一种比率荧光传感器的构建方法及应用

摘要

本发明公开了一种比率荧光传感器的构建方法，本发明采用乙二胺四乙酸铜二钠盐及抗坏血酸为合成掺杂碳量子点的碳源及掺杂铜离子，通过一步热分解法合成铜掺杂荧光碳量子点作为Fe()及色胺酸的荧光探针，构建了比率荧光传感器，其具有两个发射中心分别位于396nm和617nm处；在617nm波长处，Fe()选择性有荧光增敏作用，在396nm波长处，色胺酸选择性有荧光增敏作用，两个波长处荧光强度的比值与分析物浓度成线性关系，从而建立了Fe()及色氨酸的比率荧光探针；方法建立内标,使其具有自我调节功能,极大地削弱诸如探针浓度、温度、极性、环境的pH值、稳定性等众多可变或难以定量的因素的干扰，具有强的特异性及高的灵敏度。

权利要求

1.一种比率荧光传感器的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：

（1）称取乙二胺四乙酸铜二钠盐1.6-2.0g和0.1-0.3g抗坏血酸，混匀后，放置于管式炉中，管式炉温度由室温经过120-130min升至300℃，再经过10-15min升至350℃，350℃保温煅烧120min后，自然冷却至室温，取出固体加去离子水100-150mL，超声20-30min，离心，取出上清液，经0.22μm滤膜过滤，即得荧光探针试剂；

 （2）将步骤（1）合成的荧光探针试剂用水稀释，在300到700nm进行扫描，确定荧光探针的最大激发波长在308nm，最大发射波长分别在396nm及617nm处，且在617nm波长处，Fe()选择性有荧光增敏作用，在396nm波长处，色胺酸选择性有荧光增敏作用，荧光探针试剂即为比率荧光传感器。

2.根据权利要求书1所述的比率荧光传感器的构建方法，其特征在于：离心是在8000-

10000rpm下进行15-20min。

3.权利要求1所述的比率荧光传感器的构建方法制得的比率荧光传感器在作为Fe( )及色氨酸含量测定的比率荧光探针中的应用，其特征在于，具体步骤如下：（1）比率探针对Fe( )的荧光响应：在浓度0.1-50μmol/L 的Fe( )溶液中，加入过滤后的荧光探针试剂，在308nm波长的光照激发下,获得617nm和396nm波长处荧光强度的比值I617/I396与Fe( )浓度的线性关系，用于定量检测Fe( )的浓度；

（2）比率探针对色氨酸的荧光响应：在浓度0.5-250μmol/L的色氨酸溶液中，加入过滤后的荧光探针试剂，在308nm波长的光照激发下,获得 396nm和617nm波长处荧光强度的比值I396/I617与色氨酸浓度的线性关系，用于定量检测色氨酸的浓度；

（3）在待测样品中加入加入过滤后的荧光探针试剂，在308nm波长的光照激发下,测量待测样品的Fe( )及色氨酸相应比率荧光，并代入步骤（1）、步骤（2）的线性关系中，获得待测样品的Fe( )及色氨酸浓度。

说明书

一种比率荧光传感器的构建方法及应用

技术领域

[0001] 本发明属于化学分析检测技术领域，具体为一种新型比率荧光传感器的构建方法及应用。

背景技术

[0002] 荧光传感器因其设计简单，合成方便，成本低，能够快速地、选择灵敏性检测目标测分析物，而被广泛地应用在生命科学、材料科学、环境检测、生化传感、生物成像、免疫分析、医学诊断等众多研究领域。在荧光传感模式中,比率型荧光传感器利用两个或多个发射峰强度的比值变化带来输出颜色的改变,可以实现对目标分析物的特异、准确检测。与单一发射的荧光传感器相比,比率传感器通过建立内标，极大削弱了探针浓度、温度、溶剂极性、激发强度、环境的pH值等众多难以控制因素的干扰,使得结果更加精准,响应范围更宽。

[0003] 碳量子点，如同石墨烯量子点，是一类碳的新型碳材料。它具有优异的光学性能，可调的激发和发射行为，较高的荧光稳定性，较低的毒性和良好的生物相容性，在越来越多的领域中得到了广泛的应用。通过掺杂改善碳量子点的光学性能，已得到证实。金属掺杂于碳材料中，不仅保留了碳量子点的荧光特性，还由于金属半导体的引入，产生了新的发射波长，同时，荧光强度也显著增强。目前，用于碳量子点掺杂产生双波长发射的材料,仅有稀有金属，如金、银，而用铜掺杂于碳量子点产生双波长发射，未见报道，更未见将同一材料用于两种荧光探针的报道。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种比率荧光传感器的构建方法，及比率荧光传感器用作高灵敏、高选择性的Fe( ) 及色氨酸测定的比率荧光探针。

[0005] 本发明比率荧光传感器的构建包括以下步骤：

[0006] （1）称取乙二胺四乙酸铜二钠盐1.6-2.0g和0.1-0.3g抗坏血酸，混匀后，放置于管式炉中，管式炉温度由室温经过120-130min升至300℃，再经过10-15min升至350℃，350℃保温煅烧120min后，自然冷却至室温，取出固体加去离子水100-150mL，超声20-30min，离心，取出上清液，经0.22μm滤膜过滤，即得荧光探针试剂；

[0007]  （2）将步骤（1）合成的荧光探针试剂用水稀释，在300到700nm进行扫描，确定荧光探针的最大激发波长在308nm，最大发射波长分别在396nm及617nm处，且在617nm波长处，Fe( )选择性有荧光增敏作用，在396nm波长处，色胺酸选择性有荧光增敏作用，荧光探针试剂即为比率荧光传感器。

[0008] 所述离心是在8000-10000rpm下进行15-20min。

[0009] 本发明另一目的是将上述方法制得的比率荧光传感器应用在作为Fe( )及色氨酸含量测定的比率荧光探针中，具体步骤如下：

[0010] （1）比率探针对Fe( )的荧光响应：在浓度0.1-50μmol/L 的Fe( )溶液中，加入荧光探针试剂，在308nm波长的光照激发下,获得617nm和396nm波长处荧光强度的比值I617/I396与Fe( )浓度的线性关系，用于定量检测Fe( )的浓度；

[0011] （2）比率探针对色氨酸的荧光响应：在浓度0.5-250μmol/L的色氨酸溶液中，加入荧光探针试剂，在308nm波长的光照激发下,获得 396nm和617nm波长处荧光强度的比值I396/I617与色氨酸浓度的线性关系，用于定量检测色氨酸的浓度；

[0012] （3）在待测样品中加入荧光探针试剂，在308nm波长的光照激发下,测量待测样品的Fe( )及色氨酸相应比率荧光，并代入步骤（1）、步骤（2）的线性关系中，获得待测样品的Fe( )及色氨酸浓度。

[0013] 步骤（1）荧光探针试剂用量为50-200 μL。

[0014] 步骤（2）荧光探针试剂用量为100-300 μL。

[0015] 本发明的优点在于：

[0016] 1、本发明采用一步热分解法合成铜掺杂荧光碳量子点，作为Fe( )及色氨酸的荧光探针，构建了比率荧光传感器,方法新颖，特异性强，灵敏度高；

[0017] 2、Fe( )及色氨酸选择性在两个发射波长处分别有荧光增敏作用，在两个波长处荧光强度的比值与分析物浓度成线性关系，Fe( )检测限可以达到0.01μM，其他金属离子没有干扰，色氨酸检测限可以达到0.05μM，其他氨基酸没有干扰，方法具有较好的特异性；

[0018] 3、本方法建立内标，具有自我调节功能,极大地削弱诸如探针浓度、温度、极性、环境的pH值、稳定性等众多可变或难以定量的因素的干扰，具有强的特异性及高的灵敏度；

[0019]  本发明利用乙二胺四乙酸铜钠为合成掺杂碳量子点的碳源及掺杂铜离子，通过一步法合成荧光探针，构建新型比率荧光传感器，用于Fe( )及色氨酸的比率荧光探针，在617nm波长处，Fe( ) 选择性有荧光增敏作用，在396nm波长处，色胺酸选择性有荧光增敏作用，两个波长处荧光强度的比值与分析物浓度成线性关系，从而建立了Fe( )及色氨酸的比率荧光探针，方法新颖，特异性强，灵敏度高。

附图说明

[0020] 图1为实施例1中比率荧光传感器的激发发射光谱示意图谱；

[0021] 图2为Fe( )的比率荧光探针以相对荧光强度比值I617/I396对Fe( )浓度示意图谱；

[0022] 图3为色氨酸的比率荧光探针以相对荧光强度比值I396/I617对色氨酸浓度示意图谱。

具体实施方式

[0023] 下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步详细地描述说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。

[0024] 实施例1：血液中色氨酸及Fe( )的含量测定操作步骤如下：

[0025] (1)荧光探针试剂的合成：称取乙二胺四乙酸铜二钠盐1.6g和抗坏血酸0.1g，混匀后，转移到刚玉坩埚，放入管式炉中，管式炉温度由室温经过130min升至300℃，再经过10min升至350℃，350℃保温煅烧120min后，管式炉自然冷却至室温；取出刚玉坩埚，将煅烧好后的固体转移至烧杯中，加去离子水100mL；超声20min，8000rpm离心20min，取出上清液，经0.22μm滤膜过滤，即得荧光探针试剂，即比率荧光传感器。

[0026] （2）荧光探针的激发波长及发射波长确定：将步骤（1）合成的荧光探针试剂溶解于水溶液中，在300到700nm进行扫描，荧光探针的最大激发波长在308nm，最大发射波长分别在396nm及617nm处；由图1可知：本实施例制备的荧光探针，在激发波长为308nm时，在396nm和617nm处有最大发射波长；

[0027] （3）比率探针对Fe( )的荧光响应：在度0.1-50μmol/L 的Fe( )溶液中，加入步骤（1）合成的荧光探针试剂50μL，荧光光谱在308nm波长的光照激发下，记录波段范围从300到700nm；探针以相对荧光强度比值I617/I396对Fe( )浓度进行作图,得到的线性关系I617/I396=0.2752+0.0087CFe( ) (r= 0.9971)，检出限为 0.01μmol/L ( S /N = 3)；图2为Fe(  ) 的比率荧光探针以相对荧光强度比值I617/I396对Fe( )浓度示意图谱，说明有好的线性关系；

[0028] （4）比率探针对色氨酸（TP）的荧光响应：在浓度0.5-250μmol/L的色氨酸溶液中，加入步骤（1）合成的荧光探针试剂100μL，荧光光谱在308nm波长的光照激发下,记录波段范围从300到700nm；探针以相对荧光强度比值I396/I617对色氨酸浓度进行作图,得到的线性关系I396/I617=0.060+0.196CTP(r= 0.9957)，检出限为 0.05μmol/L ( S /N = 3)；图3为色氨酸的比率荧光探针以相对荧光强度比值I396/I617对色氨酸浓度示意图谱，说明有好的线性关系；

[0029] （5）为了验证本方法对Fe( )及色氨酸检测的选择性，选择了一系列常见干扰物质进行实验。结果表明，与 Fe( )及色氨酸的响应相比，K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Ba2+、Hg2+、Fe2+、Fe3+、Cd2+；亮氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、壳聚糖、丝氨酸、精氨酸、葡萄糖及vitamin C 和对本探针的响应较小，说明本方法对 Fe( )及色氨酸的检测具有优良的选择性。

[0030] （6）血液样品测定：取空腹静脉血2 mL置于肝素抗凝管内，于4 ℃、10000rpm离心15min分离血浆，取肝素抗凝血浆 200 μL，加入20μL质量浓度35%的高氯酸溶液，涡漩混匀1 min，静置10 min，于4 ℃、15 000rpm离心力下离心 10 min 沉淀血浆中的蛋白质，取上清液按步骤（3）及步骤（4）进行Fe( )及色氨酸比率荧光测定，Fe( )含量为9.45μM，色氨酸含量为2.30μM。

[0031] 实施例2：发酵液样品中色氨酸及Fe( )的含量测定步骤为：

[0032] (1)荧光探针试剂的合成：称取乙二胺四乙酸铜二钠盐1.8g和抗坏血酸0.3g，混匀后，转移到刚玉坩埚，放入管式炉中，管式炉温度由室温经过120min升至300℃，再经过12min升至350℃，350℃保温煅烧120min后，管式炉自然冷却至室温；取出刚玉坩埚，将煅烧好后的固体转移至烧杯中，加去离子水100mL；超声25min，9000rpm离心18min，取出上清液，经0.22μm滤膜过滤，即得荧光探针试剂，即比率荧光传感器；

[0033] (2)荧光探针的激发波长及发射波长确定：同实施例1步骤(2)；

[0034] (3)比率探针对Fe( )的荧光响应：同实施例1步骤(3)；

[0035] (4)比率探针对色氨酸（TP）的荧光响应：同实施例1步骤(4)；

[0036] (5) 样品测定：采用色氨酸合成酶酶促发酵转化合成色氨酸，发酵液稀释100倍后，按实施例1步骤（3）及步骤（4）进行Fe( )及色氨酸比率荧光测定，其中测定Fe( )加入步骤（1）合成的荧光探针试剂200μL，测定色氨酸加入步骤（1）合成的荧光探针试剂300μL，Fe( )含量为1.36μM，色氨酸含量为125.50μM。

[0037] 实施例3：牛奶样品中Fe( )及色氨酸的含量测定步骤为：

[0038] (1)荧光探针的合成：称取乙二胺四乙酸铜二钠盐2.0g和抗坏血酸0.2g，混匀后，转移到刚玉坩埚，放入管式炉中，管式炉温度由室温经过125min升至300℃，再经过15min升至350℃，350℃保温煅烧120min后，管式炉自然冷却至室温；取出刚玉坩埚，将煅烧好后的固体转移至烧杯中，加去离子水100mL；超声30min，10000rpm离心15min，取出上清液，经0.22μm滤膜过滤，即得荧光探针试剂，即比率荧光传感器；

[0039] (2)荧光探针的激发波长及发射波长确定：同实施例1步骤(2)；

[0040] (3)比率探针对Fe( )的荧光响应：同实施例1步骤(3)；

[0041] (4)比率探针对色氨酸（TP）的荧光响应：同实施例1步骤(4)；

[0042] (5) 样品测定：准确称取脱脂奶0.1g于有刻度10 mL具塞试管中，加入4.00 mL木瓜蛋白酶溶液，振荡，置65 ℃恒温箱中酶解过夜，次日取出酶解液冷却，以3000r/min离心15 min，吸取上清液1 mL，按实施例1步骤（3）及步骤（4）进行Fe( )及色氨酸比率荧光测定，其中测定Fe( )加入步骤（1）合成的荧光探针试剂100μL，测定色氨酸加入步骤（1）合成的荧光探针试剂200μL，Fe( )含量为17.90μM，色氨酸含量为53.31μM。