一株有效控制茄劳尔氏菌并促进辣椒生长的解淀粉芽孢杆菌

摘要

本发明提供一株能够有效控制茄劳尔氏菌并促进辣椒生长的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，属于微生物技术领域。该菌株为解淀粉芽孢杆菌CAS02，分离自烟草根际，该菌株已于2018年3月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其生物保藏编号为CGMCC NO.15514。本发明的解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens)CAS02不仅对辣椒植株有促生作用，还可以抑制辣椒青枯病菌等多种病原菌的生长，因此具有非常好的应用前景。

权利要求

1.一株防病促生解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens)CAS02，该菌株已于2018年3月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其生物保藏号为CGMCC NO.15514。

2.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens)CAS02的培养方法，其特征在于，将解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens)CAS02置于LB液体培养基中培养。

3.如权利要求2所述培养方法，其特征在于，培养条件为28℃下有氧培养。

4.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，培养条件为采用摇床在28℃，150rpm条件下振荡培养。

5.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂包括权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens)CAS02。

6.如权利要求5所述的微生物菌剂，其特征在于，微生物菌剂的剂型为可湿性粉剂、水分散粒剂、水悬浮剂或可分散油悬浮剂。

7.如权利要求5所述的微生物菌剂，其特征在于，微生物菌剂中还包括农药学上可接受的辅料，所述农药学上可接受的辅料选自分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种。

8.一种微生物菌肥，其特征在于，所述微生物菌肥包括权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens)CAS02。

9.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens)CAS02、权利要求5-7任一项所述微生物菌剂或权利要求8所述微生物菌肥在植物细菌病害防治中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述植物细菌病害为梨树火疫病、马铃薯软腐病、棉花角斑病、烟草青枯病、烟草野火病或辣椒炭疽病。

11.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens)CAS02、权利要求5-7任一项所述微生物菌剂或权利要求8所述微生物菌肥在促进辣椒生长中的应用。

说明书

一株有效控制茄劳尔氏菌并促进辣椒生长的解淀粉芽孢杆菌

技术领域

[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株有效控制茄劳尔氏菌并促进辣椒生长的解淀粉芽孢杆菌。

背景技术

[0002] 辣椒(Capsicum annuum L)，属于茄科、辣椒属，一年或有限多年生草本植物，是我国重要的蔬菜作物及工业原料。由茄劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的青枯病是辣椒、番茄、烟草等茄科作物上一种毁灭性土传维管束病害。该病广泛分布于热带、亚热带及某些温带地区，随着新寄主的不断出现和设施农业的快速发展等因素，世界范围内青枯病的发生也越来越普遍和严重。目前青枯病在我国绝大部分省区都有发生和危害。根据种植环境条件及品种的不同，由茄劳尔氏菌引起的青枯病对植物的危害会有一定的差异，在发病严重地区可造成作物严重减产甚至绝产，造成巨大的经济损失。因此，加强青枯病的防治具有重要的现实意义。

[0003] 对于植物病害的防治，通常采用培育抗病品种和使用化学药剂的方法。但是抗病品种的选育多是针对一些特定的病原小种，具有一定的局限性，而且抗病品种的选育过程一般需要多年的时间。大量使用化学农药带来的负面作用越来越受到人们的关注，尤其是一些高毒高残留农药的使用逐渐受到政府政策的限制。利用微生物防治植物病害是生物防治的重要形式之一，是一种环境友好型的防治方法，也是减少化学农药使用的有效措施之一。许多微生物是植物病原菌的自然天敌，尤其在防治土传病害方面有先天的优势。芽孢杆菌是自然界中分布最广泛的革兰氏阳性细菌之一，广泛分布于水、土壤等环境中。因为芽孢杆菌的抗逆性强，而且很多菌株能够促进植物生长、抑制病原菌对植物的危害，而成为农业生产中应用最为广泛的一种生防菌。然而迄今为止尚未有关于既能有效防治茄劳尔氏菌等多种病原菌同时又能有效促进辣椒生长的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的报道。

发明内容

[0004] 针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于提供一株具有抑制辣椒青枯病菌等多种病原菌的解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens)CAS02，其在辣椒青枯病的生物防治、促进辣椒生长等方面有非常好的效果，为辣椒主要病害青枯病等防治提供了新的微生物资源。

[0005] 为实现上述目的，本发明涉及以下技术方案：

[0006] 本发明的第一个方面，提供一株防病促生解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens)CAS02，该菌株已于2018年3月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为CGMCC NO.15514。

[0007] 本发明的第二个方面，提供上述解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens)CAS02的培养方法，包括将解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens)CAS02置于LB液体培养基中培养，培养条件为28℃下有氧培养，如摇床(28℃，150rpm)振荡培养。

[0008] 其中，所述LB培养基配方(g/L)为：胰蛋白胨10.0；酵母提取物5.0；氯化钠10.0；pH7.0±0.2；

[0009] 本发明的第三个方面，提供一种微生物菌剂，所述微生物菌剂包括解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens)CAS02或解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens)CAS02的培养物。所述微生物菌剂具有抑制梨树火疫病(Erwinia amylovora 2029)、马铃薯软腐病(Pectobacterium carotovorum)、棉花角斑病(Xanthomonas campestris MSCT1)、烟草青枯病(Ralstonia solanacearum)、烟草野火病(Pseudomonas syringae pv.tabaci)、辣椒炭疽病(Colletotrichum acutatum)以及促进辣椒生长的作用。

[0010] 作为优选，微生物菌剂的剂型为可湿性粉剂、水分散粒剂、水悬浮剂或可分散油悬浮剂；

[0011] 作为优选，微生物菌剂中还包括农药学上可接受的辅料，所述农药学上可接受的辅料选自分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种。本发明对所述农药学上可接受的辅料的来源等没有特殊限制，一般采用市售产品即可。

[0012] 本发明的第四个方面，提供一种微生物菌肥，所述微生物菌肥包括上述解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens)CAS02或解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens)CAS02的培养物。所述微生物菌肥具有抑制梨树火疫病(Erwinia amylovora 2029)、马铃薯软腐病(Pectobacterium carotovorum)、棉花角斑病(Xanthomonas campestris MSCT1)、烟草青枯病(Ralstonia solanacearum)、烟草野火病(Pseudomonas syringae pv.tabaci)、辣椒炭疽病(Colletotrichum acutatum)以及促进辣椒生长的作用。

[0013] 作为优选，微生物菌肥还含有有机质、全钾、全氮，用于提供养分。

[0014] 本发明的第五个方面，提供了上述解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens)CAS02、微生物菌剂和/或微生物菌肥在植物细菌病害防治中的应用。

[0015] 作为优选，所述植物细菌病害包括但不限于梨树火疫病(Erwinia amylovora2029)、马铃薯软腐病(Pectobacterium carotovorum)、棉花角斑病(Xanthomonas campestris MSCT1)、烟草青枯病(Ralstonia solanacearum)、烟草野火病(Pseudomonas syringae pv.tabaci)和辣椒炭疽病(Colletotrichum acutatum)。

[0016] 本发明的第六个方面，提供上述解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens)CAS02、微生物菌剂和/或微生物菌肥在促进辣椒生长中的应用。

[0017] 本发明的有益效果：

[0018] 本发明通过室内平板对峙法和温室盆栽防治效果首次从烟草健株根际土壤中筛选出一株解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens)CAS02，所述菌株防病、促生效果俱佳，且其抗逆性强，该菌株兼具病原菌拮抗活性，且抑菌谱广，在针对植物细菌病害特别是针对由茄劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的辣椒青枯病的防治中极具有应用开发潜力；且经盆栽试验证明，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CAS02对辣椒还具有明显的促生效果。因此，本发明的解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens)CAS02对防治青枯病等植物细菌病害以及促进辣椒生长具有重要的现实意义。

附图说明

[0019] 图1为CAS02菌株对病原菌的拮抗图，其中，图1A，梨树火疫病菌(Erwinia amylovora 2029)；图1B，马铃薯软腐病病菌(Pectobacterium carotovorum)；图1C，棉花角斑病菌(Xanthomonas campestris  MSCT1)；图1D，烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)；图1E，烟草野火病菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci)；图1F，辣椒炭疽病菌(Colletotrichum acutatum)。

[0020] 图2为基于16S rDNA构建的系统进化树。

[0021] 图3为菌株CAS02对辣椒的促生作用效果图，其中，A为菌株CAS02处理组；B为对照组。

具体实施方式

[0022] 应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

[0023] 需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

[0024] 结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0025] 如前所述，迄今为止尚未有关于既能有效控制茄劳尔氏菌等多种病原菌同时又能有效促进辣椒生长的芽孢杆菌的报道。

[0026] 有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供一株防病促生解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens)CAS02，该菌株已于2018年3月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为CGMCC NO.15514。

[0027] 本发明中，通过测定该菌株16S rDNA基因序列(见SEQ ID NO.1)，最终确定该菌株属于解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens)CAS02。

[0028] 本发明的又一具体实施方式中，提供上述解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens)CAS02的培养方法，包括将解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens)CAS02置于LB液体培养基中培养，培养条件为28℃下有氧培养，如摇床(28℃，150rpm)振荡培养。

[0029] 其中，所述LB培养基配方(g/L)为：胰蛋白胨10.0；酵母提取物5.0；氯化钠10.0；pH7.0±0.2；

[0030] 本发明的又一具体实施方式中，提供一种微生物菌剂，所述微生物菌剂包括解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens)CAS02或解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens)CAS02的培养物。所述微生物菌剂具有抑制梨树火疫病(Erwinia amylovora 2029)、马铃薯软腐病(Pectobacterium carotovorum)、棉花角斑病(Xanthomonas campestris MSCT1)、烟草青枯病(Ralstonia solanacearum)、烟草野火病(Pseudomonas syringae pv.tabaci)、辣椒炭疽病(Colletotrichum acutatum)以及促进辣椒生长的作用。

[0031] 本发明的又一具体实施方式中，微生物菌剂的剂型为可湿性粉剂、水分散粒剂、水悬浮剂或可分散油悬浮剂；

[0032] 本发明的又一具体实施方式中，微生物菌剂中还包括农药学上可接受的辅料，所述农药学上可接受的辅料选自分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种。本发明对所述农药学上可接受的辅料的来源等没有特殊限制，一般采用市售产品即可。

[0033] 其中，所述分散剂为阴离子型分散剂和/或非离子型分散剂，可选自木质素磺酸钠、萘磺酸钠甲醛缩合物、亚甲基双萘磺酸钠、甲醛缩合物硫酸盐、聚羧酸盐、烷基酚聚氧乙烯基磷酸酯和脂肪酸聚氧乙烯酯中的一种或多种；

[0034] 所述湿润剂可选自十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、皂角粉、无患子粉、茶枯粉和拉开粉BX中的一种或多种；

[0035] 所述崩解剂可选自膨润土、硫酸铵、氯化铝、尿素、氯化镁和葡萄糖中的一种或多种；

[0036] 所述粘结剂可选自淀粉、硅藻土、环糊精、松香、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素和羧甲基纤维素盐中的一种或多种；

[0037] 所述消泡剂可选自C8～C20脂肪醇类化合物、C10～C20饱和脂肪酸类化合物、环氧大豆油、乙醇、硅酮类化合物和有机硅油中的一种或多种；

[0038] 所述抗冻剂可选自山梨醇、乙二醇、聚乙二醇、丙二醇、丙三醇、尿素和氯化钠中的一种或多种；

[0039] 所述增稠剂可选自明胶、黄原胶、聚乙二醇和聚乙烯醇中的一种或多种；

[0040] 所述填料可选自轻质碳酸钙、硅藻土、膨润土、凹凸棒土和白炭黑中的一种或多种；

[0041] 所述溶剂可选自水(优选为去离子水)或油酸甲酯；

[0042] 本发明的又一具体实施方式，提供一种微生物菌肥，所述微生物菌肥包括上述解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens)CAS02或解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens)CAS02的培养物。所述微生物菌肥具有抑制梨树火疫病(Erwinia amylovora 2029)、马铃薯软腐病(Pectobacterium carotovorum)、棉花角斑病(Xanthomonas campestris MSCT1)、烟草青枯病(Ralstonia solanacearum)、烟草野火病(Pseudomonas syringae pv.tabaci)、辣椒炭疽病(Colletotrichum acutatum)以及促进辣椒生长的作用。

[0043] 本发明的又一具体实施方式中，所述微生物菌肥还含有有机质、全钾、全氮，用于提供养分。

[0044] 本发明的又一具体实施方式中，提供了上述解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens)CAS02、微生物菌剂和/或微生物菌肥在植物细菌病害防治中的应用。

[0045] 本发明的又一具体实施方式中，所述植物细菌病害包括但不限于梨树火疫病(Erwinia amylovora 2029)、马铃薯软腐病(Pectobacterium carotovorum)、棉花角斑病(Xanthomonas campestris MSCT1)、烟草青枯病(Ralstonia solanacearum)、烟草野火病(Pseudomonas syringae pv.tabaci)和辣椒炭疽病(Colletotrichum acutatum)。

[0046] 本发明的又一具体实施方式中，提供上述解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens)CAS02、微生物菌剂和/或微生物菌肥在促进辣椒生长中的应用。

[0047] 以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。

[0048] 实施例1：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CAS02抑菌能力测定[0049] 该菌株(CAS02)分离自山东青岛烟草根际土壤。采用对峙培养法(Sijam等，2005)测定菌株对病原菌的抑菌能力。吸取10μL菌悬液(OD420＝0.3)，接种于直径为9cm的NBY固体培养基中央，待菌液充分吸收后，将培养皿放入28℃生化培养箱中倒置培养72h。然后分别向NBY培养基喷施OD420＝0.3的病原菌悬液。再次将培养皿转移至28℃恒温培养箱，倒置培养24h后，对菌株的抑菌能力进行测定，结果显示菌株CAS02对梨树火疫病(Erwinia amylovora 2029)、马铃薯软腐病(Pectobacterium carotovorum)、棉花角斑病(Xanthomonas campestris MSCT1)、烟草青枯病(Ralstonia solanacearum)、烟草野火病菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci)和辣椒炭疽病(Colletotrichum acutatum)均具有非常显著的拮抗效果(图1)。

[0050] 实施例2：菌株16S rDNA序列的获得

[0051] 以解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CAS02基因组DNA为模板，利用细菌16S  rDNA通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)扩增16S rDNA序列。扩增体系及程序：25μL的PCR体系中包含
5×PCR缓冲液5.0μL，DNA模板(100ngμL-1)1.0μL，dNTPs(10mM)0.75μL，正向引物(10μM)
0.75μL，反向引物(10μM)0.75μL，MgCl2(25mM)2.5μL，Taq DNA聚合酶(5UμL-1Promega)0.25μL，其余部分ddH2O补齐。PCR扩增程序为94℃预变性3min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸
1min30s，30个循环。最后，72℃延伸10min,4℃保存。反应结束后，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。将获得的片段进行测序分析。利用MEGA软件构建系统进化树(图2)。

[0052] CAS02与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)FZB42的16S rDNA序列一致率为99.8％。在根据16S rDNA序列构建的系统进化树中，CAS02与解淀粉芽孢杆菌聚为一簇，表明CAS02属于解淀粉芽孢杆菌。

[0053] 实施例3：菌株CAS02温室促生试验

[0054] 将长势一致的辣椒幼苗移栽至灭菌后的基质中，待幼苗生长至两片真叶时，将CAS02菌悬缓慢灌入辣椒根围，每株20ml。对照组浇灌等体积的霍格兰营养液。28d后测量CAS02对辣椒的促生效果。通对照相比，用CAS02处理可以显著促进辣椒植株的生长，植株的鲜重和地上部分株高分别增加81.25％和34.23％，和对照相比叶绿素a和叶绿素b含量分别增加29.09％和17.63％(表1，图2)。

[0055] 表1菌株CAS02对辣椒的促生作用

[0056]

[0057] 注：数据为三次重复的平均值。不同字母表示在同一时期不同处理在p<0.01的显著水平下，差异性显著(LSD test)

[0058] 实施例4：菌株CAS02对辣椒青枯病的生防效果

[0059] 辣椒移栽后，将CAS02菌悬液缓慢灌入辣椒根围，每株20ml，对照组浇灌等体积的霍格兰营养液。7d后在辣椒根际周围接种茄劳尔氏菌，每株20ml，28d后统计发病情况。按照Kempe(1983)提出的青枯病病级划分标准，按照0、1、2、3、4划分为5个等级。0级：没有青枯症状；1级：1～25％的叶片出现萎蔫症状；2级：26～50％的叶片出现萎蔫症状；3级：51～75％的叶片出现萎蔫症状；4级：76～100％的叶片出现萎蔫症状。病情指数和生防效果按照如下公式计算。病情指数＝100×∑(发病植株数×病级数)/(总株数×最高病级数)；相对防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100。

[0060] 与对照相比，CAS02处理的植株发病率比对照组低33.34％，病情指数低47.5，防效达到67.86％(表2)。

[0061] 表2菌株CAS02对辣椒的防病作用

[0062]

[0063] 注：数据为三次重复的平均值。不同字母表示在同一时期不同处理在p<0.01的显著水平下，差异性显著(LSD test)。

[0064] 应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。