一种FT mRNA分子在同属植物砧穗间传递的分子鉴定方法

摘要

本发明涉及一种FT mRNA分子在同属植物砧穗间传递的分子鉴定方法，本发明提供的方法可实现快速、灵敏、准确性高、简便、经济实惠地去鉴定同源性很高的基因在砧木和接穗间能否进行长距离传递，具有广阔的市场前景。该方法过程简单，要求不高，耗时短，工作量较小，工作周期较小，效率高，花费便宜，一方面可为科研者节约金钱，另一方面，缩短实验时间，提高工作效率，且具有应用的广泛性与普遍性，可以大范围在同属植物上应用，解决了一般实验室无法通过聚丙烯酰胺凝胶以及垂直电泳槽对同属植物砧木和接穗间同源性很高的基因进行RT‑PCR‑dCAPS鉴定的问题，省去了转基因所耗费的时间，而RT‑PCR‑CAPS对基因序列要求也高，一般基因难以满足。

权利要求

1.一种FT mRNA分子在同属植物砧穗间传递的分子鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）根据金坠梨中编码FT基因序列进行分析设计引物，分离和克隆鸭梨、杜梨中编码FT基因全长，利用生物信息学方法进行序列相似性分析，证实所得序列属于FT基因；

（2）分析鸭梨和杜梨的FT基因序列，寻找两者基因差异的位点，在此位点的上下游分别设计特异性引物，以构成酶切位点；

（3）鸭梨为接穗，杜梨为砧木进行试管苗微嫁接以及鸭梨自体微嫁接、杜梨自体微嫁接；

（4）分别提取鸭梨自体嫁接、杜梨自体嫁接以及嫁接后砧木和接穗的总RNA，反转录成cDNA，用特异性引物进行巢 式第一轮PCR扩增得到各自FT基因片段；

（5）回收巢 式第一轮PCR扩增产物FT的基因片段，以此为模板，再使用一对长引物进行巢 式第二轮PCR扩增，再次得到各自的FT基因片段；

（6）用限制性内切酶对巢 式第二轮PCR回收产物进行酶切，比较同源嫁接和异源嫁接后的酶切谱图，如果在嫁接体系中存在mRNA的双向传递，则在接穗鸭梨的扩增产物酶切后会出现砧木杜梨特异性的条带，同样在砧木杜梨的扩增产物酶切后也会出现接穗鸭梨特异性的条带；如果存在mRNA的单向传递，则在接穗鸭梨的扩增产物酶切后会出现砧木杜梨特异性的条带或者在砧木杜梨的扩增产物酶切后会出现接穗鸭梨特异性的条带；如果mRNA不发生传递，那么扩增产物的酶切电泳图中就会显示出各自相应样品的条带而无其他杂带；

其中，用于扩增杜梨和鸭梨FT同源基因全长的引物为：上游5’-ATGCCTCGGGACAGGGACC-3’下游5’-TTATCTTCTCCTCCCACCGGAG-3’；

用于扩增杜梨和鸭梨FT同源基因片段的巢式第一轮引物为：上游5’-GTTGTCCAGCAACCTAGAGTTGGTAC-3’下游5’-TTATCTTCTCCTCCCACCGGAG-3’；

用于扩增杜梨和鸭梨FT同源基因片段的巢式第二轮引物为：上游

5’-CAATGGTTGTGAGCTCAAACCTTCTCAAGTTGTCCAGCAACCTAGAG-3’和下游

5’-AATCCAAGGTTATAAAGCTCGGCGAAGTCTCTGGTATTGAAGTTTTGG-3’；

所述的限制性内切酶为KpnІ；

用于提取总RNA的样品选择微嫁接30d后砧木杜梨茎段韧皮部和嫁接口以及接穗鸭梨茎段韧皮部。

说明书

一种FT mRNA分子在同属植物砧穗间传递的分子鉴定方法

技术领域

[0001] 本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及的是FT基因mRNA分子在梨属植物砧木和接穗间长距离传递的分子鉴定方法。

背景技术

[0002] 在果树生产上广泛运用嫁接技术，砧木与接穗相互作用会提高根系对营养元素的吸收运输、提高接穗抗逆、改善果实品质、增加果实产量，使接穗提早开花、调控接穗矮化等，到目前为止，砧穗间相互作用关系研究主要集中在解剖学、营养运输、激素及生理学特性等方面，有关分子机制研究较少。已经发现砧穗间存在一些RNA及蛋白质信号分子可以通过植物韧皮部进行长距离传递，进而影响砧木或接穗的生理和发育进程。目前主要在拟南芥、南瓜、番茄、马铃薯等草本植物中鉴定到一些可以进行长距离传递的内源mRNA及蛋白质信号分子，并且对分子机制进行了一定的研究，而木本植物果树虽然鉴定到了几种可以进行长距离传递的内源mRNA分子，其中发现PbWoxT1mRNA能够在伴胞中与PbPTB3形成RNP复合体进行长距离移动，可对树形发育、树势平衡进行调控，另外，将可传递的AtGAI mRNA构建表达载体，利用转基因技术获得苹果转基因砧木，将接穗嫁接于转基因砧木上后，发现可使接穗矮化，因此可通过对果树砧穗间长距离传递mRNA分子进行鉴定和传递机理研究，利用转基因技术，培育具有特异功能砧木，通过嫁接定点改良砧木(或接穗)调控接穗(或砧木)重要农艺性状，提高经济效益，为果树育种及生产提供指导。

[0003] FLOWERING LOCUS T(FT)mRNA利用构建携带特异性标签的载体对拟南芥突变体进行转基因，将野生型接穗嫁接于转基因砧木上后RT-PCR检测，可在接穗中发现砧木转基因的特异性条带，并且发现使接穗提早开花，证明了FT mRNA可以在植物砧穗间进行长距离传递。目前对于鉴定木本植物基因的mRNA是否能够进行长距离传递的方法，只有通过构建携带特异性标签的载体进行转基因嫁接后RT-PCR检测以及酶切扩增多态性(Cleaved amplified polymorphic sequences,CAPS)技术。虽然这些技术检测基因的传递性比较准确，但是其中存在的缺点是过程繁琐，要求高，耗时长，工作量较大，工作周期长，效率低等，而在研究多年生木本植物mRNA在砧穗间传递的过程中，需克隆砧木和接穗的基因序列，通常同属植物砧穗间序列只存在几个碱基的差异，目前较为简便的方法是衍生酶切扩增多态性(derived cleaved amplified polymorphic sequence，dCAPS)技术，在引物中引入错配碱基构建限制性内切酶识别位点，即可通过酶切检测那些引起酶切位点发生改变的SNPs，达到区分砧穗间传递的不同基因序列的目的，但是这种方法仍然有其不足之处，因为同属植物砧穗基因差异产生的酶切产物大小只相差20bp左右，所以实施该方法需要采用聚丙烯酰胺凝胶以及昂贵的垂直电泳槽仪器，因此不利于一般实验室鉴定mRNA在植物砧穗间传递，这样就大大限制了所能鉴定可传递mRNA的数量，造成果树内源mRNA嫁接传递的研究进展缓慢，新的长距离传递的内源mRNA难以发现。

发明内容

[0004] 针对现有技术中存在的缺陷，本发明提供的方法解决了一般实验室无法通过聚丙烯酰胺凝胶以及垂直电泳槽对同属植物砧木和接穗间同源性很高的基因进行RT-PCR-dCAPS鉴定的问题，同时也解决了果树转基因技术较难，耗时长而不方便鉴定，RT-PCR-CAPS对基因序列要求高，一般基因也难以满足的问题。本发明利用不同品种间基因序列中存在的SNPs(单核苷酸多态性)，通过设计特异的引物，引入错配碱基构建限制性内切酶识别位点，使得不同品种砧穗间基因序列原本不存在天然有差异的酶切位点进而获得了酶切位点，之后设计特异的一对长引物再次对上一轮PCR扩增产物进行巢式PCR扩增，最后使用限制性内切酶酶切，通过常规的水平电泳槽将酶切产物用琼脂糖凝胶进行分离，即可比较同源嫁接和异源嫁接后的酶切谱图，鉴定mRNA在植物砧穗间是否传递，最终解决了同属植物砧木和接穗同源性很高的基因能否通过简单仪器与常规操作进行长距离传递鉴定的问题，具有快速、灵敏、准确性高、简便、经济实惠，能够应用于其他植物的特点。

[0005] 为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：

[0006] 本发明提供的杜梨和鸭梨FT的核苷酸序列和由该核苷酸编码的蛋白的氨基酸序列，如SEQ 1～4所示。

[0007] 一种FT mRNA分子在同属植物砧穗间传递的分子鉴定方法，包括以下步骤：

[0008] (1)根据https://www.ncbi.nlm.nih.gov/中公布的金坠梨(GenBank:KF240775.1)中编码FT基因序列进行分析设计引物，分离和克隆鸭梨(Pyrus 
bretschneideri)、杜梨(Pyrus betulaefolia Bunge)中编码FT基因全长，利用生物信息学方法进行序列相似性分析，证实所得序列属于FT基因；

[0009] (2)分析鸭梨和杜梨的FT基因序列，寻找两者基因差异的位点，在此位点的上下游分别设计特异性引物，以构成酶切位点；

[0010] (3)鸭梨为接穗，杜梨为砧木进行试管苗微嫁接以及鸭梨自体微嫁接、杜梨自体微嫁接；

[0011] (4)分别提取鸭梨自体嫁接、杜梨自体嫁接以及嫁接后砧木和接穗的总RNA，反转录成cDNA，用特异性引物第一轮PCR扩增得到各自FT基因片段；

[0012] (5)回收第一轮PCR扩增产物FT的基因片段，以此为模板，再使用一对长引物进行第二轮PCR扩增，再次得到各自的FT基因片段；

[0013] (6)用限制性内切酶对第二轮PCR回收产物进行酶切，比较同源嫁接和异源嫁接后的酶切谱图，如果在嫁接体系中存在mRNA的双向传递，则在接穗鸭梨的扩增产物酶切后会出现砧木杜梨特异性的条带，同样在砧木杜梨的扩增产物酶切后也会出现接穗鸭梨特异性的条带；如果存在mRNA的单向传递，则在接穗鸭梨的扩增产物酶切后会出现砧木杜梨特异性的条带或者在砧木杜梨的扩增产物酶切后会出现接穗鸭梨特异性的条带；如果mRNA不发生传递，那么扩增产物的酶切电泳图中就会显示出各自相应样品的条带而无其他杂带；

[0014] 所述用于扩增杜梨和鸭梨FT同源基因的全长引物为：

[0015] 上游5’-ATGCCTCGGGACAGGGACC-3’

[0016] 下游5’-TTATCTTCTCCTCCCACCGGAG-3’；

[0017] 所述用于扩增杜梨和鸭梨FT同源基因片段的巢式第一轮引物为：上游5’-GTTGTCCAGCAACCTAGAGTTGGTAC-3’

[0018] 下游5’-TTATCTTCTCCTCCCACCGGAG-3’；

[0019] 所述用于扩增杜梨和鸭梨FT同源基因片段的巢式第二轮引物为：上游

[0020] 5’-CAATGGTTGTGAGCTCAAACCTTCTCAAGTTGTCCAGCAACCTAGAG-3’

[0021] 和下游

[0022] 5’-AATCCAAGGTTATAAAGCTCGGCGAAGTCTCTGGTATTGAAGTTTTGG-3’；

[0023] 所述的限制性内切酶为KpnI。

[0024] 在上述方案的基础上，用于提取总RNA的样品选择微嫁接30d后砧木杜梨茎段韧皮部和嫁接口以及接穗鸭梨茎段韧皮部。

附图说明

[0025] 本发明有如下附图：

[0026] 图1所示为鸭梨和杜梨FT基因全长PCR扩增电泳图。图中：M：DNA分子量标准；1：鸭梨；2：杜梨。

[0027] 图2所示为FT氨基酸序列同源性比较图。图中：DL-FT为杜梨；YL-FT为鸭梨；JZ-FT为金坠梨。

[0028] 图3所示为FT基因序列同源性比较图。图中：DLFT为杜梨；YLFT为鸭梨。

[0029] 图4所示为鸭梨和杜梨FT基因片段第一轮PCR扩增电泳图。图中：M：DNA分子量标准；1：鸭梨；2：杜梨。

[0030] 图5所示为鸭梨和杜梨FT基因片段第二轮PCR扩增电泳图。图中：M：DNA分子量标准；1：鸭梨；2：杜梨。

[0031] 图6所示为鸭梨和杜梨FT基因第二轮PCR回收产物限制性内切酶酶切后琼脂糖凝胶电泳检测结果图。图中：M：DNA分子量标准；Y’：鸭梨第二轮PCR回收产物；D’：杜梨第二轮PCR回收产物；Y：鸭梨第二轮PCR回收产物酶切结果；D：杜梨第二轮PCR回收产物酶切结果；M’：鸭梨和杜梨等量混合物第二轮PCR回收产物酶切结果。

[0032] 图7所示为微嫁接后砧木和接穗第一二轮RT-PCR结果图。图中：1：杜梨茎段韧皮部；2：嫁接口；3：鸭梨茎段韧皮部；CK：对照组；Y：鸭梨嫁接鸭梨；D：杜梨嫁接杜梨；M’：鸭梨嫁接鸭梨和杜梨嫁接杜梨等量混合物。

[0033] 图8所示为该发明改进的dCAPS分子鉴定原理图。

[0034] 图9所示为微嫁接接穗与砧木FT基因第二轮PCR回收产物限制性内切酶酶切琼脂糖凝胶电泳检测结果图。图中：M：DNA分子量标准；1：杜梨茎段韧皮部；2：嫁接口；3：鸭梨茎段韧皮部；CK：对照组；Y：鸭梨嫁接鸭梨；D：杜梨嫁接杜梨；M’：鸭梨嫁接鸭梨和杜梨嫁接杜梨等量混合物。

具体实施方式

[0035] 以下结合附图1-9对本发明作进一步详细说明。

[0036] 实施例1试管微嫁接

[0037] 选取砧木杜梨(Pyrus  betulaefolia  Bunge)和接穗鸭梨(Pyrus bretschneideri)组培苗幼苗，恒定光源，光强1500lx，光照14h/10h昼夜循环，室温23～25℃，相对湿度85％，30～40d继代一次。鸭梨和杜梨使用培养基配方为MS+0.5mg·L–1 6-BA+
0.1mg·L–1IBA。

[0038] 在无菌条件下，将扩繁30d后的杜梨组培苗去头，留约1.5cm长茎段作为砧木，沿顶部纵切约0.5cm口子；取苗高1cm的鸭梨组培苗，顶端留2-3片叶，基部削成“V”型，插入砧木切口，用锡箔纸包裹固定，置入培养基MS+0.5mg·L–1 6-BA+0.1mg·L–1IBA中生长。取砧木杜梨组培苗茎段韧皮部和接穗鸭梨组培苗茎段韧皮部，经液氮处理后放入-80℃冰箱保存用于基因克隆。

[0039] 实施例2基因RNA提取

[0040] 植物材料总RNA的提取采用CTAB法(张玉刚等，2005)，从砧木杜梨茎段韧皮部和接穗鸭梨茎段韧皮部，以及嫁接后砧木韧皮部、嫁接口、嫁接后接穗韧皮部中提取总RNA，用30μL DEPC水溶解，电泳检测后置-80℃冰箱保存备用。

[0041] (1)去除RNA中DNA：

[0042] 加入成分及反应体系如下：

[0043]

[0044] (2)在37℃下处理30min；加入550μL无RNase水(0.1％DEPC处理)，再加入等体积600uL CI混匀；

[0045] (3)在4℃下，10000rpm离心10min，吸取上清，再加入等体积CI轻轻混匀；在4℃下，10000rpm离心10min；

[0046] (4)吸取上清，向管中加入2倍体积的无水乙醇，在-20℃下，沉淀1h；

[0047] (5)在4℃下，12000rpm离心20min；弃上清，再加入1mL 75％乙醇进行漂洗沉淀，12000rpm离心5min，漂洗2次后用枪头吸出多余的乙醇；

[0048] (6)放于超净工作台里进行吹干，溶于30-50μL DEPC水中，之后放入-80℃冰箱保存以备用；

[0049] (7)1％琼脂糖凝胶电泳检测提取核酸的完整性，用紫外分光光度计通过测260nm处的吸光度计算提取的RNA浓度。

[0050] 实施例3将RNA反转录为cDNA

[0051] 反转录体系及程序如下：

[0052] (1)在冰上向0.2mL RNase-free PCR管中加入以下成分：

[0053]

[0054] (2)混匀后瞬时离心，放入PCR仪中70℃10min，之后立刻置于冰上5min；

[0055] (3)在冰上继续向上一步骤中的PCR管中加入以下成分：

[0056]

[0057] (4)混匀后瞬时离心，放入PCR仪中42℃60min，70℃10min，等待反应结束以后，取出产物置于-20℃保存备用。

[0058] 所得到的cDNA作为下述PCR扩增的模板。

[0059] 实施例4鸭梨和杜梨FT基因全长克隆

[0060] 根据https://www.ncbi.nlm.nih.gov/中公布的金坠梨(GenBank:KF240775.1)中编码FT基因序列进行比对分析设计引物，分离和克隆鸭梨(Pyrus bretschneideri)、杜梨(Pyrus betulaefolia Bunge)中编码FT基因全长。

[0061] 扩增FT基因全长使用引物如下：

[0062] 上游引物：5‘-ATGCCTCGGGACAGGGACC-3’，

[0063] 下游引物：5’-TTATCTTCTCCTCCCACCGGAG-3’。

[0064] 上述引物均由中美泰和生物技术有限公司合成。

[0065] PCR反应体系：2×Es Taq MasterMix(Dye)购自(北京康为世纪生物科技有限公司，CW0682S)

[0066]

[0067] PCR反应程序如下：

[0068] 94℃预变性5min；

[0069] 94℃30s；

[0070] 60℃30s；

[0071] 72℃30s；

[0072] 34个循环。

[0073] 72℃最后延伸10min。

[0074] PCR产物检测：根据目标片段大小制作2％琼脂糖凝胶，0.1％TAE电泳缓冲液，70-110V电压电泳约20min，溴化乙啶染色，紫外灯下检测PCR产物大小，可得两条大小相同的条带。如图1所示。

[0075] 实施例5目的片段琼脂糖凝胶回收

[0076] 使用AXYGEN公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，方法参照其公司说明书：

[0077] (1)切取含有目的DNA片断的琼脂糖，尽量切除多余的凝胶；

[0078] (2)将凝胶块放入2mL离心管中，再加入3倍体积的凝胶熔化剂Buffer DE-A；

[0079] (3)放置于75℃水浴锅中水浴10min，期间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块完全溶解于红色的溶胶液中。等待10min之后，若还有未溶解的胶块，可以再补充一些溶胶液或再放置几分钟，直至完全溶解；

[0080] (4)吸取0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B加入到离心管中，若回收的DNA片段小于400bp时，还应再加入1个凝胶体积的异丙醇；

[0081] (5)将溶解好的黄色溶胶液，加到回收柱中，在室温下，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；

[0082] (6)重复(5)中的操作一次；

[0083] (7)加入500μL的漂洗液W1，在室温下，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；

[0084] (8)加入700μL的漂洗液W2(已加无水乙醇)，在室温下，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；

[0085] (9)将回收柱放回收集管内，在室温下，10000rpm离心1min，去除多余的漂洗液；

[0086] (10)取出回收柱，在超净台上吹干未挥发的乙醇，放入一个新的1.5mL离心管中，在回收柱膜中央加入35μL已预热至65℃的洗脱液，在室温下静置2min，让PCR产物完全溶解于洗脱液中，13000rpm离心1min以洗脱下来；

[0087] (11)取2-5μL回收产物，用浓度为1.0％的琼脂糖凝胶进行电泳检测回收效果，其余回收得到的PCR产物放入-20℃保存备用。

[0088] 实施例6制备大肠杆菌感受态

[0089] (1)从-70℃冰箱中取出菌种，未完全解冻前用已经灭菌的牙签轻轻点一下后在备好的90mm培养基上划线，37℃过夜培养16h左右，培养至可见单菌落时封口于4℃冰箱中保存备用；

[0090] (2)配制LB液体培养基300ml，分装于6个200ml的三角瓶(50ml/瓶)，高温高压灭菌20min，冷却至55℃左右，每个三角瓶中取LB液体培养基50μL都装于同一个已经灭菌的玻璃试管中。三角瓶中培养基封口于4℃冰箱备用；

[0091] (3)用已灭菌的枪头于90mm培养好的菌板上挑取单菌落，将枪头推入装有LB液体培养基的玻璃试管中，封口，于37℃恒温震荡床中228rpm过夜培养16h以上；

[0092] (4)从培养好的液体菌液中分别取50μL于备用的6个装有液体培养基的三角瓶中，以1：100比例接种，225rpm培养至OD600为0.6，大约为3h左右；

[0093] (5)将菌液分装到12个50mL无菌聚丙烯离心管中，冰上放置10min，然后4000rpm，4℃离心10min收菌；

[0094] (6)弃上清，倒置离心管1min以彻底去除上清。每管加入25ml预冷的0.1M CaCl2，轻轻混匀，冰上置30min；

[0095] (7)4000rpm，4℃离心10min；

[0096] (8)弃上清，倒置离心管1min以彻底去除上清。每管加入25ml预冷的0.1M CaCl2，轻轻混匀；

[0097] (9)此时感受态可以直接使用，若需长时间保存，可加入浓度为80％的甘油，并使甘油终浓度为20％，于-80℃保存。

[0098] 实施例7目的片段T-载体连接和转化

[0099] 取纯化的PCR产物加入pMD19-T载体及缓冲液(Takara公司，3271，Japan)(参照pMD19-T载体连接说明书)

[0100] 连接体系：

[0101]

[0102] 混匀，稍离心，16℃水浴12h以上。载体与基因片段的摩尔比1:4。

[0103] (1)取50μL大肠杆菌trans5α感受态细胞，置于冰上；

[0104] (2)等待完全溶解后加入10μL连接产物，将其轻轻混匀，放置于冰上30min；

[0105] (3)42℃金属浴上进行热激45s后，立刻放置于冰上2-3min；

[0106] (4)加入500μL的LB培养基，放入37℃摇床中200rpm振荡培养45min；

[0107] (5)室温下10000rpm离心1min，用枪头吸掉400μL的上清液，再用剩余培养基将细胞悬浮；

[0108] (6)将菌液均匀地涂布于含有氨苄抗生素的固体LB培养基上；

[0109] (7)将平板于37℃温箱中倒置培养过夜(16-18h)。用灭过菌的枪头挑取阳性克隆于20μL含有氨苄抗生素的LB液体培养基中，吸打混匀，放入37℃摇床中培养20min，吸取1μL菌液作为模板，进行PCR阳性克隆的鉴定。同时设置阳性对照(以PCR回收纯化后的产物为模板)和阴性对照(以蓝斑菌液为模板)以及单引物对照；琼脂糖凝胶电泳检测插入片段大小。选择阳性克隆菌液，由中美泰和生物技术有限公司进行测序。测序结果显示两条目的片段均为525bp，编码174个氨基酸。

[0110] 实施例8鸭梨和杜梨FT基因生物信息学分析

[0111] 将所得基因序列翻译为蛋白序列用DNAMAN(Lynnon BioSoft)进行多序列比对分析。多序列比对结果显示：鸭梨和杜梨FT基因氨基酸序列与金坠梨氨基酸序列完全一致，如图2所示，因此说明鸭梨和杜梨中克隆出来的基因序列属于FT基因，于是将其命名为YL-FT，对应的将杜梨FT基因命名为DL-FT。

[0112] 实施例9鸭梨和杜梨FT片段第一轮PCR扩增

[0113] YL-FT与DL-FT基因核苷酸序列相似性高达99.43％，只有三个碱基的差异，如图3所示，因此特异性引物很难设计，利用RT-PCR的方法鉴定不可行。而利用DNAMAN分析砧木与接穗核苷酸序列间酶切位点差异，选择砧木对接穗特异的酶切位点，这种常规的CAPS技术也不可行，于是发明人想到利用dCAPS技术，在引物中引入错配碱基构建限制性内切酶识别位点，可通过酶切检测那些引起酶切位点发生改变的SNPs，达到区分砧穗间传递的不同基因序列的目的。

[0114]

[0115] 引物均由中美泰和生物技术有限公司合成。

[0116] PCR反应体系：

[0117]

[0118] PCR反应条件：

[0119] 94℃预变性5min；

[0120] 94℃30s；

[0121] 59℃30s；

[0122] 72℃20s；

[0123] 30个循环。

[0124] 72℃最后延伸10min。

[0125] PCR产物检测：根据目标片段大小制作2％琼脂糖凝胶，0.1％TAE电泳缓冲液，70-110V电压电泳约20min，溴化乙啶染色，紫外灯下检测PCR产物大小，可得两条大小相同的条带。如图4所示。

[0126] 实施例10鸭梨和杜梨FT片段第二轮PCR扩增

[0127] 将第一轮PCR产物回收、纯化，方法同实施例5，若对第一轮PCR回收产物采用限制性内切酶KpnI即可将鸭梨与杜梨切成不同大小的片段，但是酶切产物大小只相差26bp，所以实施该方法需要采用聚丙烯酰胺凝胶以及昂贵的垂直电泳槽仪器，因此不利于一般实验室鉴定砧穗间传递的mRNA，并且分离酶切产物需要在低温条件下进行4h左右的聚丙烯酰胺凝胶电泳，对实验室与科研人员要求较高且最后跑出的电泳胶图里条带容易变形，不利于科研人员的成果展示。于是发明人想到设计特异的一对长引物再次对上一轮PCR扩增产物进行巢式第二轮PCR扩增，最后再使用限制性内切酶酶切，这样产生的酶切产物大小相差可达50bp左右，利用常规的水平电泳槽将酶切产物用琼脂糖凝胶进行分离，就可比较同源嫁接和异源嫁接后的酶切谱图，分析鉴定mRNA在植物砧穗间是否传递。

[0128]

[0129] 引物均由中美泰和生物技术有限公司合成。

[0130] PCR反应体系：

[0131]

[0132] PCR反应条件：

[0133] 94℃预变性5min；

[0134] 94℃30s；

[0135] 57℃30s；

[0136] 72℃20s；

[0137] 34个循环。

[0138] 72℃最后延伸10min。

[0139] PCR产物检测：根据目标片段大小制作2％琼脂糖凝胶，0.1％TAE电泳缓冲液，70-110V电压电泳约20min，溴化乙啶染色，紫外灯下检测PCR产物大小，可得两条大小相同的条带。如图5所示。

[0140] 实施例11PCR产物KpnI酶切

[0141] 将第二轮PCR产物回收、纯化，方法同实施例5，随后进行酶切，我们使用限制性内切酶KpnI(Thermo公司，FD0524)，即可将鸭梨和杜梨FT片段第二轮PCR回收产物切成不同大小的片段。酶切体系如下：

[0142]

[0143] 实施例12琼脂糖凝胶电泳

[0144] 根据目标片段大小制作2％琼脂糖凝胶，用TAE电泳缓冲液在70-110V电压电泳约30min，溴化乙啶染色，紫外灯下检测PCR产物片段大小。

[0145] 发现杜梨的PCR产物不能被酶切，因此产生351bp的条带作为杜梨特异性的条带，鸭梨的PCR产物可以被酶切成54bp、297bp两个条带，如图6所示，由于54bp条带被溴化乙啶染色较浅且容易跑出胶外，不易在胶图中观察到，所以琼脂糖凝胶电泳图中鸭梨PCR回收产物酶切成297bp的条带可作为鸭梨特异性的条带，最后结果与预期的酶切图谱一致。由此可见，所设计的两对引物及限制性内切酶KpnI可被用于鉴定鸭梨杜梨中FT基因mRNA的传递。

[0146] 实施例13微嫁接后FT mRNA在鸭梨和杜梨间传递的鉴定

[0147] 微嫁接后30d，分别从砧木杜梨茎段韧皮部、嫁接口及接穗鸭梨茎段韧皮部中取样，提取总RNA，反转录后按实施例9，10的方法进行PCR，如图7所示。以各自鸭梨和杜梨自身嫁接苗的茎段韧皮部cDNA为阴性对照，以鸭梨和杜梨自身嫁接苗的茎段韧皮部cDNA等量混合为阳性对照。按实施例11对第二轮PCR回收产物用限制性内切酶KpnI进行酶切，按实施例12进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，如图9所示。

[0148] 结果表明：在嫁接30天后，可以看到砧木杜梨茎段韧皮部没有新的酶切条带出现，而接穗鸭梨茎段韧皮部除了含有自身特异性酶切条带之外，同时还增加了砧木杜梨的特异性酶切条带而对照组中的鸭梨和杜梨自体嫁接苗并未发现有新的特异性酶切条带，说明FTmRNA可以从砧木杜梨单向传递到接穗鸭梨，而没有从接穗鸭梨传递到砧木杜梨。

[0149] 本发明的优点：

[0150] 本发明提供的方法可实现快速、灵敏、准确性高、简便、经济实惠地去鉴定同源性很高的基因在砧木和接穗间能否进行长距离传递，具有广阔的市场前景。该方法过程简单，要求不高，耗时短，工作量较小，工作周期较小，效率高，花费便宜，一方面可为科研者节约金钱，另一方面，缩短实验时间，提高工作效率，且具有应用的广泛性与普遍性，可以大范围在同属植物上应用，解决了一般实验室无法通过聚丙烯酰胺凝胶以及垂直电泳槽对同属植物砧木和接穗间同源性很高的基因进行RT-PCR-dCAPS鉴定的问题，省去了转基因所耗费的时间，而RT-PCR-CAPS对基因序列要求也高，一般基因难以满足。若可以大力推广该方法，这样不仅可以节约金钱与时间，还能够应用于其他植物，大大拓宽了可以鉴定砧穗间长距离传递mRNA的数量，也可推进多年生基因组高度杂合的木本植物信号传递方面的研究。

[0151] 序列说明

[0152] SEQ 1和2为杜梨FT的核苷酸序列和FT的氨基酸序列；SEQ 3和4为鸭梨FT的核苷酸序列和FT的氨基酸序列；SEQ 5和6为扩增FT全长的引物对；SEQ 7和8为第一轮扩增FT片段的引物对；SEQ 9和10为第二轮扩增FT片段的引物对。

[0153] 本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。