本发明公开了一种乳腺癌21基因检测试剂盒及其检测方法；所述试剂盒包括分别检测ACTB、GAPDH、RPLPO、GUS、TFRC、CD68、BAG1、GSTM1、HER2、GRB7、MMP11、CTSL2、KI67、STK15、CCNB1、MYBL2、Survivin、ESR1、PGR、BCL2和SCUBE2基因的引物和探针，试剂盒中21个基因各设计了两对引物和2条特异性探针，每个基因的引物和探针混合液放在一个反应管中，在QPCR上扩增时使用同一种缓冲液和程序，操作简便、节省检测时间并得到清晰准确的结果；本试剂盒适用广泛，对于科研和临床检测都适用，单或多样品，都能使用本试剂盒，检测结果快速准确。
1.一种乳腺癌21基因检测试剂盒，其特征是21个基因为：ACTB、GAPDH、RPLPO、GUS、TFRC、CD68、BAG1、GSTM1、HER2、GRB7、MMP11、CTSL2、KI67、STK15、CCNB1、MYBL2、Survivin、ESR1、PGR、BCL2和SCUBE2；
试剂盒中针对21个基因各设计了两对引物和2条特异性探针，21个基因所对应的引物序列和TaqMan探针序列分别如下：（1）检测ACTB基因的引物序列为：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，检测ACTB基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；具体序列如下：ACTB：
F1:5'-CCAACTTGAGATGTATGAAG -3' （SEQ ID NO.1）R1:5'-GTCAGTGTACAGGTAAGC -3' （SEQ ID NO.2）F2:5'-TGGAGAAGAGCTACGA -3' （SEQ ID NO.3）R2:5'-GAAGGAAGGCTGGAAG -3' （SEQ ID NO.4）P1:5'FAM-CTGCCTCCACCCACTCCC-3'MGB （SEQ ID NO.5）P2:5'VIC-CGGAACCGCTCATTGCCA-3'MGB （SEQ ID NO.6）；
（2）检测GAPDH基因的引物序列为：SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10，检测GAPDH基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；具体序列如下：GAPDH：
F1:5'-GCCTCCAAGGAGTAAGA -3' （SEQ ID NO.7）R1:5'-GCAGTGAGGGTCTCTC -3' （SEQ ID NO.8）F2:5'-CCATGACAACTTTGGTATCA -3' （SEQ ID NO.9）R2:5'-GCCATCCACAGTCTTCA -3' （SEQ ID NO.10）P1:5'FAM-TCCTCTTGTGCTCTTGCTGG-3'MGB （SEQ ID NO.11）P2:5'VIC-AGTCCATGCCATCACTGCCA-3'MGB （SEQ ID NO.12）；
（3）检测RPLPO基因的引物序列为：SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16，检测RPLPO基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18；具体序列如下：RPLPO：
F1:5'--GGTTGAAGCCAAGGAAGA -3' （SEQ ID NO.13）R1:5'-TGGTGATTAGTCAAAGAGACC -3' （SEQ ID NO.14）F2:5'-GGGCACCATTGAAATCCA -3' （SEQ ID NO.15）R2:5'-GGAGATGTTGAGCATGTTCA -3' （SEQ ID NO.16）P1:5'FAM-ATCCTCGTCCGACTCCTCCG-3'MGB （SEQ ID NO.17）P2:5'VIC-CGTGGCTTCGCTGGCTCC-3'MGB （SEQ ID NO.18）；
（4）检测GUS基因的引物序列为：SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22，检测GUS基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24；具体序列如下：GUS：
F1:5'-CCACAGCAGCAGAACA-3' （SEQ ID NO.19）R1:5'- CTGCTAGAATAGATGACCACAA-3' （SEQ ID NO.20）F2:5'-GGTGTCAACAAGCATGAGA -3' （SEQ ID NO.21）R2:5'-CAGCGAAGCAGGTTGAA -3' （SEQ ID NO.22）P1:5'FAM-CCTCCTGGACTGTTCACGGC-3'MGB （SEQ ID NO.23）P2:5'VIC-TCCTTCACCAGCAGCGGC-3'MGB （SEQ ID NO.24）；
（5）检测TFRC基因的引物序列为：SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28，检测TFRC基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30；具体序列如下：TFRC：
F1:5'-GGACTGACATTTAGCGTAG -3' （SEQ ID NO.25）R1:5'-GCCACATGCTTTCATTTAAG -3' （SEQ ID NO.26）F2:5'-GAGAGGATTCCTGAGTTGAA -3' （SEQ ID NO.27）R2:5'-TCCAGGTTCAATTCAACATCA -3' （SEQ ID NO.28）P1:5'FAM-TGCGTAACACCCGAACCAGG-3'MGB （SEQ ID NO.29）P2:5'VIC-CACGAACTGACCAGCGACCT-3'MGB （SEQ ID NO.30）；
（6）检测CD68基因的引物序列为SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34，检测CD68基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36；具体序列如下：CD68：
F1:5'-GGCAGAACTGCTTGAA -3' （SEQ ID NO.31）R1:5'-GCGATCTTGGCTTAGTG -3' （SEQ ID NO.32）F2:5'-ACCTGCTTCTCTCATTCCA -3' （SEQ ID NO.33）R2:5'-CTCCACCGCCATGTAGA -3' （SEQ ID NO.34）P1:5'FAM-CGGCTCACTGCAACCTCCA-3'MGB （SEQ ID NO.35）P2:5'VIC-CCTTCTGCTGGAGGTCCTGC-3'MGB （SEQ ID NO.36）；
（7）检测BAG1基因的引物序列为：SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38和SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40，检测BAG1基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42；具体序列如下：BAG1：
F1:5'-GCTACTACCTCTGCTTGA -3' （SEQ ID NO.37）R1:5'-GTGAGTTGAATTCTGAAGGA -3' （SEQ ID NO.38）F2:5'-CCACAGGCCATGAGATAA -3' （SEQ ID NO.39）R2:5'-GGTTCTAACCTTCTGAAGACA -3' （SEQ ID NO.40）P1:5'FAM-TCCTCACCTTCCTTCCTCCA-3'MGB （SEQ ID NO.41）P2:5'VIC-CCGTTCCTTGGATGGAGCCT-3'MGB （SEQ ID NO.42）；
（8）检测GSTM1基因的引物序列为：SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44和SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46，检测GSTM1基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48；具体序列如下：GSTM1：
F1:5'-CCCATCATTACCCTTCC -3' （SEQ ID NO.43）R1:5'-GCCCTTTAAAGCAGACA -3' （SEQ ID NO.44）F2:5'-GAGGGCTTGGAGAAGAA -3' （SEQ ID NO.45）R2:5'-GACAGCCATCTTTGAGAAA -3' （SEQ ID NO.46）P1:5'FAM-AGCCAGCCTGACCTTCCTTC-3'MGB （SEQ ID NO.47）P2:5'VIC-AGTCCAGCCGCTTCCTCC-3'MGB （SEQ ID NO.48）；
（9）检测HER2基因的引物序列为：SEQ ID NO.49和SEQ ID NO.50和SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.52，检测HER2基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.53和SEQ ID NO.54；具体序列如下：HER2：
F1:5'-CTCCGACCACTTCCAG -3' （SEQ ID NO.49）R1:5'-CCCTTCCAGCCATCTG -3' （SEQ ID NO.50）F2:5'-GGTGGTTGGCATTCTGA -3' （SEQ ID NO.51）R2:5'-CCGCATCGTGTACTTC -3' （SEQ ID NO.52）P1:5'FAM-CTGCCATGCCAGGAACCTGT-3'MGB （SEQ ID NO.53）P2:5'VIC-TTCTGCTGCCGTCGCTTGA-3'MGB （SEQ ID NO.54）；
（10）检测GRB7基因的引物序列为：SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56和SEQ ID NO.57和SEQ ID NO.58，检测GRB7基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.59和SEQ ID NO.60；具体序列如下：GRB7：
F1:5'-CCTCCCTCAGATAGAA -3' （SEQ ID NO.55）R1:5'-GCTAGGAGAAGGAGAG -3' （SEQ ID NO.56）F2:5'-GGCTTCGGATCTTCTGA -3' （SEQ ID NO.57）R2:5'-CCGTACTTGAAGAGGC -3' （SEQ ID NO.58）P1:5'FAM-CCACTCCAGTCCACTCCTGA-3'MGB （SEQ ID NO.59）P2:5'VIC-AGATGAGCAGAGCCGCACC-3'MGB （SEQ ID NO.60）；
（11）检测MMP11基因的引物序列为：SEQ ID NO.61和SEQ ID NO.62和SEQ ID NO.63和SEQ ID NO.64，检测MMP11基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.65和SEQ ID NO.66；具体序列如下：MMP11：
F1:5'-AGGTCAGGTCTTGGTA -3' （SEQ ID NO.61）R1:5'-CTGGATTCTGGAGAACA -3' （SEQ ID NO.62）F2:5'--CCAGATGCCTGTGAGGA -3' （SEQ ID NO.63）R2:5'-AGCCCGCTTTGAAGAA -3' （SEQ ID NO.64）P1:5'FAM-TTCTGGCTGACAATCCTGGA-3'MGB （SEQ ID NO.65）P2:5'VIC-TCCACCATCCGAGGCGAGC-3'MGB （SEQ ID NO.66）；
（12）检测CTSL2基因的引物序列为：SEQ ID NO.67和SEQ ID NO.68和SEQ ID NO.69和SEQ ID NO.70；检测CTSL2基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.71和SEQ ID NO.72；具体序列如下：CTSL2：
F1:5'-CCTAGATGGTATAGCCTATTAC -3' （SEQ ID NO.67）R1:5'-AGCACAGTGATGTGTTG -3' （SEQ ID NO.68）F2:5'-GGCTGGTCTTGAACTCA -3' （SEQ ID NO.69）R2:5'-TGGCTCACATCTGTAATC -3' （SEQ ID NO.70）P1:5'FAM-TGGTACAGCCTGTTGCTCCT-3'MGB （SEQ ID NO.71）P2:5'VIC-CCACCTGCCTCAGCCTCC-3'MGB （SEQ ID NO.72）；
（13）检测KI67基因的引物序列为：SEQ ID NO.73和SEQ ID NO.74和SEQ ID NO.75和SEQ ID NO.76，检测KI67基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.77和SEQ ID NO.78；具体序列如下：KI67：
F1:5'-CTCTGTACCTACCATCTCC -3' （SEQ ID NO.73）R1:5'-CAGGAGGGAAAGTTCCA -3' （SEQ ID NO.74）F2:5'-GGGAAAGTAGGTGTGAAAGA -3' （SEQ ID NO.75）R2:5'-CCATCTCCTGCTGTCTC -3' （SEQ ID NO.76）P1:5'FAM-AGGCACCTCCAACCACCACA-3'MGB （SEQ ID NO.77）P2:5'VIC-ACCAGTCGGCAAGCTCACAC-3'MGB （SEQ ID NO.78）；
（14）检测STK15基因的引物序列为：SEQ ID NO.79和SEQ ID NO.80和SEQ ID NO.81和SEQ ID NO.82，检测STK15基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.83和SEQ ID NO.84；具体序列如下：STK15：
F1:5'-ACAGGAGGCAAATCC -3' （SEQ ID NO.79）R1:5'-CAGGTACTAGGAAGGTTATTG -3' （SEQ ID NO.80）F2:5'-GGGTGGTCAGTACATGA -3' （SEQ ID NO.81）R2:5'-CATCCGACCTTCAATCA -3' （SEQ ID NO.82）P1:5'FAM-TGACCACTCTGCCCTGACCC-3'MGB （SEQ ID NO.83）P2:5'VIC-TCCATCTTCCAGGAGGACCA-3'MGB （SEQ ID NO.84）；
（15）检测CCNB1基因的引物序列为：SEQ ID NO.85和SEQ ID NO.86和SEQ ID NO.87和SEQ ID NO.88，检测CCNB1基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.89和SEQ ID NO.90；具体序列如下：CCNB1：
F1:5'-CTGTCAAGAACAAGTATGC -3' （SEQ ID NO.85）R1:5'-CACAGCCTTGGCTAAA -3' （SEQ ID NO.86）F2:5'-ATCGGTTCATGCAGAATAATTGA -3' （SEQ ID NO.87）R2:5'-GGAGGGTACATTTCTTCATATTTG -3' （SEQ ID NO.88）P1:5'FAM-AAGATCAGCACTCTACCACAGC-3'MGB （SEQ ID NO.89）P2:5'VIC-TGGCAGTGACACCAACCAGC-3'MGB （SEQ ID NO.90）；
（16）检测MYBL2基因的引物序列为：SEQ ID NO.91和SEQ ID NO.92和SEQ ID NO.93和SEQ ID NO.94，检测MYBL2基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.95和SEQ ID NO.96；具体序列如下：MYBL2：
F1:5'-CAGACTCTCAGGTGGA -3' （SEQ ID NO.91）R1:5'-GACCTGGAAGTGGAAC -3' （SEQ ID NO.92）F2:5'-GCCCTCTGTGCTCAAGA -3' （SEQ ID NO.93）R2:5'-CAGACTGGTGCTATTCTCA -3' （SEQ ID NO.94）P1:5'FAM-AGCACCAGGAGCCGCC-3'MGB （SEQ ID NO.95）P2:5'VIC-CACACGCCTCTTCCTCTGCC-3'MGB （SEQ ID NO.96）；
（17)检测Survivin基因的引物序列为：SEQ ID NO.97和SEQ ID NO.98和SEQ ID NO.99和SEQ ID NO.100，检测Survivin基因的TaqMan探针序列为SEQ ID NO.101和SEQ ID NO.102；具体序列如下：Survivin：
F1:5'-GCCATCCTTAAAACCAGA -3' （SEQ ID NO.97）R1:5'-CGGTTGCACTTAGACAA -3' （SEQ ID NO.98）F2:5'-CCTTCACATCTGTCACGA -3' （SEQ ID NO.99）R2:5'-GCTGCCTCCAAAGAAAG -3' （SEQ ID NO.100）P1:5'FAM-CCTCATGGCTACCAGCACCT-3'MGB （SEQ ID NO.101）P2:5'VIC-ACGCAGTCCGCCCAGGT-3'MGB （SEQ ID NO.102）；
（18）检测ESR1基因的引物序列为：SEQ ID NO.103和SEQ ID NO.104和SEQ ID NO.105和SEQ ID NO.106，检测ESR1基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.107和SEQ ID NO.108；
F1:5'-GCACCCTAGAAACAACATA -3' （SEQ ID NO.103）R1:5'-GTCTCTATAACCAATGACCTC -3' （SEQ ID NO.104）F2:5'-CTGGTGATTGTCAATTCATTCA -3' （SEQ ID NO.105）R2:5'-GCAGTGTATCAAGTTAAAATAGTC -3' （SEQ ID NO.106）P1:5'FAM-AGGTGCCTGAGACACAGACC-3'MGB （SEQ ID NO.107）P2:5'VIC-TCTGCCTTCCCTGTGTGCCC-3'MGB （SEQ ID NO.108）；
（19）检测PGR基因的引物序列为：SEQ ID NO.109和SEQ ID NO.110和SEQ ID NO.111和SEQ ID NO.112，检测PGR基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.113和SEQ ID NO.114；具体序列如下：PGR：
F1:5'-TGCCAAGAAGGTGAAAC -3' （SEQ ID NO.109）R1:5'-ACAGCTTTGCATTGTCA -3' （SEQ ID NO.110）F2:5'-CATGGAATGTCAACCTGTAA -3' （SEQ ID NO.111）R2:5'-GCACAGTCCTATGTCAG -3' （SEQ ID NO.112）P1:5'FAM-CCATCACTGCCAGGGACCCA-3'MGB （SEQ ID NO.113）P2:5'VIC-CTCCACAGTGCCCATCATCA-3'MGB （SEQ ID NO.114）；
（20）检测BCL2基因的引物序列为：SEQ ID NO.115和SEQ ID NO.116和SEQ ID NO.117和SEQ ID NO.118，检测BCL2基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.119和SEQ ID NO.120；
F1:5'-GGGTATGAAGGACCTGTA -3' （SEQ ID NO.115）R1:5'- GTCGTACCACAAACTTCAAA-3' （SEQ ID NO.116）F2:5'-GTGAGGAGAGGCAATGA -3' （SEQ ID NO.117）R2:5'-CCTTGCTTTAAACTCACAG -3' （SEQ ID NO.118）P1:5'FAM-TGCCTCTGCGAAGAACCTTG-3'MGB （SEQ ID NO.119）P2:5'VIC-CAGCCAACGTGCCATGTGC-3'MGB （SEQ ID NO.120）；
和（21)检测SCUBE2基因的引物序列为：SEQ ID NO.121和SEQ ID NO.122和SEQ ID NO.123和SEQ ID NO.124，检测SCUBE2基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.125和SEQ ID NO.126；具体序列如下：SCUBE2：
F1:5'-CCCAGTCTCAAATGTGA -3' （SEQ ID NO.121）R1:5'-GCTGTTACTGTTAGAGAATGA -3' （SEQ ID NO.122）F2:5'-GTGTCAACCTGGTGAATAA -3' （SEQ ID NO.123）R2:5'-GGGAAGCAGGAAGTTC -3' （SEQ ID NO.124）P1:5'FAM-TCCGTGGACATGAGCAGCC-3'MGB （SEQ ID NO.125）P2:5'VIC-ACCTTGCCAGCTCTGTGCC-3'MGB （SEQ ID NO.126）；
其中，TaqMan探针序列的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的乳腺癌21基因检测试剂盒，其特征在于，对应检测同一种基因的引物组和探针按比例混合形成引物探针预混液，所述试剂盒包括分别对应乳腺癌21个基因的21种引物探针预混液。
3.根据权利要求2所述的乳腺癌21基因检测试剂盒，其特征在于，对应检测同一种基因的引物组的浓度稀释到50-900nM，探针浓度稀释到50-500nM后混合形成引物探针预混液。
4.根据权利要求2所述的乳腺癌21基因检测试剂盒，其特征在于，所述21种引物探针预混液分别装在21个QPCR反应管中。
5.根据权利要求1所述的乳腺癌21基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括2× Master Mix溶液；所述2× Master Mix溶液包括10-100mM Tris-HCl、10-50 mM KCl、
1-10 mM (NH4)2SO4、1.5-6.0mM MgCl2、0.2-0.5mM dNTP、0.05-0.2U HotStart TaqDNA聚合酶、10-20%甘油和余量的ddH2O。
6.权利要求1-5任意一项所述的引物和探针在制备乳腺癌21基因检测试剂盒中的应用。
一种乳腺癌21基因检测试剂盒及其检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及基因技术领域，具体涉及一种乳腺癌21基因检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
[0002] 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，近20年来，以手术为中心，化疗、放射治疗、内分泌治疗为辅助的多学科综合治疗模式得到长足的发展，使乳腺癌的复发和死亡率显著降低，但仍然缺乏有效的方法能够较为准确地预测患者的复发风险并给予相应的治疗。
[0003] 乳腺癌的复发风险评估系统是基于RT-QPCR的方法通过精确计算来检测肿瘤组织中的16个与肿瘤相关的目的基因表达，即乳腺癌21基因检测，由基因表达量计算来获得乳腺癌的复发评分（RS），通过RS值评估个体化的治疗效果和预测10年乳腺癌复发的风险以及接受化疗的效益比。乳腺癌21基因检测是美国临床肿瘤学会（ASCO）和美国国立综合癌症网络（NCCN）联合推荐的用于乳腺癌预后与化疗的多基因表达检测评估与服务，可以避免资源的浪费和对部分低危者的过度治疗。乳腺癌21基因包含16个乳腺癌相关基因和5个参考基因，即增值组(Ki67、 STK15、 Survivin、 CCNB1和MYBL2)、侵袭组(MMP1 1 和CTSL2)、HER-2组(GRB7和HER2)、雌激素组 (ER、 PgR、 BCL2和SCUBE2)、其他基因组(GSTM1、CD68和BAG1)、参照基因组（ACTB、GAPDH、RPLP0、Gus和TFRc）。
[0004] 21基因检测需要从石蜡包埋切片中提取RNA，从该样本中抽提的RNA不可避免地会出现降解的情况。所以我们需要解决在RNA降解情况下，仍能准确的对21基因进行检测的问题。目前21基因检测的试剂盒一般采用SYBR Green法、Taqman荧光PCR法。SYBR Green法只需设计一对引物，在反应时需要加入SYBR GreenⅠ荧光染料即可，这种方法的缺点在于PCR的特异性差，灵敏度不高，结果并不是十分准确。Taqman荧光PCR法，需要设计引物和探针，简单的Taqman法只需设计一对引物和一条探针即可，而多重荧光PCR需要设计多对引物和探针，并且要保证多重PCR的各个引物之间不相互干扰以及各个探针之间不相互干扰，这就对引物和探针的要求比较高，设计难度大；此外，多重PCR对PCR的缓冲液和QPCR仪器都有一定的要求。21个基因检测有21个基因需要检测，将21个基因放在同一PCR管里检测并不现实，所以现有的多重荧光PCR法是将21基因分成了八组进行检测，也就是每个反应管里要加2-3个基因，这就增加了实验操作的复杂性，并且得到的实验数据也不是十分清晰明了，而且我们也不清楚同一个管里的几个基因是否相互之间有干扰。因此，我们需要找到一种特异性、灵敏度高，操作简便，数据准确的21基因检测试剂盒和方法。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于为了克服现有技术中存在的特异性灵敏度欠佳或操作复杂的缺陷，提供一种乳腺癌21基因检测试剂盒及其检测方法。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0007] 第一方面，本发明涉及一种乳腺癌21基因检测试剂盒，其特征是21个基因为：ACTB、GAPDH、RPLPO、GUS、TFRC、CD68、BAG1、GSTM1、HER2、GRB7、MMP11、CTSL2、KI67、STK15、CCNB1、MYBL2、Survivin、ESR1、PGR、BCL2和SCUBE2，21个基因所对应的引物序列和TaqMan探针序列分别如下：
[0008] 试剂盒中21个基因各设计了两对引物和2条特异性探针，21个基因所对应的引物序列和TaqMan探针序列分别如下：
[0009] （1）检测ACTB基因的引物序列为：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，检测ACTB基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；具体序列如下：
[0010] ACTB：
[0011] F1:5'-CCAACTTGAGATGTATGAAG -3' （SEQ ID NO.1）
[0012] R1:5'-GTCAGTGTACAGGTAAGC -3' （SEQ ID NO.2）
[0013] F2:5'-TGGAGAAGAGCTACGA -3' （SEQ ID NO.3）
[0014] R2:5'-GAAGGAAGGCTGGAAG -3' （SEQ ID NO.4）
[0015] P1:5'FAM-CTGCCTCCACCCACTCCC-3'MGB （SEQ ID NO.5）
[0016] P2:5'VIC-CGGAACCGCTCATTGCCA-3'MGB （SEQ ID NO.6）；
[0017] （2）检测GAPDH基因的引物序列为：SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10，检测GAPDH基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；具体序列如下：
[0018] GAPDH：
[0019] F1:5'-GCCTCCAAGGAGTAAGA -3' （SEQ ID NO.7）
[0020] R1:5'-GCAGTGAGGGTCTCTC -3' （SEQ ID NO.8）
[0021] F2:5'-CCATGACAACTTTGGTATCA -3' （SEQ ID NO.9）
[0022] R2:5'-GCCATCCACAGTCTTCA -3' （SEQ ID NO.10）
[0023] P1:5'FAM-TCCTCTTGTGCTCTTGCTGG-3'MGB （SEQ ID NO.11）
[0024] P2:5'VIC-AGTCCATGCCATCACTGCCA-3'MGB （SEQ ID NO.12）；
[0025] （3）检测RPLPO基因的引物序列为：SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16，检测RPLPO基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18；具体序列如下：
[0026] RPLPO：
[0027] F1:5'--GGTTGAAGCCAAGGAAGA -3' （SEQ ID NO.13）
[0028] R1:5'-TGGTGATTAGTCAAAGAGACC -3' （SEQ ID NO.14）
[0029] F2:5'-GGGCACCATTGAAATCCA -3' （SEQ ID NO.15）
[0030] R2:5'-GGAGATGTTGAGCATGTTCA -3' （SEQ ID NO.16）
[0031] P1:5'FAM-ATCCTCGTCCGACTCCTCCG-3'MGB （SEQ ID NO.17）
[0032] P2:5'VIC-CGTGGCTTCGCTGGCTCC-3'MGB （SEQ ID NO.18）；
[0033] （4）检测GUS基因的引物序列为：SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22，检测GUS基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24；具体序列如下：
[0034] GUS：
[0035] F1:5'-CCACAGCAGCAGAACA-3' （SEQ ID NO.19）
[0036] R1:5'- CTGCTAGAATAGATGACCACAA-3' （SEQ ID NO.20）
[0037] F2:5'-GGTGTCAACAAGCATGAGA -3' （SEQ ID NO.21）
[0038] R2:5'-CAGCGAAGCAGGTTGAA -3' （SEQ ID NO.22）
[0039] P1:5'FAM-CCTCCTGGACTGTTCACGGC-3'MGB （SEQ ID NO.23）
[0040] P2:5'VIC-TCCTTCACCAGCAGCGGC-3'MGB （SEQ ID NO.24）；
[0041] （5）检测TFRC基因的引物序列为：SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28，检测TFRC基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30；具体序列如下：
[0042] TFRC：
[0043] F1:5'-GGACTGACATTTAGCGTAG -3' （SEQ ID NO.25）
[0044] R1:5'-GCCACATGCTTTCATTTAAG -3' （SEQ ID NO.26）
[0045] F2:5'-GAGAGGATTCCTGAGTTGAA -3' （SEQ ID NO.27）
[0046] R2:5'-TCCAGGTTCAATTCAACATCA -3' （SEQ ID NO.28）
[0047] P1:5'FAM-TGCGTAACACCCGAACCAGG-3'MGB （SEQ ID NO.29）
[0048] P2:5'VIC-CACGAACTGACCAGCGACCT-3'MGB （SEQ ID NO.30）；
[0049] （6）检测CD68基因的引物序列为SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34，检测CD68基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36；具体序列如下：
[0050] CD68：
[0051] F1:5'-GGCAGAACTGCTTGAA -3' （SEQ ID NO.31）
[0052] R1:5'-GCGATCTTGGCTTAGTG -3' （SEQ ID NO.32）
[0053] F2:5'-ACCTGCTTCTCTCATTCCA -3' （SEQ ID NO.33）
[0054] R2:5'-CTCCACCGCCATGTAGA -3' （SEQ ID NO.34）
[0055] P1:5'FAM-CGGCTCACTGCAACCTCCA-3'MGB （SEQ ID NO.35）
[0056] P2:5'VIC-CCTTCTGCTGGAGGTCCTGC-3'MGB （SEQ ID NO.36）；
[0057] （7）检测BAG1基因的引物序列为：SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38和SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40，检测BAG1基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42；具体序列如下：
[0058] BAG1：
[0059] F1:5'-GCTACTACCTCTGCTTGA -3' （SEQ ID NO.37）
[0060] R1:5'-GTGAGTTGAATTCTGAAGGA -3' （SEQ ID NO.38）
[0061] F2:5'-CCACAGGCCATGAGATAA -3' （SEQ ID NO.39）
[0062] R2:5'-GGTTCTAACCTTCTGAAGACA -3' （SEQ ID NO.40）
[0063] P1:5'FAM-TCCTCACCTTCCTTCCTCCA-3'MGB （SEQ ID NO.41）
[0064] P2:5'VIC-CCGTTCCTTGGATGGAGCCT-3'MGB （SEQ ID NO.42）；
[0065] （8）检测GSTM1基因的引物序列为：SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44和SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46，检测GSTM1基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48；具体序列如下：
[0066] GSTM1：
[0067] F1:5'-CCCATCATTACCCTTCC -3' （SEQ ID NO.43）
[0068] R1:5'-GCCCTTTAAAGCAGACA -3' （SEQ ID NO.44）
[0069] F2:5'-GAGGGCTTGGAGAAGAA -3' （SEQ ID NO.45）
[0070] R2:5'-GACAGCCATCTTTGAGAAA -3' （SEQ ID NO.46）
[0071] P1:5'FAM-AGCCAGCCTGACCTTCCTTC-3'MGB （SEQ ID NO.47）
[0072] P2:5'VIC-AGTCCAGCCGCTTCCTCC-3'MGB （SEQ ID NO.48）；
[0073] （9）检测HER2基因的引物序列为：SEQ ID NO.49和SEQ ID NO.50和SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.52，检测HER2基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.53和SEQ ID NO.54；具体序列如下：
[0074] HER2：
[0075] F1:5'-CTCCGACCACTTCCAG -3' （SEQ ID NO.49）
[0076] R1:5'-CCCTTCCAGCCATCTG -3' （SEQ ID NO.50）
[0077] F2:5'-GGTGGTTGGCATTCTGA -3' （SEQ ID NO.51）
[0078] R2:5'-CCGCATCGTGTACTTC -3' （SEQ ID NO.52）
[0079] P1:5'FAM-CTGCCATGCCAGGAACCTGT-3'MGB （SEQ ID NO.53）
[0080] P2:5'VIC-TTCTGCTGCCGTCGCTTGA-3'MGB （SEQ ID NO.54）；
[0081] （10）检测GRB7基因的引物序列为：SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56和SEQ ID NO.57和SEQ ID NO.58，检测GRB7基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.59和SEQ ID NO.60；具体序列如下：
[0082] GRB7：
[0083] F1:5'-CCTCCCTCAGATAGAA -3' （SEQ ID NO.55）
[0084] R1:5'-GCTAGGAGAAGGAGAG -3' （SEQ ID NO.56）
[0085] F2:5'-GGCTTCGGATCTTCTGA -3' （SEQ ID NO.57）
[0086] R2:5'-CCGTACTTGAAGAGGC -3' （SEQ ID NO.58）
[0087] P1:5'FAM-CCACTCCAGTCCACTCCTGA-3'MGB （SEQ ID NO.59）
[0088] P2:5'VIC-AGATGAGCAGAGCCGCACC-3'MGB （SEQ ID NO.60）；
[0089] （11）检测MMP11基因的引物序列为：SEQ ID NO.61和SEQ ID NO.62和SEQ ID NO.63和SEQ ID NO.64，检测MMP11基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.65和SEQ ID NO.66；具体序列如下：
[0090] MMP11：
[0091] F1:5'-AGGTCAGGTCTTGGTA -3' （SEQ ID NO.61）
[0092] R1:5'-CTGGATTCTGGAGAACA -3' （SEQ ID NO.62）
[0093] F2:5'--CCAGATGCCTGTGAGGA -3' （SEQ ID NO.63）
[0094] R2:5'-AGCCCGCTTTGAAGAA -3' （SEQ ID NO.64）
[0095] P1:5'FAM-TTCTGGCTGACAATCCTGGA-3'MGB （SEQ ID NO.65）
[0096] P2:5'VIC-TCCACCATCCGAGGCGAGC-3'MGB （SEQ ID NO.66）；
[0097] （12）检测CTSL2基因的引物序列为：SEQ ID NO.67和SEQ ID NO.68和SEQ ID NO.69和SEQ ID NO.70；检测CTSL2基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.71和SEQ ID NO.72；具体序列如下：
[0098] CTSL2：
[0099] F1:5'-CCTAGATGGTATAGCCTATTAC -3' （SEQ ID NO.67）
[0100] R1:5'-AGCACAGTGATGTGTTG -3' （SEQ ID NO.68）
[0101] F2:5'-GGCTGGTCTTGAACTCA -3' （SEQ ID NO.69）
[0102] R2:5'-TGGCTCACATCTGTAATC -3' （SEQ ID NO.70）
[0103] P1:5'FAM-TGGTACAGCCTGTTGCTCCT-3'MGB （SEQ ID NO.71）
[0104] P2:5'VIC-CCACCTGCCTCAGCCTCC-3'MGB （SEQ ID NO.72）；
[0105] （13）检测KI67基因的引物序列为：SEQ ID NO.73和SEQ ID NO.74和SEQ ID NO.75和SEQ ID NO.76，检测KI67基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.77和SEQ ID NO.78；具体序列如下：
[0106] KI67：
[0107] F1:5'-CTCTGTACCTACCATCTCC -3' （SEQ ID NO.73）
[0108] R1:5'-CAGGAGGGAAAGTTCCA -3' （SEQ ID NO.74）
[0109] F2:5'-GGGAAAGTAGGTGTGAAAGA -3' （SEQ ID NO.75）
[0110] R2:5'-CCATCTCCTGCTGTCTC -3' （SEQ ID NO.76）
[0111] P1:5'FAM-AGGCACCTCCAACCACCACA-3'MGB （SEQ ID NO.77）
[0112] P2:5'VIC-ACCAGTCGGCAAGCTCACAC-3'MGB （SEQ ID NO.78）；
[0113] （14）检测STK15基因的引物序列为：SEQ ID NO.79和SEQ ID NO.80和SEQ ID NO.81和SEQ ID NO.82，检测STK15基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.83和SEQ ID NO.84；具体序列如下：
[0114] STK15：
[0115] F1:5'-ACAGGAGGCAAATCC -3' （SEQ ID NO.79）
[0116] R1:5'-CAGGTACTAGGAAGGTTATTG -3' （SEQ ID NO.80）
[0117] F2:5'-GGGTGGTCAGTACATGA -3' （SEQ ID NO.81）
[0118] R2:5'-CATCCGACCTTCAATCA -3' （SEQ ID NO.82）
[0119] P1:5'FAM-TGACCACTCTGCCCTGACCC-3'MGB （SEQ ID NO.83）
[0120] P2:5'VIC-TCCATCTTCCAGGAGGACCA-3'MGB （SEQ ID NO.84）；
[0121] （15）检测CCNB1基因的引物序列为：SEQ ID NO.85和SEQ ID NO.86和SEQ ID NO.87和SEQ ID NO.88，检测CCNB1基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.89和SEQ ID NO.90；具体序列如下：
[0122] CCNB1：
[0123] F1:5'-CTGTCAAGAACAAGTATGC -3' （SEQ ID NO.85）
[0124] R1:5'-CACAGCCTTGGCTAAA -3' （SEQ ID NO.86）
[0125] F2:5'-ATCGGTTCATGCAGAATAATTGA -3' （SEQ ID NO.87）
[0126] R2:5'-GGAGGGTACATTTCTTCATATTTG -3' （SEQ ID NO.88）
[0127] P1:5'FAM-AAGATCAGCACTCTACCACAGC-3'MGB （SEQ ID NO.89）
[0128] P2:5'VIC-TGGCAGTGACACCAACCAGC-3'MGB （SEQ ID NO.90）；
[0129] （16）检测MYBL2基因的引物序列为：SEQ ID NO.91和SEQ ID NO.92和SEQ ID NO.93和SEQ ID NO.94，检测MYBL2基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.95和SEQ ID NO.96；具体序列如下：
[0130] MYBL2：
[0131] F1:5'-CAGACTCTCAGGTGGA -3' （SEQ ID NO.91）
[0132] R1:5'-GACCTGGAAGTGGAAC -3' （SEQ ID NO.92）
[0133] F2:5'-GCCCTCTGTGCTCAAGA -3' （SEQ ID NO.93）
[0134] R2:5'-CAGACTGGTGCTATTCTCA -3' （SEQ ID NO.94）
[0135] P1:5'FAM-AGCACCAGGAGCCGCC-3'MGB （SEQ ID NO.95）
[0136] P2:5'VIC-CACACGCCTCTTCCTCTGCC-3'MGB （SEQ ID NO.96）；
[0137] （17)检测Survivin基因的引物序列为：SEQ ID NO.97和SEQ ID NO.98和SEQ ID NO.99和SEQ ID NO.100，检测Survivin基因的TaqMan探针序列为SEQ ID NO.101和SEQ ID NO.102；具体序列如下：
[0138] Survivin：
[0139] F1:5'-GCCATCCTTAAAACCAGA -3' （SEQ ID NO.97）
[0140] R1:5'-CGGTTGCACTTAGACAA -3' （SEQ ID NO.98）
[0141] F2:5'-CCTTCACATCTGTCACGA -3' （SEQ ID NO.99）
[0142] R2:5'-GCTGCCTCCAAAGAAAG -3' （SEQ ID NO.100）
[0143] P1:5'FAM-CCTCATGGCTACCAGCACCT-3'MGB （SEQ ID NO.101）
[0144] P2:5'VIC-ACGCAGTCCGCCCAGGT-3'MGB （SEQ ID NO.102）；
[0145] （18）检测ESR1基因的引物序列为：SEQ ID NO.103和SEQ ID NO.104和SEQ ID NO.105和SEQ ID NO.106，检测ESR1基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.107和SEQ ID NO.108；具体序列如下：
[0146] ESR1：
[0147] F1:5'-GCACCCTAGAAACAACATA -3' （SEQ ID NO.103）
[0148] R1:5'-GTCTCTATAACCAATGACCTC -3' （SEQ ID NO.104）
[0149] F2:5'-CTGGTGATTGTCAATTCATTCA -3' （SEQ ID NO.105）
[0150] R2:5'-GCAGTGTATCAAGTTAAAATAGTC -3' （SEQ ID NO.106）
[0151] P1:5'FAM-AGGTGCCTGAGACACAGACC-3'MGB （SEQ ID NO.107）
[0152] P2:5'VIC-TCTGCCTTCCCTGTGTGCCC-3'MGB （SEQ ID NO.108）；
[0153] （19）检测PGR基因的引物序列为：SEQ ID NO.109和SEQ ID NO.110和SEQ ID NO.111和SEQ ID NO.112，检测PGR基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.113和SEQ ID NO.114；具体序列如下：
[0154] PGR：
[0155] F1:5'-TGCCAAGAAGGTGAAAC -3' （SEQ ID NO.109）
[0156] R1:5'-ACAGCTTTGCATTGTCA -3' （SEQ ID NO.110）
[0157] F2:5'-CATGGAATGTCAACCTGTAA -3' （SEQ ID NO.111）
[0158] R2:5'-GCACAGTCCTATGTCAG -3' （SEQ ID NO.112）
[0159] P1:5'FAM-CCATCACTGCCAGGGACCCA-3'MGB （SEQ ID NO.113）
[0160] P2:5'VIC-CTCCACAGTGCCCATCATCA-3'MGB （SEQ ID NO.114）；
[0161] （20）检测BCL2基因的引物序列为：SEQ ID NO.115和SEQ ID NO.116和SEQ ID NO.117和SEQ ID NO.118，检测BCL2基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.119和SEQ ID NO.120；具体序列如下：
[0162] BCL2：
[0163] F1:5'-GGGTATGAAGGACCTGTA -3' （SEQ ID NO.115）
[0164] R1:5'- GTCGTACCACAAACTTCAAA-3' （SEQ ID NO.116）
[0165] F2:5'-GTGAGGAGAGGCAATGA -3' （SEQ ID NO.117）
[0166] R2:5'-CCTTGCTTTAAACTCACAG -3' （SEQ ID NO.118）
[0167] P1:5'FAM-TGCCTCTGCGAAGAACCTTG-3'MGB （SEQ ID NO.119）
[0168] P2:5'VIC-CAGCCAACGTGCCATGTGC-3'MGB （SEQ ID NO.120）；
[0169] 和（21)检测SCUBE2基因的引物序列为：SEQ ID NO.121和SEQ ID NO.122和SEQ ID NO.123和SEQ ID NO.124，检测SCUBE2基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.125和SEQ ID NO.126；具体序列如下：
[0170] SCUBE2：
[0171] F1:5'-CCCAGTCTCAAATGTGA -3' （SEQ ID NO.121）
[0172] R1:5'-GCTGTTACTGTTAGAGAATGA -3' （SEQ ID NO.122）
[0173] F2:5'-GTGTCAACCTGGTGAATAA -3' （SEQ ID NO.123）
[0174] R2:5'-GGGAAGCAGGAAGTTC -3' （SEQ ID NO.124）
[0175] P1:5'FAM-TCCGTGGACATGAGCAGCC-3'MGB （SEQ ID NO.125）
[0176] P2:5'VIC-ACCTTGCCAGCTCTGTGCC-3'MGB （SEQ ID NO.126）；
[0177] 所述21基因的引物和探针各有2组，这两组引物和探针序列是在每个基因mRNA序列的不同区域设计的。
[0178] 所述TaqMan探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有淬灭基团。同一基因的两条探针的报告基团必须是不同的，淬灭基团可相同可不同。
[0179] 优选的，所述荧光报告基团包括FAM、VIC、TET、JOE和HEX；所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、TAMRA和MGB。
[0180] 优选的，对应检测同一种基因的两组引物组和探针按比例混合形成引物探针预混液，所述试剂盒包括分别对应乳腺癌21个基因的21种引物探针预混液。
[0181] 优选的，对应检测同一种基因的引物组的浓度稀释到50-900nM，探针浓度稀释到50-500nM后混合形成引物探针预混液。
[0182] 优选的，所述21种引物探针预混液分别装在21个QPCR反应管中。
[0183] 优选的，所述试剂盒中包括2× Master Mix溶液；所述2× Master Mix溶液包括10-100mM Tris-Hcl、10-50 mM Kcl、 1-10 mM (NH4)2SO4、1.5-6.0mM Mgcl2、0.2-0.5mM dNTP、0.05-0.2U HotStart TaqDNA聚合酶、10-20%甘油和余量的ddH2O。
[0184] 第二方面，本发明涉及一种乳腺癌21基因检测试剂盒的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
[0185] S1、将 2×Master Mix、待测样本的cDNA和ddH2O混匀后，取出分别加入到21种引物探针预混液中进行荧光定量PCR反应；
[0186] S2、通过荧光定量PCR扩增后获得的CT值来计算乳腺癌的复发评分RS值；RS复发风险评分范围为0-100分，其中低风险为0
[0187] 优选的，在步骤S1中，所述待测样本的cDNA是通过包括如下步骤的方法制备而得：提取乳腺癌石蜡标本的RNA，将提取得到的RNA反转录成cDNA。
[0188] 优选的，在步骤S1中，所述荧光定量PCR反应的反应条件均为：95℃预变性10min；95℃变性15秒，60℃退火30秒，45-50个循环。
[0189] 本发明的试剂盒和检测方法可用于乳腺癌21基因检测，由基因表达量计算来获得乳腺癌的复发评分（RS），通过RS值评估个体化的治疗效果和预测10年乳腺癌复发的风险以及接受化疗的效益比。RS复发风险评分范围为0-100分，其中低风险为0
[0190] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0191] 1.本试剂盒采用的是TaqMan探针法，TaqMan法的定量PCR体系中包含了引物和特异性探针，探针法与SYBR Green法相比PCR反应更特异更灵敏，获得的数据更准确。本试剂盒采用的是MGB探针，其淬灭基团采用的是非荧光淬灭基团，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号强度；同时探针上连接有MGB修饰基团，将探针Tm值提高10℃左右，因此比普通探针设计得更短；MGB探针与模板单碱基不匹配即可抑制两者结合。
[0192] 2.由于石蜡包埋样本的RNA大部分是降解的，所以本试剂盒中21个基因各设计了两对引物和2条特异性探针，这两对引物和探针分别是在每个基因mRNA序列的3’端和中间片段上设计的，且片段大小都小于100bp，这就提高了降解RNA反转录后QPCR的扩增效率；
[0193] 3.本试剂盒中每个基因的两组引物和两条探针混合液放在一个反应管中，在QPCR扩增过程中只需使用一种缓冲液，这就简化了实验操作；在扩增结束后每个基因都能在QPCR上看到两条扩增曲线，然后选用扩增效率高的那条扩增曲线，得到清晰精确的CT值，使计算结果更精确可信；
[0194] 4.本试剂盒所涉及的引物和探针，其退火温度都在60℃左右，这就可以使21种基因使用同一程序进行扩增；同时TaqMan法与SYBR Green法相比，不需要添加溶解曲线，在二步法反应后就能直接观察到PCR结果，这两者都大大节省了检测的时间；
[0195] 5.本试剂盒适用广泛，对于科研和临床检测都适用，单样品或多样品，都能使用本试剂盒，检测结果快速准确。
附图说明
[0196] 图1：检测样品A、B的RNA电泳图；
[0197] 图2：检测样品A的21种基因QPCR扩增曲线图；
[0198] 图3：检测样品A的各基因的两组CT值及计算得出的RS值；
[0199] 图4：检测样品B的21种基因QPCR扩增曲线图；
[0200] 图5：检测样品B的各基因的两组CT值及计算得出的RS值；
具体实施方式
[0201] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。实施例
[0202] 、石蜡样本RNA的提取
[0203] 将乳腺癌样本的RNA提取后，得到待测样本A；
[0204] 1）将乳腺癌样本放入1.5ml离心管；
[0205] 2）加入240ml PKD Buffer，振荡混匀，11000g离心1min；
[0206] 3）加入10ul蛋白酶K，移液枪温和吸打混匀；
[0207] 4）孵育56℃ 15min，再80℃ 15min；
[0208] 5）冰上孵育3min，20000g离心15min；
[0209] 6）将上层液体转移至新的1.5ml离心管；
[0210] 7）加入DNase Booster Buffer 25ul(约离心管内液体的1/10),以及10ul DNase I stock solution上下颠倒混匀，短暂离心将管壁上的液体混入底部；
[0211] 8）室温孵育15min；
[0212] 9）加入500ul Buffer RBC 调整结合环境，混匀；
[0213] 10）加入1200ul无水乙醇，移液枪吸打混匀；
[0214] 11）吸取700ul样品上柱，≥8000g离心15s，弃废液；
[0215] 12）重复上一步；
[0216] 13）加入500ul RPE Buffer上柱，≥8000g离心15s，弃收集管废液；
[0217] 14）重复上一步，注意废液不要接触柱底；
[0218] 15）将柱子换入新的收集管内，开盖离心5min，弃废液；
[0219] 16）将柱子换入1.5ml离心管，加入14～30ul RNase-FNee Water，11000g离心1min，为提高洗脱率，可重复该步骤，将已洗脱的液体再次上柱。
[0220] 17）将洗脱好的待测样本A的RNA通过电泳进行检测（电泳图结果见图1a），经检测待测样本A的RNA完整，未降解；
[0221] 18）将待测样本A的RNA取出一半，用RNA酶进行处理一段时间，纯化后标记为待测样品B通过电泳进行检测（电泳图结果见图1b），经检测待测样本B的RNA是降解的。
[0222] 将提取的RNA反转录成cDNA
[0223]
[0224] 3. 2× Master Mix、引物探针预混液的配制
[0225] 根据21个基因的mRNA序列设计其引物和探针序列，目的片段都小于100bp，具体序列如下：
[0226] ACTB： F1:5'-CCAACTTGAGATGTATGAAG -3' （SEQ ID NO.1）
[0227] R1:5'-GTCAGTGTACAGGTAAGC -3' （SEQ ID NO.2）
[0228] F2:5'-TGGAGAAGAGCTACGA -3' （SEQ ID NO.3）
[0229] R2:5'-GAAGGAAGGCTGGAAG -3' （SEQ ID NO.4）
[0230] P1:5'FAM-CTGCCTCCACCCACTCCC-3'MGB （SEQ ID NO.5）
[0231] P2:5'VIC-CGGAACCGCTCATTGCCA-3'MGB （SEQ ID NO.6）
[0232] GAPDH：F1:5'-GCCTCCAAGGAGTAAGA -3' （SEQ ID NO.7）
[0233] R1:5'-GCAGTGAGGGTCTCTC -3' （SEQ ID NO.8）
[0234] F2:5'-CCATGACAACTTTGGTATCA -3' （SEQ ID NO.9）
[0235] R2:5'-GCCATCCACAGTCTTCA -3' （SEQ ID NO.10）
[0236] P1:5'FAM-TCCTCTTGTGCTCTTGCTGG-3'MGB （SEQ ID NO.11）
[0237] P2:5'VIC-AGTCCATGCCATCACTGCCA-3'MGB （SEQ ID NO.12）
[0238] RPLPO： F1:5'--GGTTGAAGCCAAGGAAGA -3' （SEQ ID NO.13）
[0239] R1:5'-TGGTGATTAGTCAAAGAGACC -3' （SEQ ID NO.14）
[0240] F2:5'-GGGCACCATTGAAATCCA -3' （SEQ ID NO.15）
[0241] R2:5'-GGAGATGTTGAGCATGTTCA -3' （SEQ ID NO.16）
[0242] P1:5'FAM-ATCCTCGTCCGACTCCTCCGMGB-3' （SEQ ID NO.17）
[0243] P2:5'VIC-CGTGGCTTCGCTGGCTCC-3'MGB （SEQ ID NO.18）
[0244] GUS： F1:5'-CCACAGCAGCAGAACA-3' （SEQ ID NO.19）
[0245] R1:5'- CTGCTAGAATAGATGACCACAA-3' （SEQ ID NO.20）
[0246] F2:5'-GGTGTCAACAAGCATGAGA -3' （SEQ ID NO.21）
[0247] R2:5'-CAGCGAAGCAGGTTGAA -3' （SEQ ID NO.22）
[0248] P1:5'FAM-CCTCCTGGACTGTTCACGGC-3'MGB （SEQ ID NO.23）
[0249] P2:5'VIC-TCCTTCACCAGCAGCGGC-3'MGB （SEQ ID NO.24）
[0250] TFRC：F1:5'-GGACTGACATTTAGCGTAG -3' （SEQ ID NO.25）
[0251] R1:5'-GCCACATGCTTTCATTTAAG -3' （SEQ ID NO.26）
[0252] F2:5'-GAGAGGATTCCTGAGTTGAA -3' （SEQ ID NO.27）
[0253] R2:5'-TCCAGGTTCAATTCAACATCA -3' （SEQ ID NO.28）
[0254] P1:5'FAM-TGCGTAACACCCGAACCAGG-3'MGB （SEQ ID NO.29）
[0255] P2:5'VIC-CACGAACTGACCAGCGACCT-3'MGB （SEQ ID NO.30）
[0256] CD68： F1:5'-GGCAGAACTGCTTGAA -3' （SEQ ID NO.31）
[0257] R1:5'-GCGATCTTGGCTTAGTG -3' （SEQ ID NO.32）
[0258] F2:5'-ACCTGCTTCTCTCATTCCA -3' （SEQ ID NO.33）
[0259] R2:5'-CTCCACCGCCATGTAGA -3' （SEQ ID NO.34）
[0260] P1:5'FAM-CGGCTCACTGCAACCTCCA-3'MGB （SEQ ID NO.35）
[0261] P2:5'VIC-CCTTCTGCTGGAGGTCCTGC-3'MGB （SEQ ID NO.36）
[0262] BAG1：F1:5'-GCTACTACCTCTGCTTGA -3' （SEQ ID NO.37）
[0263] R1:5'-GTGAGTTGAATTCTGAAGGA -3' （SEQ ID NO.38）
[0264] F2:5'-CCACAGGCCATGAGATAA -3' （SEQ ID NO.39）
[0265] R2:5'-GGTTCTAACCTTCTGAAGACA -3' （SEQ ID NO.40）
[0266] P1:5'FAM-TCCTCACCTTCCTTCCTCCA-3'MGB （SEQ ID NO.41）
[0267] P2:5'VIC-CCGTTCCTTGGATGGAGCCT-3'MGB （SEQ ID NO.42）
[0268] GSTM1：F1:5'-CCCATCATTACCCTTCC -3' （SEQ ID NO.43）
[0269] R1:5'-GCCCTTTAAAGCAGACA -3' （SEQ ID NO.44）
[0270] F2:5'-GAGGGCTTGGAGAAGAA -3' （SEQ ID NO.45）
[0271] R2:5'-GACAGCCATCTTTGAGAAA -3' （SEQ ID NO.46）
[0272] P1:5'FAM-AGCCAGCCTGACCTTCCTTC-3'MGB （SEQ ID NO.47）
[0273] P2:5'VIC-AGTCCAGCCGCTTCCTCC-3'MGB （SEQ ID NO.48）
[0274] HER2： F1:5'-CTCCGACCACTTCCAG -3' （SEQ ID NO.49）
[0275] R1:5'-CCCTTCCAGCCATCTG -3' （SEQ ID NO.50）
[0276] F2:5'-GGTGGTTGGCATTCTGA -3' （SEQ ID NO.51）
[0277] R2:5'-CCGCATCGTGTACTTC -3' （SEQ ID NO.52）
[0278] P1:5'FAM-CTGCCATGCCAGGAACCTGT-3'MGB （SEQ ID NO.53）
[0279] P2:5'VIC-TTCTGCTGCCGTCGCTTGA-3'MGB （SEQ ID NO.54）
[0280] GRB7： F1:5'-CCTCCCTCAGATAGAA -3' （SEQ ID NO.55）
[0281] R1:5'-GCTAGGAGAAGGAGAG -3' （SEQ ID NO.56）
[0282] F2:5'-GGCTTCGGATCTTCTGA -3' （SEQ ID NO.57）
[0283] R2:5'-CCGTACTTGAAGAGGC -3' （SEQ ID NO.58）
[0284] P1:5'FAM-CCACTCCAGTCCACTCCTGA-3'MGB （SEQ ID NO.59）
[0285] P2:5'VIC-AGATGAGCAGAGCCGCACC-3'MGB （SEQ ID NO.60）
[0286] MMP11： F1:5'-AGGTCAGGTCTTGGTA -3' （SEQ ID NO.61）
[0287] R1:5'-CTGGATTCTGGAGAACA -3' （SEQ ID NO.62）
[0288] F2:5'--CCAGATGCCTGTGAGGA -3' （SEQ ID NO.63）
[0289] R2:5'-AGCCCGCTTTGAAGAA -3' （SEQ ID NO.64）
[0290] P1:5'FAM TTCTGGCTGACAATCCTGGA-3'MGB （SEQ ID NO.65）
[0291] P2:5'VIC-TCCACCATCCGAGGCGAGC-3'MGB （SEQ ID NO.66）
[0292] CTSL2： F1:5'-CCTAGATGGTATAGCCTATTAC -3' （SEQ ID NO.67）
[0293] R1:5'-AGCACAGTGATGTGTTG -3' （SEQ ID NO.68）
[0294] F2:5'-GGCTGGTCTTGAACTCA -3' （SEQ ID NO.69）
[0295] R2:5'-TGGCTCACATCTGTAATC -3' （SEQ ID NO.70）
[0296] P1:5'FAM-TGGTACAGCCTGTTGCTCCT-3'MGB （SEQ ID NO.71）
[0297] P2:5'VIC-CCACCTGCCTCAGCCTCC-3'MGB （SEQ ID NO.72）
[0298] KI67：F1:5'-CTCTGTACCTACCATCTCC -3' （SEQ ID NO.73）
[0299] R1:5'-CAGGAGGGAAAGTTCCA -3' （SEQ ID NO.74）
[0300] F2:5'-GGGAAAGTAGGTGTGAAAGA -3' （SEQ ID NO.75）
[0301] R2:5'-CCATCTCCTGCTGTCTC -3' （SEQ ID NO.76）
[0302] P1:5'FAM-AGGCACCTCCAACCACCACA-3'MGB （SEQ ID NO.77）
[0303] P2:5'VIC-ACCAGTCGGCAAGCTCACAC-3'MGB （SEQ ID NO.78）
[0304] STK15：F1:5'-ACAGGAGGCAAATCC -3' （SEQ ID NO.79）
[0305] R1:5'-CAGGTACTAGGAAGGTTATTG -3' （SEQ ID NO.80）
[0306] F2:5'-GGGTGGTCAGTACATGA -3' （SEQ ID NO.81）
[0307] R2:5'-CATCCGACCTTCAATCA -3' （SEQ ID NO.82）
[0308] P1:5'FAM-TGACCACTCTGCCCTGACCC-3'MGB （SEQ ID NO.83）
[0309] P2:5'VIC-TCCATCTTCCAGGAGGACCA-3'MGB （SEQ ID NO.84）
[0310] CCNB1： F1:5'-CTGTCAAGAACAAGTATGC -3' （SEQ ID NO.85）
[0311] R1:5'-CACAGCCTTGGCTAAA -3' （SEQ ID NO.86）
[0312] F2:5'-ATCGGTTCATGCAGAATAATTGA -3' （SEQ ID NO.87）
[0313] R2:5'-GGAGGGTACATTTCTTCATATTTG -3' （SEQ ID NO.88）
[0314] P1:5'FAM-AAGATCAGCACTCTACCACAGC-3'MGB （SEQ ID NO.89）
[0315] P2:5'VIC-TGGCAGTGACACCAACCAGC-3'MGB （SEQ ID NO.90）
[0316] MYBL2：F1:5'-CAGACTCTCAGGTGGA -3' （SEQ ID NO.91）
[0317] R1:5'-GACCTGGAAGTGGAAC -3' （SEQ ID NO.92）
[0318] F2:5'-GCCCTCTGTGCTCAAGA -3' （SEQ ID NO.93）
[0319] R2:5'-CAGACTGGTGCTATTCTCA -3' （SEQ ID NO.94）
[0320] P1:5'FAM-AGCACCAGGAGCCGCC-3'MGB （SEQ ID NO.95）
[0321] P2:5'VIC-CACACGCCTCTTCCTCTGCC-3'MGB （SEQ ID NO.96）
[0322] Survivin：F1:5'-GCCATCCTTAAAACCAGA -3' （SEQ ID NO.97）
[0323] R1:5'-CGGTTGCACTTAGACAA -3' （SEQ ID NO.98）
[0324] F2:5'-CCTTCACATCTGTCACGA -3' （SEQ ID NO.99）
[0325] R2:5'-GCTGCCTCCAAAGAAAG -3' （SEQ ID NO.100）
[0326] P1:5'FAM-CCTCATGGCTACCAGCACCT-3'MGB （SEQ ID NO.101）
[0327] P2:5'VIC-ACGCAGTCCGCCCAGGT-3'MGB （SEQ ID NO.102）
[0328] ESR1：F1:5'-GCACCCTAGAAACAACATA -3' （SEQ ID NO.103）
[0329] R1:5'-GTCTCTATAACCAATGACCTC -3' （SEQ ID NO.104）
[0330] F2:5'-CTGGTGATTGTCAATTCATTCA -3' （SEQ ID NO.105）
[0331] R2:5'-GCAGTGTATCAAGTTAAAATAGTC -3' （SEQ ID NO.106）
[0332] P1:5'FAM-AGGTGCCTGAGACACAGACC-3'MGB （SEQ ID NO.107）
[0333] P2:5'VIC-TCTGCCTTCCCTGTGTGCCC-3'MGB （SEQ ID NO.108）
[0334] PGR： F1:5'-TGCCAAGAAGGTGAAAC -3' （SEQ ID NO.109）
[0335] R1:5'-ACAGCTTTGCATTGTCA -3' （SEQ ID NO.110）
[0336] F2:5'-CATGGAATGTCAACCTGTAA -3' （SEQ ID NO.111）
[0337] R2:5'-GCACAGTCCTATGTCAG -3' （SEQ ID NO.112）
[0338] P1:5'FAM-CCATCACTGCCAGGGACCCA-3'MGB （SEQ ID NO.113）
[0339] P2:5'VIC-CTCCACAGTGCCCATCATCA-3'MGB （SEQ ID NO.114）
[0340] BCL2：F1:5'-GGGTATGAAGGACCTGTA -3' （SEQ ID NO.115）
[0341] R1:5'- GTCGTACCACAAACTTCAAA-3' （SEQ ID NO.116）
[0342] F2:5'-GTGAGGAGAGGCAATGA -3' （SEQ ID NO.117）
[0343] R2:5'-CCTTGCTTTAAACTCACAG -3' （SEQ ID NO.118）
[0344] P1:5'FAM-TGCCTCTGCGAAGAACCTTG-3'MGB （SEQ ID NO.119）
[0345] P2:5'VIC-CAGCCAACGTGCCATGTGC-3'MGB （SEQ ID NO.120）
[0346] SCUBE2：F1:5'-CCCAGTCTCAAATGTGA -3' （SEQ ID NO.121）
[0347] R1:5'-GCTGTTACTGTTAGAGAATGA -3' （SEQ ID NO.122）
[0348] F2:5'-GTGTCAACCTGGTGAATAA -3' （SEQ ID NO.123）
[0349] R2:5'-GGGAAGCAGGAAGTTC -3' （SEQ ID NO.124）
[0350] P1:5'FAM-TCCGTGGACATGAGCAGCC-3'MGB （SEQ ID NO.125）
[0351] P2:5'VIC-ACCTTGCCAGCTCTGTGCC-3'MGB （SEQ ID NO.126）
[0352] 2）试剂的配制
[0353] a. 2×Master Mix的配制
[0354]2×Master Mix组分 浓度范围
Tris-Hcl（pH8.0-pH9.0） 10-100mM
Kcl 10-50 mM
(NH4)2SO4 1-10 mM
Mgcl2 1.5-6.0mM
dNTP 0.2-0.5mM
HotStart TaqDNA聚合酶 0.05-0.2U
甘油 10-20%
ddH2O 适量
[0355] b. 将42对引物的浓度稀释到50-900nM；
[0356] c. 将42条探针浓度稀释到50-500nM；
[0357] d. 引物探针预混液配制；
[0358] 将21个基因中每个基因的两对引物和两条探针分别按照一定比例（F：R：P=3：3：2）进行混合，混匀后取出2 μl加入到21个QPCR反应管的底部，盖上盖子，离心后放入铝箔塑封袋，待用时取出即可，其他的放在-20℃保存。
[0359] 反应液的配制
[0360] 反应体系(10μL)
[0361]
[0362] 4.1 将2× Master Mix和引物探针预混液直接从试剂盒中取出，并离心；
[0363] 4.2 取出反转录后的待测样本cDNA；
[0364] 4.3 计算需要检测的反应数，按反应体系取出相应量的2× Master Mix、ddH2O和待测样本cDNA，然后将其充分混匀，离心，每个反应管分装8μl；
[0365] 4.4将反应管的盖子盖上，一定要将盖子盖紧（防止PCR过程中蒸发），然后离心数秒；
[0366] 4.5打开荧光定量PCR仪，将加好的反应管放置到荧光定量PCR仪上。
[0367] 扩增程序
[0368] 95℃ 10min
[0369]
[0370] 6.QPCR 检测结果
[0371] 通过荧光定量PCR扩增后获得的扩增曲线和所得的CT值来计算RS值。
[0372] 1.待测样本A的检测（如图2、图3）：
[0373] 如图所示，待测样本A的21个基因的两组引物和探针都有扩增曲线和CT值，且2次重复CT值相近。每个基因都有2组数据，其中CT值小的归为TEST1，CT值大一些的归为TEST2。经计算TEST1的RS值为24.431，18≤RS<31，属于中度风险，TEST2的RS值为24.436，18≤RS<
31，属于中度风险。由于该样本的RNA完整，未降解，所以两组数据的RS值差别不大，基本一致。
[0374] 2.待测样本B的检测（如图4、图5）：
[0375] 如图所示，待测样本B的21个基因的两组引物和探针都有扩增曲线和CT值，且2次重复CT值相近。每个基因都有2组数据，其中CT值小的归为TEST1，CT值大一些的归为TEST2。经计算TEST1的RS值为24.431，18≤RS<31，属于中度风险，与待测样本A的检测结果一致；
TEST2的RS值为33.45，RS>31，属于高风险，与待测样本A的检测结果不一致，这是因为该样本的RNA已经降解，所以两组数据计算的RS值相差较大。由此可知，本试剂盒非常适用于降解RNA。
[0376] 以上实施例的先后顺序仅为便于描述，不代表实施例的优劣。
[0377] 最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
