一种提高紫花苜蓿游离小孢子出胚率的方法

摘要

本发明公开的一种提高紫花苜蓿游离小孢子出胚率的方法，包括在紫花苜蓿盛花期，从供体植株上挑选健壮无病虫害花蕾，选取游离小孢子处于单核居中期的花蕾进行培养。本发明的优点在于，能够快速、高效获得紫花苜蓿的小孢子胚，出胚率达到44.22个/蕾，进而获得的再生植株可用于紫花苜蓿单倍体育种。

权利要求

1.一种提高紫花苜蓿游离小孢子出胚率的方法，其特征在于，该方法包括在紫花苜蓿盛花期，从供体植株上挑选健壮无病虫害花蕾，选取游离小孢子处于单核居中期的花蕾进行培养；

在对所述花蕾进行培养前，对所述花蕾先用75％酒精消毒30s，之后用8％次氯酸钠消毒12min，无菌水冲洗5次后放于无菌研钵中；

培养方法包括在无菌研钵中加入半量MS液体培养基与B5液体培养基，半量MS液体培养基与B5液体培养基的体积比为1:1，用研棒轻轻挤压使小孢子游离于混合培养基溶液中，用

400目孔径尼龙网纱过滤收集滤液，离心3次，每次3min，然后将滤液悬浮于半量MS液体培养基与半量NLN液体培养基所组成的混合培养基中，半量MS液体培养基与半量NLN液体培养基的体积比为1: 1，调整小孢子在半量MS液体培养与半量NLN液体培养基所组成的混合培养4

基中密度至1×10个/mL；

其中，培养方法包括向半量MS液体培养与半量NLN液体培养基所组成的混合培养基中添加100μL质量浓度为 2％的活性炭，封口，4℃低温暗培养24h后，转到35℃高温暗培养

72h，再转到25℃暗培养直至出胚；在游离小孢子出胚3周后，将胚转至B5固体培养基中，在

25℃、光照16h/d条件下培养成再生植株。

2.根据权利要求1所述的提高紫花苜蓿游离小孢子出胚率的方法，其特征在于，小孢子在半量MS液体培养与半量NLN液体培养基所组成的混合培养基中培养时，将接种有小孢子的半量MS 液体培养与半量NLN液体培养基所组成的混合培养基分装于无菌、直径为60mm的培养皿中，每皿 2mL。

3.根据权利要求1所述的提高紫花苜蓿游离小孢子出胚率的方法，其特征在于，在紫花苜蓿盛花期，从供体植株上摘取健壮无病虫害花蕾的时间为于晴天上午8:00‑10:00从供体植株上摘取。

说明书

一种提高紫花苜蓿游离小孢子出胚率的方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物科学技术领域，具体为一种提高紫花苜蓿游离小孢子出胚率的方法。

背景技术

[0002] 单倍体育种具有巨大的商业应用价值，利用单倍体诱导产生单倍体植株，进而自然或人工加倍，即可在两年内获得纯合的育种材料，可以显著加快选择进程，缩短育种周
期。紫花苜蓿(Medicago sativa L.)属多年生异花授粉植物，其群体的遗传组成复杂多样，
基因型长期处于杂合状态，植株自交不亲和，因此紫花苜蓿主要采用混合选择、综合品种育
种、轮回选择等方法选育新品种。但是利用上述方法至少需要6‑7年的时间才能选育出一个
优良的群体，且极难得到纯合的材料，育种周期长、难度大、效率低，单倍体育种则是紫花苜
蓿育种途径的理想选择之一，只需要经过两个世代就可以选育出基因型完全纯合的材料，
简化了育种流程，提高了育种效率。

[0003] 目前植物游离小孢子培养技术已成为获得单倍体植株的最重要手段之一。现已在250多个物种上进行了小孢子培养技术的研究，紫花苜蓿采用游离小孢子培养后出胚率较
低，且未有获得单倍体植株的报道。因此，急需通过优化一些影响植物小孢子出胚率的因
素，提高紫花苜蓿小孢子的出胚率，并进而获得单倍体植株，对加快小孢子培养技术在紫花
苜蓿育种中的应用具有重要的理论意义和实用价值。

发明内容

[0004] 为解决现有技术中紫花苜蓿采用游离小孢子培养后出胚率较低的技术问题，本发明提供了一种提高紫花苜蓿游离小孢子出胚率的方法，实现的目的为能够快速、高效获得
紫花苜蓿的小孢子胚，出胚率达到44.22个/蕾，进而获得的再生植株可用于紫花苜蓿单倍
体育种。

[0005] 为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为，本发明提供了一种提高紫花苜蓿游离小孢子出胚率的方法，该方法包括在紫花苜蓿盛花期，从供体植株上挑选健壮无病虫
害花蕾，选取游离小孢子处于单核居中期的花蕾进行培养。本发明选择游离小孢子处于单
核居中期的花蕾进行培养，是由于单核居中期的游离小孢子出胚率最高，显著高于小孢子
其他的时期出胚率。

[0006] 进一步的，在对所述花蕾进行培养前，对所述花蕾先用75％酒精消毒30s，之后用8％次氯酸钠消毒12min，无菌水冲洗5次后放于无菌研钵中，采用无菌操作能够有效防止小
孢子被污染。

[0007] 进一步的，所述培养方法包括在无菌研钵中加入半量MS液体培养基与B5液体培养基，MS液体培养基与B5液体培养基的体积比为1:1，用研棒轻轻挤压使小孢子游离于所述混
合培养基溶液中，用400目孔径尼龙网纱过滤收集滤液，离心3次，每次3min，然后将滤液悬
浮于半量MS液体培养基与半量NLN液体培养基所组成的混合培养基中，MS液体培养基与NLN
液体培养基的体积比为1:1，调整小孢子在MS液体培养与NLN液体培养基所组成的混合培养
4
基中密度至1×10个/mL。

[0008] 进一步的，所述小孢子在MS液体培养与NLN液体培养基所组成的混合培养基中培养时，将接种有小孢子的MS液体培养与NLN液体培养基所组成的混合培养基分装于无菌、直
径为60mm的培养皿中，每皿2mL。将小孢子分装培养可提供更为舒适的空间。

[0009] 进一步的，所述培养方法包括向MS液体培养与NLN液体培养基所组成的混合培养基中添加100μL质量浓度为2％的活性炭，封口，4℃低温暗培养24h后，转到35℃高温暗培养
72h，再转到25℃暗培养直至出胚。选择的具体温度条件有利于提高小孢子出胚率。所添加
的活性炭可为小孢子的发育提供暗环境；吸附离体培养中的抑制性物质；对离体培养有益
物质解吸附。

[0010] 进一步的，在游离小孢子出胚3周后，将胚转至B5固体培养基中，在25℃、光照16h/d条件下培养成再生植株。通过本发明方法提高游离小孢子出胚率，还可以利用继续培养的
再生植株可用于紫花苜蓿单倍体育种。

[0011] 进一步的，在紫花苜蓿盛花期，从供体植株上摘取健壮无病虫害花蕾的时间为于晴天上午8:00‑10:00从供体植株上摘取。优选该时间点是因为相对于其它时间点，8点到10
点花蕾中的小孢子活力高，小孢子游离培养后成胚率高。

[0012] 本发明的积极进步效果在于：(1)首次在紫花苜蓿中利用游离小孢子培养技术高效地获得胚和再生植株。该发明提高了出胚率，进而获得的再生植株可用于紫花苜蓿单倍
体育种。

[0013] (2)通过游离小孢子培养得到的全部为单倍体或双单倍体植株，能够提高育种时选择效率，缩短育种周期。

[0014] (3)通过游离小孢子培养得到的单倍体植株是研究胚胎发生和形态发生机理较为理想的材料。

具体实施方式

[0015] 下面通过具体的实施例对本发明做进一步的详细描述。

[0016] 实施例一：本发明提供的一种提高紫花苜蓿游离小孢子出胚率的方法，该方法包括在紫花苜蓿盛花期，从供体植株上挑选健壮无病虫害花蕾，选取游离小孢子处于单核居
中期的花蕾进行培养的步骤。在紫花苜蓿盛花期，从供体植株上摘取健壮无病虫害花蕾的
时间为于晴天上午8:00‑10:00从供体植株上摘取。

[0017] 以下通过部分试验说明，本发明选择游离小孢子处于单核居中期的花蕾进行培养能够提高小孢子出胚率，比较了小孢子的发育时期对紫花苜蓿游离小孢子成胚率的影响，
包括单核居中期、单核靠边期和双核期，结果表明：单核居中期的游离小孢子出胚率最高，
达到31.55个/蕾，显著高于单核靠边期小孢子的出胚率(表1)。

[0018] 表1小孢子发育时期对“保定苜蓿”游离小孢子出胚率的影响

[0019] 处理时间 出胚率(个/蕾) 显著水平(α＝0.01)单核居中期 31.55 A
单核靠边期 16.54 B
双核期 0.18 C

[0020] 实施例二：本发明提供的一种提高紫花苜蓿游离小孢子出胚率的方法，该方法包括在紫花苜蓿盛花期，从供体植株上挑选健壮无病虫害花蕾，选取游离小孢子处于单核居
中期的花蕾进行培养的步骤。在紫花苜蓿盛花期，从供体植株上摘取健壮无病虫害花蕾的
时间为于晴天上午8:00‑10:00从供体植株上摘取。

[0021] 进一步的，在对所述花蕾进行培养前，对所述花蕾先用75％酒精消毒30s，之后用8％次氯酸钠消毒12min，无菌水冲洗5次后放于无菌研钵中。

[0022] 所述培养方法包括在无菌研钵中加入半量MS液体培养基与B5液体培养基，MS液体培养基与B5液体培养基的体积比为1:1，用研棒轻轻挤压使小孢子游离于所述混合培养基
溶液中，用400目孔径尼龙网纱过滤收集滤液，离心3次，每次3min，然后将滤液悬浮于半量
MS液体培养基与半量NLN液体培养基所组成的混合培养基中，MS液体培养基与NLN液体培养
基的体积比为1:1，调整小孢子在MS液体培养与NLN液体培养基所组成的混合培养基中密度
4
至1×10个/mL。

[0023] 所述培养方法包括向MS液体培养与NLN液体培养基所组成的混合培养基中添加100μL质量浓度为2％的活性炭，封口，4℃低温暗培养24h后，转到35℃高温暗培养72h，再转
到25℃暗培养直至出胚。

[0024] 所述小孢子在MS液体培养与NLN液体培养基所组成的混合培养基中培养时，将接种有小孢子的MS液体培养与NLN液体培养基所组成的混合培养基分装于无菌、直径为60mm
的培养皿中，每皿2mL。

[0025] 进一步的，在游离小孢子出胚3周后，将胚转至B5固体培养基中，在25℃、光照16h/d条件下培养成再生植株。获得的再生植株可用于紫花苜蓿单倍体育种，通过本发明方法使
游离小孢子培养得到的全部为单倍体或双单倍体植株。能够提高育种时选择效率，缩短育
种周期。

[0026] 以下通过部分试验数据，用以说明本发明选择游离小孢子处于单核居中期的花蕾进行培养、以及低温培养、高温培养所具体选择的温度为最大化提高小孢子出胚率的最佳
条件选择，以下为低温预处理不同时间对紫花苜蓿游离小孢子成胚率的影响，低温预处理
温度为4℃，处理时间分别为0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h，结果表明：4℃低温预处理24h
时的游离小孢子出胚率最高，达到33.37个/蕾，显著高于其它处理时间的出胚率(表2)。

[0027] 表2 4℃低温预处理不同时间对紫花苜蓿游离小孢子出胚率的影响

[0028]

[0029]

[0030] 以下为高温预处理不同时间对紫花苜蓿游离小孢子成胚率的影响，热激预处理温度为35℃，处理时间分别为0h、24h、48h、72h、96h、120h，结果表明:35℃热激预处理72h的游
离小孢子出胚率最高，达到32.3个/蕾，显著高于其它处理时间的出胚率(表3)。

[0031] 表3 35℃高温预处理不同时间对紫花苜蓿游离小孢子出胚率的影响

[0032]处理时间 出胚率(个/蕾) 显著水平(α＝0.01)
0h 0.26 D
24h 4.36 C
48h 25.4 B
72h 32.30 A
96h 6.50 C
120h 0.20 D

[0033] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修
改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。