后培养过夜。将未插入目标基因的pUCtk载体进行转化以用作对照。通过离心除去培养基
中的细胞,然后使用HPLC分析产生的N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸。
到痕量的N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸,并假定对照中的N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸是由大肠杆菌中固有表
达的YncA酶产生的。此外观察到,当YncA在野生型大肠杆菌中过表达时,与对照相比,N‑乙
酰基‑L‑蛋氨酸的产生能力增加(表3)。
BL21(DE3)/pUCtk <0.1
BL21(DE3)/pUCtk‑ppmat 3.03
BL21(DE3)/pUCtk‑bsmat 1.60
BL21(DE3)/pUCtk‑entmat 2.23
BL21(DE3)/pUCtk‑pvmat 0.17
BL21(DE3)/pUCtk‑ylmat 0.13
BL21(DE3)/pUCtk‑cgmat 0.58
BL21(DE3)/pUCtk‑yncA 1.15
确认由转化的大肠杆菌产生的N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸的平均生物基含量为76.6%。
酸是可能的。
培养基上,并在31℃培养过夜。然后将形成的单菌落接种在种子培养基(10mL)中,并在31℃
下培养6小时。之后,将种子培养基(1mL)接种到含有主要发酵培养基(20mL)的锥形瓶
(250mL)中,在31℃、200rpm下培养78小时。种子培养基和主要发酵培养基的组成在下表4中
描述。
MgSO4·7H2O 0.49 1
酵母提取物 10 2
KH2PO4 3 2
硫酸铵 17
CaCl2·2H2O 0.015
CaCO3 30
NaCl 0.5
Na2HPO4·12H2O 6
MnSO4·7H2O 0.01
FeSO4·7H2O 0.01
ZnSO4·7H2O 0.01
L‑苏氨酸 0.3
行评价,并且通过使用在直接发酵获得的培养基中L‑蛋氨酸来进行实验。即,将乙酰辅酶A
(20mM)和L‑蛋氨酸的直接发酵培养基与磷酸缓冲液(pH7.0,50mM)混合,加入酶浓缩物。之
后,将混合的L‑蛋氨酸溶液在37℃下反应1小时,并使用HPLC测量由此产生的N‑乙酰基‑L‑
蛋氨酸的量,实验结果如下。
生N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸。
酸。分别导入由实施例3制备的重组质粒pUCtk‑ppmat、pUCtk‑bsmat、pUCtk‑entmat、pUCtk‑
pvmat、pUCtk‑ylmat、pUCtk‑cgmat和pUCtk‑yncA,从含有卡那霉素的LB平板培养基中选择
来自转化的大肠杆菌metA10YXLm的转化体。所选转化体分别命名为:metA10YXLm/pUCtk‑
ppmat、metA10YXLm/pUCtk‑bsmat、metA10YXLm/pUCtk‑entmat、metA10YXLm/pUCtk‑pvmat、
metA10YXLm/pUCtk‑ylmat、metA10YXLm/pUCtk‑cgmat和metA10YXLm/pUCtk‑yncA。基于实施
例5‑1中描述的发酵条件,进行转化菌株的培养和分析。作为分析的结果,metA10YXLm/
pUCtk‑ppmat以8.32g/L的最高浓度产生N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸,而metA10YXLm/pUCtk‑entmat
以6.19g/L的第二高浓度产生N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸(表6)。
析结果可以确认,转化体的N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸的产生增加,特别是确认了在不添加L‑蛋氨
酸时N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸的产生量最高的metA10YXLm/pUCtk‑ppmat菌株也显示N‑乙酰基‑
L‑蛋氨酸的最高产量(14.1g/L)(表6)。由此可见,当使用产生L‑蛋氨酸的能力得到进一步
改善的菌株来产生N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸时,可以预期其产量的增加,而同时通过额外提供来
自外部来源的L‑蛋氨酸来,也可以预期乙酰‑L‑蛋氨酸产量的增加。特别地,野生型大肠杆
菌具有固有的YncA酶,因此显示出痕量的N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸产量(实施例4)。然而,经证
实,产生L‑蛋氨酸能力增加的产生N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸的菌株,在对照中表现出N‑乙酰基‑
L‑蛋氨酸产量增加。据信,这种增加的产量是由于菌株中产生的L‑蛋氨酸或由于从外部来
源提供的L‑蛋氨酸造成的。
酵产生的N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸的平均生物基含量为99.3%。
650kg),并且通过将商业饲料(Milkgen ,CJ CheilJedang)和稻草一天两次饲喂(上午7:
30,凌晨3点)。
液的真空瓶运送至实验室,同时阻止氧气的渗透。将瘤胃液运送至实验室的时间少于1小
时。
体外过瘤胃试验。McDougall缓冲液的仿生溶液的组成如下表7所示。
验中使用的测试材料是N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸,将其作为实验组1。将实验组1与仅由基础膳食
组成而没有测试材料的对照组1进行比较,还与由测试材料L‑蛋氨酸组成的对照组2进行比
较。对每个实验组进行三个平行样品的培养。
与制备的厌氧培养基(50mL)混合,再将其密封置于40℃培养箱中开始进行培养。
子。此后,通过以4000rpm离心培养基10分钟获得上清液,然后测量存在于上清液中的测试
材料的量。
胃率相比,测试材料N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸在24小时后显示的过瘤胃率(%)为89.1%,在36小
时后为76.2%,甚至在48小时后为55.4%。
在的消化酶可以将其转化为蛋氨酸,因此可以容易地被反刍动物的小肠吸收。由于这个原
因,用牛小肠和肝脏中存在的酶观察N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸潜在的消化降解。
5mL)加入切过的小肠中。之后,在保持小肠的两端的同时,反复摇动小肠以帮助小肠中的大
部分酶被磷酸钠缓冲液溶解。通过这样做,从小肠(40m)获得约200mL的酶溶液,并且通过在
4℃以14,000rpm离心10分钟获得上清液,然后将所得物于20mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)中稀
释2倍。
TM
后,将玻璃珠(Sigma G1145)装入约1/10管(2mL)中。使用珠磨式组织研磨器(MP
FastPrep)将细胞组织破碎3次,每次20秒,并将所得物在4℃以14,000rpm离心10分钟以获
得上清液。
(7):800‑809)。通过与酰化酶I的相对活性的比较,观察小肠和肝脏提取物对N‑乙酰基‑L‑
蛋氨酸的消化降解率。实验条件与下表9所示的相同,反应在40℃下进行24小时。
和L‑蛋氨酸。通过比较反应前N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸和反应后L‑蛋氨酸之间的摩尔浓度(mM),
计算转化率(%),以百分比(%)表示(N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸分子量:191.25g/L,L‑蛋氨酸分
子量:149.25g/L)。
率)和使用肝脏提取物的反应(99.1%摩尔转化率)表现出非常高的消化降解速率。
L‑蛋氨酸被小肠中的消化酶转化为L‑蛋氨酸,并且可以预期痕量未降解的N‑乙酰基‑L‑蛋
氨酸在小肠中被吸收,通过血液流入肝脏并转化为L‑蛋氨酸。这表示作为饲料添加剂提供
的N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸可以直接用作L‑蛋氨酸,其实质上用作反刍动物体内的氨基酸。
转化为L‑蛋氨酸。即,在体内,在光学异构体之间,与N‑乙酰基‑D‑蛋氨酸(D‑型)相比,N‑乙
酰基‑L‑蛋氨酸(L‑型)的消化降解率显著高。此外,从上述结果可以预料,相比使用相同量
的N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸,当使用N‑乙酰基‑D,L‑蛋氨酸时,会表现出显著更低的消化降解率。
评估过程中分析了取决于N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸存在或不存在的乳组成的变化。为此,8头奶
牛分成两组,每组分别由4头奶牛组成。此外,将N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸加入饲料组合物中(表
12),所述饲料组合物饲喂给一组4头奶牛(每头奶牛每天30g的N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸),进行
了84天。
(12.2%)和乳蛋白增加(3.5%)。此外,与未添加N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸相比,校正能量的乳
(ECM)增加了6.7%。此外,饲料效率(ECM产量/DMI)也增加了8.3%。也就是说,从上述结果
可以看出,在添加N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸作为奶牛饲料添加剂时,观察到各种效果,例如乳中
脂肪和蛋白质含量的增加以及饲料效率提高。
在或不存在观察增重效果。在加入N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸的组中,每只肉用阉牛每天喂食N‑乙
酰基‑L‑蛋氨酸(30g)。
增加16.5kg的重量。另外,与没有添加N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸的情况相比,平均日增重也显示
约14.7%的提高效果。即,通过应用N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸的饲料添加剂(实施例9),不仅可以
观察到奶牛乳中脂肪和蛋白质含量的增加以及饲料效率提高等各种效果,而且从上面的结
果中也观察到了提高的肉用阉牛增重效果。基于这些结果,确认N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸作为各
种反刍动物的饲料添加剂的可能性。
(20g)、蛋白胨(10g)、酵母提取物(10g)、尿素(5g)、KH2PO4(4g)、K2HPO4(8g)、MgSO4·7H2O
(0.5g)、生物素(100μg)、硫胺素HCl(1,000μg)),在pH6.0至8.0范围内于35℃培养72小时。
因此,获得N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸浓度为1.07g/L的发酵培养基。
萄糖(20g)、Na2HPO4(3.28g)、NaH2PO4(3.22g)、酵母提取物(2g)、蛋白胨(50g)),在pH 6.0‑
8.0范围内于30℃培养72小时。因此,获得N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸浓度为1.02g/L的发酵培养
基。对于含有L‑蛋氨酸的培养基,它增加了N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸的产生,并且可以使用由微
生物发酵产生的L‑蛋氨酸的母液。
程之后,使用底部喷雾法通过造粒机的下部喷嘴(GR Engineering,流化床喷雾干燥机间歇
式引导器)将浓缩物注入到造粒机中。操作造粒机的条件如下:加热器温度(170℃)、入口温
度(140℃至160℃)、出口温度(60℃至70℃)和喷雾压力(1.8巴至2.0巴)。造粒用种子通过
喷雾干燥法制备,其大小为300μm。注入造粒机的浓缩物用热空气干燥,然后固化。此后,在
流入流化床的同时,新注入的浓缩物使其尺寸增大。当颗粒的尺寸达到所需尺寸时,停止造
粒机的操作,回收产物以分析产物的组成和其含量。
后,根据实施例12中的相同条件形成颗粒。
滤液浓缩至总固体含量为50.5wt.%,并且根据与实施例12中相同的条件形成颗粒。
出高消化率降解率,并且观察到由于实质上将N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸供给到奶牛所致的乳脂
和乳蛋白的提高效果。这些结果表明,基于本申请的制备方法所制备的N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸
可以非常有用地用作反刍动物的饲料添加剂。另外,通过将生物基N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸饲喂
反刍动物,可以获得与石油衍生材料相比的环保效应。
性实施方案仅用于举例说明目的,而不应被解释为限制本申请的范围。相反,本申请旨在不
仅覆盖示例性实施方案,而且覆盖可包括在由所附权利要求限定的本申请的实质和范围内
的各种替代方案、改型方案、等同物和其他实施方案。