一种抗破伤风毒素的中和抗体及应用

摘要

本发明提供一种抗破伤风毒素的中和抗体及应用。本发明提供的抗破伤风毒素的中和抗体能够特异性结合破伤风毒素，因而具有极强的中和活性和很高的亲和活性，且用量低。本发明提供的抗破伤风毒素的中和抗体能够用于预防和治疗破伤风毒素感染以及破伤风梭菌介导的疾病或疾病状况的分离的抗体，同时还能够用于诊断和/或监测破伤风毒素感染以及破伤风梭菌感染的分离的抗体。此外，本发明提供的抗破伤风毒素的中和抗体无外源病毒污染，可广泛适用于各种人群。

权利要求

1.一种抗破伤风毒素的中和抗体，其特征在于，包括：包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的可变重链结构域以及包含VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的可变轻链结构域，其中，所述VH CDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO.1所示；

所述VH CDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO.2所示；

所述VH CDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO.3所示；

所述VL CDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO.4所示；

所述VL CDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO.5所示；

所述VL CDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO.6所示。

2.根据权利要求1所述的中和抗体，其特征在于，还包括SEQ ID NO.7所示的重链可变区和SEQ ID NO.8所示的轻链可变区。

3.根据权利要求1所述的中和抗体，其特征在于，所述中和抗体免疫特异性地结合破伤风毒素A片段和/或C片段和/或中和破伤风毒素，所述中和抗体具有至少10-6M的对所述破伤风毒素和/或所述破伤风梭菌的亲和力。

4.一种组合物，其特征在于，包括权利要求1-3中任一项所述的抗破伤风毒素的中和抗体。

5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-3中任一项所述的抗破伤风毒素的中和抗体。

6.一种表达载体，其特征在于，包括权利要求5所述的核酸分子。

7.一种重组细胞，其特征在于，包括权利要求5所述的核酸分子或权利要求6所述的表达载体。

8.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3中任一项所述的抗破伤风毒素的中和抗体，或权利要求4所述的组合物，或权利要求5所述的核酸分子，或权利要求6所述的表达载体，或权利要求7所述的重组细胞。

9.一种应用方法，其特征在于，包括：

权利要求1-3中任一项所述的抗破伤风毒素的中和抗体在制备由破伤风毒素感染以及破伤风梭菌感染的药物中的应用；和/或，权利要求1-3中任一项所述的抗破伤风毒素的中和抗体在制备检测破伤风毒素感染以及破伤风梭菌感染的试剂盒中的应用；和/或，权利要求4所述的组合物在制备治疗由破伤风毒素感染以及破伤风梭菌感染的药物中的应用；和/或，权利要求4所述的组合物在制备诊断破伤风毒素感染以及破伤风梭菌感染的试剂盒中的应用；和/或，权利要求5所述的核酸分子在制备治疗由破伤风毒素感染以及破伤风梭菌介导的疾病的药物中的应用；和/或，权利要求6所述的表达载体在制备治疗由破伤风毒素感染以及破伤风梭菌介导的疾病的药物中的应用；和/或，权利要求7所述的重组细胞在制备治疗由破伤风毒素感染以及破伤风梭菌介导的疾病的药物中的应用。

说明书

一种抗破伤风毒素的中和抗体及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种抗破伤风毒素的中和抗体及应用。

背景技术

[0002] 破伤风毒素为破伤风梭菌(Clostridium tetani)在厌氧条件下产生的一种抑制神经递质释放的分泌蛋白。破伤风毒素能够引起超反射反应和横纹肌痉挛，在肌紧张性收缩(肌强直、发硬)的基础上，阵发性强烈痉挛，重症患者可致死，且病死率可高达50％。

[0003] 对于破伤风毒素的预防和治疗，通常采用马血清TAT(Tatanus Antitoxin，破伤风抗毒素)进行治疗。但由于人体体质的不同以及对马血清TAT的接受程度不同，不少人会出现过敏反应、过敏休克或血清病等不良反应。因此，马血清TAT并不适用于所有人。随着生物医疗的发展进步，HTIG(Human Tetanus Immunoglobulin，人破伤风免疫球蛋白)逐渐进入市场。HTIG能够克服马血清TAT临床使用时的不良反应，大大提升了破伤风的防治水平。但由于人血源来源因难、价格昂贵，存在外源病毒污染的危险，因此，HTIG的工业化生产和临床应用受到了很大限制。

[0004] 近年来，由于基因工程技术的发展，使得通过基因工程的方法制备人源化/人源性抗体成为可能。利用基因工程制备的人源化/人源性抗体可降低或消除异种血清蛋白引起的过敏反应，又可克服人源免疫球蛋白生产的血源不足及潜在病毒污染的可能等问题，成为目前研究的主要方向。

发明内容

[0005] 本发明提供一种抗破伤风毒素的中和抗体及应用，以解决现有HTIG价格昂贵、存在外源病毒污染的问题。

[0006] 第一方面，本发明提供一种抗破伤风毒素的中和抗体，包括：

[0007] 包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的可变重链结构域以及包含VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的可变轻链结构域，其中，

[0008] 所述VH CDR1包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

[0009] 所述VH CDR2包括SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

[0010] 所述VH CDR3包括SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；

[0011] 所述VL CDR1包括SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；

[0012] 所述VL CDR2包括SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；

[0013] 所述VL CDR3包括SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列

[0014] 优选地，还包括SEQ ID NO.7所示的重链可变区和SEQ ID NO.8所示的轻链可变区。

[0015] 优选地，所述中和抗体包括：

[0016] 具有与所述SEQ ID NO.1所示序列至少80％序列相同性的氨基酸序列的VH CDR1，和/或具有与所述SEQ ID NO.4所示序列至少80％序列相同性的氨基酸序列的VL CDR1；和/或，

[0017] 具有与所述SEQ ID NO.2所示序列至少80％序列相同性的氨基酸序列的VH CDR2，和/或具有与所述SEQ ID NO.5所示序列至少80％序列相同性的氨基酸序列的VL CDR2；和/或，

[0018] 具有与所述SEQ ID NO.3所示序列至少80％序列相同性的氨基酸序列的VH CDR3，和/或具有与所述SEQ ID NO.6所示序列至少80％序列相同性的氨基酸序列的VL CDR3。

[0019] 优选地，所述中和抗体免疫特异性地结合破伤风毒素，所述中和抗体具有至少10-6、10-7、10-8、10-9或10-10M的对所述破伤风毒素和/或所述破伤风梭菌的亲和力。

[0020] 第二方面，本发明提供一种组合物，包括第一方面的抗破伤风毒素的中和抗体。

[0021] 第三方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面的抗破伤风毒素的中和抗体。

[0022] 第四方面，本发明提供一种表达载体，包括第三方面的核酸分子。

[0023] 第五方面，本发明提供一种重组细胞，包括第三方面的核酸分子或第四方面的表达载体。

[0024] 第六方面，本发明提供一种试剂盒，包括第一方面的抗破伤风毒素的中和抗体，或第二方面的组合物，或第三方面的核酸分子，或第四方面的表达载体，或第五方面的重组细胞。

[0025] 第七方面，本发明提供一种应用方法，包括：

[0026] 第一方面的抗破伤风毒素的中和抗体在制备由破伤风毒素感染以及破伤风梭菌感染的药物中的应用；和/或，

[0027] 第一方面的抗破伤风毒素的中和抗体在制备检测破伤风毒素感染以及破伤风梭菌感染的试剂盒中的应用；和/或，

[0028] 第二方面的组合物在制备治疗由破伤风毒素感染以及破伤风梭菌感染的药物中的应用；和/或，

[0029] 第二方面的组合物在制备诊断破伤风毒素感染以及破伤风梭菌感染的试剂盒中的应用；

[0030] 第三方面的核酸分子在制备治疗由破伤风毒素感染以及破伤风梭菌介导的疾病的药物中的应用；

[0031] 第四方面的表达载体在制备治疗由破伤风毒素感染以及破伤风梭菌介导的疾病的药物中的应用；

[0032] 第五方面的重组细胞在制备治疗由破伤风毒素感染以及破伤风梭菌介导的疾病的药物中的应用。

[0033] 本发明的实施例提供的技术方案可以包括以下有益效果：

[0034] 本发明提供一种抗破伤风毒素的中和抗体及应用。本发明提供的抗破伤风毒素的中和抗体能够特异性结合破伤风毒素，因而具有极强的中和活性和很高的亲和活性，且用量低。本发明提供的抗破伤风毒素的中和抗体能够用于预防和治疗破伤风毒素感染以及破伤风梭菌介导的疾病或疾病状况的分离的抗体，同时还能够用于诊断和/或监测破伤风毒素感染以及破伤风梭菌感染的分离的抗体。此外，本发明提供的抗破伤风毒素的中和抗体无外源病毒污染，可广泛适用于各种人群。

[0035] 应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本发明。

附图说明

[0036] 为了更清楚地说明本申请的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0037] 图1为本发明实施例提供的通过SDS-PAGE(英文名称：Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，中文名称：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳)法检测得到的中和抗体的表达检测结果图；

[0038] 图2为本发明实施例提供的通过Western Blot(中文名称：蛋白质印迹法)法检测得到的中和抗体的表达检测结果图；

[0039] 图3为本发明实施例提供的中和抗体的抗原结合活性检测图；

[0040] 图4为本发明实施例提供的中和抗体与破伤风毒素的亲和活性检测图；

[0041] 图5为本发明实施例提供的中和抗体对20倍剂量的破伤风毒素LD50的保护作用图；

[0042] 图6为本发明实施例提供的中和抗体对60倍剂量的破伤风毒素LD50的保护作用图。

具体实施方式

[0043] 术语中，抗体是指起到特异性识别抗原的受体作用的蛋白分子，包括与特定抗原免疫反应的免疫球蛋白分子，包括整个抗体、二聚、三聚和多聚抗体；双特异性抗体；嵌合抗体；重组和工程抗体，和其片段，只要该抗体包括抗原结合区即可。免疫球蛋白分子具有重链和轻链，各重链和轻链包含恒定区和可变区，其中，各重链和轻链的可变区分别称为可变重链(variable heavy chain，VH)和可变轻链(variable light chain，VL)。重链和轻链的可变区包含四个框架区，被三个超变区打断，也称为互补决定区(complementarity determining region，CDR)，其中，CDR的主要作用为结合到抗原的表位。

[0044] 本领域技术人员还将理解的是，本发明涵盖所述破伤风毒素抗体的氨基酸序列修饰。举例而言，可需要改良抗体之结合亲和力及/或其它生物学特性。抗破伤风毒素抗体之氨基酸序列变体是由向抗破伤风毒素抗体核酸中引入适当核苷酸变化或由肽合成制备。该等修饰包括(例如)抗破伤风毒素抗体氨基酸序列内之残基缺失及/或插入及/或取代。进行缺失、插入及取代之任何组合以达成最终构建体，其限制条件为该最终构建体具有所要特征。氨基酸变化亦可改变抗破伤风毒素抗体之转译后过程，诸如改变糖基化位点之数目或位置。

[0045] 本发明实施例提供一种抗破伤风毒素的中和抗体，在本发明实施例中，该中和抗体称为抗体TRN1015。本发明实施例提供的抗体TRN1015包括：包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的可变重链结构域以及包含VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的可变轻链结构域，其中，[0046] VH CDR1包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸残基序列；

[0047] VH CDR2包括SEQ ID NO.2所示的氨基酸残基序列；

[0048] VH CDR3包括SEQ ID NO.3所示的氨基酸残基序列；

[0049] VL CDR1包括SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；

[0050] VL CDR2包括SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；

[0051] VL CDR3包括SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。

[0052] 在本发明实施例提供的抗体TRN1015中，SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6的序列分别为：

[0053] SEQ ID NO.1：Gly Phe Gly Ile Gly Ile Tyr Thr；

[0054] SEQ ID NO.2：Ile Ser Gly Thr Ser Gln Tyr Ile；

[0055] SEQ ID NO.3：Val Ser Gly Ser Ser Leu Asp Tyr；

[0056] SEQ ID NO.4：Gln Asn Ile Gly Thr Asn；

[0057] SEQ ID NO.5：Gly Ala Ser；

[0058] SEQ ID NO.6：Tyr Gln Asn Tyr Asn Ser Pro Lys Thr。

[0059] 进一步，本发明实施例提供的抗体TRN1015还包括SEQ ID NO.7所示的重链可变区和SEQ ID NO.8所示的轻链可变区，其中，SEQ ID NO.7的序列为：Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Arg Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Val Ser Gly Phe Gly Ile Gly Ile Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Thr Ser Gln Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asn Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Val Ser Gly Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser；SEQ ID NO.8的序列为：Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Gly Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Thr Asn Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ala Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Thr Phe Thr Leu Thr Ile Asp Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Tyr Gln Asn Tyr Asn Ser Pro Lys Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Leu Lys。

[0060] 在本发明实施例提供的抗体TRN1015中，抗体TRN1015能够免疫特异性地结合破伤风毒素，抗体具有至少10-6、10-7、10-8、10-9或10-10M的对破伤风毒素。

[0061] 更进一步，本发明实施例提供的抗体TRN1015同时还包括与抗体的氨基酸序列或者编码该抗体的任何核苷酸序列具有一定程度的序列一致性或序列同源性的序列。具体地，本发明实施例提供的抗体TRN1015同时还包括具有与SEQ ID NO.1所示序列至少80％序列相同性的氨基酸序列的VH CDR1，和/或具有与SEQ ID NO.4所示序列至少80％序列相同性的氨基酸序列的VL CDR1；和/或，具有与SEQ ID NO.2所示序列至少80％序列相同性的氨基酸序列的VH CDR2，和/或具有与SEQ ID NO.5所示序列至少80％序列相同性的氨基酸序列的VL CDR2；和/或，具有与SEQ ID NO.3所示序列至少80％序列相同性的氨基酸序列的VH CDR3，和/或具有与SEQ ID NO.6所示序列至少80％序列相同性的氨基酸序列的VL CDR3。

[0062] 如：具有SEQ ID NO.1至少或至少约80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列的VH CDR1；

[0063] 具有SEQ ID NO.2至少或至少约80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列的VH CDR2；

[0064] 具有SEQ IDNO.3至少或至少约80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列的VH CDR3；

[0065] 具有SEQ ID NO.5至少或至少约80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列的VL CDR1；

[0066] 具有SEQ ID NO.6至少或至少约80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列的VL CDR2；

[0067] 以及具有SEQ ID NO.7至少或至少约80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列的VL CDR3。

[0068] 本发明实施例提供的抗体TRN1015优选为全人源化抗体，包括单链Fv(single chain antibody fragment，scFv)、Fab、Fab′、F(ab’)2、Fv、dsFv、双抗体(diabody)、Fd或Fd’片段。但，本发明实施例提供的抗体TRN1015并不局限于上述全人源化抗体。进一步，本发明实施例提供的抗体TRN1015还包括含肽接头。较为优选地，肽接头包含约1-50个氨基酸。

[0069] 本发明实施例提供的抗体TRN1015还包括缀合物，该缀合物包含缀合至抗体TRN1015的标签，如可缀合至聚乙二醇(PEG)。进一步，本发明实施例提供的抗体TRN1015还包括治疗剂或诊断剂，如，诊断剂包括但不限于酶、荧光化合物、电子转移剂和放射性标记。

[0070] 本发明实施例还提供一种组合物，该组合物包括抗体TRN1015。本发明实施例提供的组合物可以为诊断组合物，也可以为药物组合物。但不论为诊断组合物还是药物组合物均包括抗体TRN1015。

[0071] 当本发明实施例的组合物为诊断组合物时，该诊断组合物还包括容纳抗体TRN1015的容器。进一步，该诊断组合物还包括缀合物，其中，缀合物包含缀合至抗体TRN1015的标签，如可检测的部分/试剂。标签通过共价键或非共价键直接缀合至抗体TRN1015上。另外，标签可利用一种或多种连接化合物缀合至抗体TRN1015，其中，用于将标签缀合至抗体TRN1015的技术对本领域的技术人员是公知的。作为标签的可检测的部分/试剂优选为选自由酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、正电子发射材料和非放射性的顺磁金属离子组成的组中的一种。

[0072] 当本发明实施例的组合物为药物组合物时，该药物组合物还包括药学上可接受的载体，其中，药学上可接受的载体是指不会对生物体引起显著刺激且不会消除所施用化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂，如，生理盐水，无菌水，林格氏溶液，缓冲盐溶液，葡萄糖溶液，麦芽糊精溶液，甘油，乙醇，和其中两种或更多种的混合物。如果需要，本发明实施例提供的药物组合物还可以包括其它常规添加剂，如抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂，并配置成可注射制剂，如水性溶液，悬浮液和乳剂，丸剂，胶囊剂，颗粒剂和片剂。

[0073] 本发明实施例还提供一种核酸分子，该核酸分子能够编码本发明实施例提供的抗体TRN1015。

[0074] 本发明实施例还提供一种表达载体，该表达载体包括上述核酸分子。本发明实施例提供的表达载体还包括与核酸分子序列操作性相连的表达调控序列。其中，所述表达载体包括在原核细胞中进行基因表达的载体、在真核细胞中进行基因表达的载体，以及其他细胞中进行基因表达的载体，如哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、导入噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或反转录病毒载体的多核苷酸。

[0075] 本发明实施例还提供一种重组细胞，该重组细胞包括上述核酸分子或表达载体。重组细胞可以是原核细胞、真核细胞，如包括大肠杆菌、链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞，酵母细胞，真菌细胞，动物细胞以及植物细胞等，在本领域中，可使用本领域的技术人员已知的可用作哺乳动物宿主细胞的任何细胞。

[0076] 本发明实施例还提供一种试剂盒，该试剂盒包括上述抗体TRN1015，或组合物，或核酸分子，或表达载体或重组细胞。本发明实施例提供的试剂盒能够用于检测破伤风毒素感染以及破伤风梭菌感染。具体地，本发明实施例提供的试剂盒通过抗体TRN1015能够测定流体、细胞或组织样品中的破伤风毒素水平。同时，本发明实施例提供的试剂盒还能够将所测定破伤风毒素水平与对照水平比较，其中与破伤风毒素的对照水平相比，所测定的破伤风毒素水平的提高代表破伤风毒素感染。优选的，所述细胞或组织样品获得自人类对象，所述细胞或组织样品包括为血液、尿、唾液、肺痰、灌洗或淋巴样品。

[0077] 本发明实施例还提供一种应用方法，该应用方法包括：

[0078] 抗体TRN1015在制备由破伤风毒素感染以及破伤风梭菌感染的药物中的应用；和/或，

[0079] 抗体TRN1015在制备检测破伤风毒素感染以及破伤风梭菌感染的试剂盒中的应用；和/或，

[0080] 组合物在制备治疗由破伤风毒素感染以及破伤风梭菌感染的药物中的应用；和/或，

[0081] 组合物在制备诊断破伤风毒素感染以及破伤风梭菌感染的试剂盒中的应用；和/或，

[0082] 核酸分子在制备治疗由破伤风毒素感染以及破伤风梭菌介导的疾病的药物中的应用；和/或，

[0083] 表达载体在制备治疗由破伤风毒素感染以及破伤风梭菌介导的疾病的药物中的应用；和/或，

[0084] 重组细胞在制备治疗由破伤风毒素感染以及破伤风梭菌介导的疾病的药物中的应用。

[0085] 本发明提供的抗破伤风毒素的中和抗体(抗体TRN1015)能够特异性结合破伤风毒素，因而具有极强的中和活性和很高的亲和活性，且用量低。本发明提供的抗破伤风毒素的中和抗体能够用于预防和治疗破伤风毒素感染以及破伤风梭菌介导的疾病或疾病状况的分离的抗体，同时还能够用于诊断和/或监测破伤风毒素感染以及破伤风梭菌感染的分离的抗体。此外，本发明提供的抗破伤风毒素的中和抗体无外源病毒污染，可广泛适用于各种人群。

[0086] 下面结合附图和实施例对本发明实施例提供的抗体TRN1015的提取、纯化以及中和性能、亲和动力学性能和体内保护作进一步详细的说明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0087] 实施例1流式细胞仪分选B细胞以及抗破伤风毒素抗体的筛选与纯化

[0088] 1、PBMC分离和浆细胞分选

[0089] 从注射了破伤风疫苗并产生了保护性抗体的志愿者身上采集15ml静脉血，并置于含有肝素的抗凝管中。将15ml血样用Ficoll(聚蔗糖)分离出PBMC(peripheral blood mononuclear cell，外周血单个核细胞)。PBMC计数后利用BD FACSria流式细胞仪从PBMC进行单个B细胞分选，将形态完好的B细胞置于96孔PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)板中，使每个孔含有一个B细胞。将置有B细胞的96孔PCR板置于温度为-80℃冰箱中，保存备用。

[0090] 2、分离抗体可变区基因

[0091] 将含有单个B细胞的96孔PCR板中加入0.5μM的各亚型重链与轻链的恒定区引物以及Superscript III反转录酶，在温度为37℃条件下孵育1h。孵育结束后，按照95℃15min；95℃1min，55℃1min，72℃1min，30cycles；72℃10min；4℃5min条件进行PCR扩增，得到扩增产物cDNA。扩增产物cDNA置于温度为-20℃的条件下保存。

[0092] PCR分离抗体基因：50uL体系中含有5μl的RT(reverse transcription，反转录)反应产物，HotStarTaq Plus酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)，dNTPs，及0.5uM的各亚型重链与轻链抗体的特异性引物，反应条件：预变性94℃5min，然后进行35个PCR循环，每个循环为：94℃×30s，55℃×30s，72℃×50s，最后用72℃延伸7min，得到PCR扩增产物。

[0093] 3、构建重组抗体的表达载体

[0094] 取2μl PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。将凝胶电泳鉴定为阳性，且重链与轻链可匹配成对的抗体可变区基因PCR产物利用TA克隆的方法连接到pcDNA3.3载体上，将连接产物转化DH5α感受态细菌中，在含有氨苄青霉素的平板上37℃培养过夜，随即挑取10个单菌落用特异性引物进行PCR，反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火
30s，72℃延伸1min40s，28个循环，最后72℃再延伸5min；取5μl PCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，在阳性转化子中鉴定出了含有抗体重链或轻链基因的转化子。

[0095] 4、抗体表达

[0096] 将表达阳性抗体重链和轻链基因的质粒在大肠杆菌DH5α中大量扩增，进行重组质粒快速提取。用转染试剂PolyFect共转染293细胞，具体操作参见说明书。转染后6-8h换新鲜培养基，并在37℃8％CO2培养箱中培养96h，收集细胞上清进行检测。

[0097] 5、表达抗体的筛选检测

[0098] 以破伤风疫苗为抗原，并用包被液将抗原10倍稀释后包被96孔ELISA板，每孔100uL 4℃过夜包被，用封闭液常温封闭2个h。将100uL的瞬时转染上清作为一抗37℃孵育
2h，用HRP/anti-His-tag(1:2000稀释)作为二抗37℃孵育1h，加入底物显色液100μl/孔，常温避光放置5min后，用2M硫酸中止反应，用450nm波长进行检测分析。

[0099] 6、抗体大量表达与纯化

[0100] 将中和实验鉴定的有中和活性的抗体重链与轻链的表达载体共转染293细胞，转染后6-8h换新鲜培养基，并在37℃8％CO2培养箱中培养96h。收集转染上清，4000rpm离心1h，利用蛋白(Protein)A亲和层析法进行纯化。利用SDS-PAGE和Western Blot检验抗体的表达及纯化情况。

[0101] 7、结果

[0102] 结果如图1、2所示，通过SDS-PAGE法和Western Blot法均证实得到较纯的目的抗体，可清晰观察到解链后的抗体轻链和重链。

[0103] 实施例2ELISA检测抗体TRN1015的中和活性

[0104] 1、实验过程

[0105] 以破伤风标准毒素为抗原，并用包被液将抗原10倍稀释后包被96孔ELISA板，每孔中含有体积为100μ、温度为4℃的过夜包被，用封闭液常温封闭2h。将表达纯化的抗体TRN1015进行系列稀释后作为一抗37℃孵育2h，用HRP/anti-His-tag(1:2000稀释)作为二抗37℃孵育1h，加入底物显色液后常温避光放置5min，用2M硫酸中止反应，用450nm波长进行检测分析。

[0106] 2、结果

[0107] 结果如图3所示，表达纯化的抗体进行10000稀释后(抗体浓度约为：0.0002μg/ml)，抗体TRN1015仍然能够中和破伤风标准毒素，因此，本发明实施例提供的抗体TRN1015具有极强的中和活性。

[0108] 实施例3抗体TRN1015的亲和活性动力学分析

[0109] 1、捕获法试验

[0110] 抗体亲和力测试采用捕获法，缓冲液为HBS-EP，CM5芯片先用proteinA进行偶联。然后稀释捕获抗体使其浓度为1ug/ml，结合时间为50s。将分析物破伤风素素以逐渐增高的浓度依次流过芯片，分别得到信号曲线。每个浓度作为1个循环，完成1次循环后用3M MgCl2再生芯片以回复到原始未捕获抗体的状态，再生时间为30s。用BiaCore X-100System软件对得到的信号曲线进行分析，得到本发明实施例提供的中和抗体与破伤风毒素的亲和活性检测图。

[0111] 4、结果

[0112] 结果如图4和表1所示，中和抗体TRN1015对破伤风毒素的亲和力达10-9mol的数量级，表明本发明实施例提供的抗体TRN1015具有很高的亲和活性；而且，该抗体与之间的的结合的速率(ka)为3.88E+04Ms-1，其解离的速率(kd)达9.40E-05s-1，表明该抗体结合/复合物具有良好的稳定性；并且，该抗体浓度为4ug/mL时进行了两次重复循环，其分析结果非常接近，重复表明了实验条件和仪器状态的稳定性，证明了检测结果的可靠性。

[0113] 表1：抗体TRN1015与破伤风毒素的亲和活性检测结果

[0114]

[0115] 实施例4抗体TRN1015的体内保护实验

[0116] 1、半数致死量的测定(LD50)

[0117] 将配制好的破伤风毒素用稀释液依次稀释102，103，104，105，106，107，每个稀释度至少稀释2ml，取0.2ml注射小鼠，每组4只。观察5天。根据实验结果计算出LD50，实验组分别使用20倍和60倍于LD50的剂量。

[0118] 2、TRN1015对小白鼠的保护检测

[0119] 将实验分为3组，每组4只小鼠，每只小鼠注射0.4ml，其中，阴性对照组包括0.2ml毒素+0.2ml硼酸盐缓冲盐水；阳性对照组包括0.2ml毒素+0.2ml抗毒素；实验组包括0.2ml毒素+0.2ml单抗。

[0120] 混合定量吸取已稀释之标准抗毒素及不同稀释度之待检单抗分别装入小试管中，每管加入等量之稀释试验毒素，混合均匀，加塞，37℃孵育1h，立即对小白鼠进行腹部皮下注射。混合时，吸取标准抗毒素、待检单抗及毒素的吸管不得混用。

[0121] 3、结果

[0122] 结果如图5、6所示，在20倍LD50剂的破伤风毒素攻击时，阴性对照组小鼠在24h-48h全部死亡，阳性对照组小鼠和各实验组(0.62ug/ml、1.85ug/ml、5.56ug/ml、16.67ug/ml和50ug/ml剂量)小鼠在7天内全部存活；在60倍LD50剂的破伤风毒素攻击下，阴性对照组小鼠在24h内全部死亡，剂量为0.62ug/ml的实验组小鼠在120h时观察到全部死亡，剂量
1.85ug/ml的实验组小鼠则在144h时全部死亡，中、高剂量的实验组(5.56ug/ml、16.67ug/ml和50ug/ml剂量)小鼠在7天内全部存活。表明本发明实施例提供的抗体TRN1015与标准抗毒素的效价(10IU/ml)相当，能有效地保护动物防御致死剂量破伤风毒素的攻击，与标准抗毒素的保护性基本一致。同时，本发明实施例提供的抗体TRN1015的实际用量远低于标准抗毒素，这表明其效果比标准抗毒素更佳。由此，能够说明本发明实施例提供的抗体TRN1015能够有效的中和小鼠的体内毒素，保护小鼠。

[0123] 本领域技术人员在考虑说明书及实践这里发明的公开后，将容易想到本发明的其它实施方案。本申请旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本发明未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由下面的权利要求指出。

[0124] 应当理解的是，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。本发明并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本发明的范围仅由所附的权利要求来限制。

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