非洲菊GhGDEF3基因在重瓣花形成中的应用

摘要

本发明属于基因工程技术领域，具体公开了非洲菊GhGDEF3基因在重瓣花形成中的应用。本发明首次发现非洲菊中GhGDEF3基因的表达能够控制过渡花长度的大小，当抑制该基因的表达时，能够使重瓣的非洲菊变成半重瓣，在非洲菊重瓣花的形成中具有重要的影响，为非洲菊在花型方面的分子研究及其育种提供了理论指导，具有重要的应用价值。

权利要求

1.SEQ ID NO：1所示非洲菊GhGDEF3基因在非洲菊重瓣花形成中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，是在促进非洲菊重瓣花向半重瓣花生长中的应用。

3.SEQ ID NO：1所示非洲菊GhGDEF3基因在调控过渡花长度中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，是在调控过渡花长度变短中的应用。

5.根据权利要求2或4所述的应用，其特征在于，是构建非洲菊GhGDEF3基因的沉默表达载体再转化至重瓣型非洲菊蕾期花序中。

说明书

非洲菊GhGDEF3基因在重瓣花形成中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，具体地，涉及非洲菊GhGDEF3基因在重瓣花形成中的应用。

背景技术

[0002] 非洲菊(Gerbera hybrida)是菊科大丁草属多年生常绿宿根草本花卉，又名扶郎花，为世界五大切花之一。非洲菊有单瓣、半重瓣和重瓣三种花型，它们是依据过渡花的长度和有无来进行划分的。其中只具有边缘舌花和中央盘花的定义为单瓣；半重瓣花不仅具有边缘舌花和具中央盘花，在边缘舌花和中央盘花之间还具有与边缘舌花类似的舌花结构，即过渡花，其长度小于花径的二分之一；重瓣型与半重瓣型基本相似，差别在于重瓣花的过渡花的长度大于花径的二分之一。

[0003] 在有关花卉的研究中，花型、花色、花香和花期是研究的四大方向，而花型，不仅是非洲菊重要的观赏性状和商品性状之一，而且涉及花瓣和雄蕊的差异发育。虽然在花发育模型方面的研究已经较为深入，也得出了许多有价值的结论，分离出了部分有重要应用前景的基因，但是重瓣花的形成是一个非常复杂的发育学过程。非洲菊的GhGDEF3基因属于MADS-box家族的转录因子，其C结构域的基序为euAP3基序。目前尚未有关于GhGDEF3基因如何调控非洲菊花瓣属性的相关报道。

发明内容

[0004] 本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供非洲菊GhGDEF3基因在重瓣花形成中的应用。所述非洲菊GhGDEF3基因的表达能够控制非洲菊过渡花长度的大小。

[0005] 本发明的另一目的在于提供非洲菊GhGDEF3基因在调控过渡花长度中的应用。

[0006] 为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

[0007] 本发明首次发现，非洲菊GhGDEF3基因的表达在非洲菊中能够控制过渡花长度的大小，当抑制该基因的表达时能够使重瓣的非洲菊变成半重瓣。具体研究过程如下：

[0008] 本发明利用荧光定量PCR技术确认了非洲菊GhGDEF3基因在重瓣‘粉秀’非洲菊及其半重瓣突变体中不同部位不同时期的表达情况。结果表明，半开期时，两种花型的表达量都达到最大，并且该时期在过渡花和雄蕊当中两种花型的表达量差异最大，在过渡花中，重瓣型的表达量高于半重瓣型，而在雄蕊中刚好相反。

[0009] 本发明通过基因克隆的方法获得非洲菊GhGDEF3基因的cDNA序列；并构建了35S启动子驱动GhGDEF3基因的VIGS表达载体；将构建好的表达载体转入到根癌农杆菌中，转化重瓣‘粉秀’非洲菊蕾期的花序；对转化瓶插处理10d后的花序进行表型分析，并进行荧光定量PCR确认该基因的表达情况。结果表明，与空载对照处理相比，病毒沉默GhGDEF3基因后花序的过渡花长度明显变短，说明病毒沉默GhGDEF3基因可以使重瓣型非洲菊过渡花明显变短成为半重瓣花。

[0010] 因此，本发明请求保护SEQ ID NO：1所示非洲菊GhGDEF3基因在非洲菊重瓣花形成中的应用。

[0011] 优选地，是在促进非洲菊重瓣花向半重瓣花生长中的应用。

[0012] 本发明还请求保护SEQ ID NO：1所示非洲菊GhGDEF3基因在调控过渡花长度中的应用。

[0013] 优选地，是在调控过渡花长度变短中的应用。

[0014] 优选地，是构建非洲菊GhGDEF3基因的沉默表达载体再转化至重瓣型非洲菊蕾期花序中。

[0015] 具体包括如下步骤：非洲菊GhGDEF3基因的克隆；构建VIGS表达载体；将VIGS表达载体转入根癌农杆菌感受态细胞中构建重组菌株，转化重瓣型非洲菊的花序，经组织培养后过渡花的花瓣缩短。

[0016] 更优选地，所述GhGDEF3基因的沉默表达载体为pTRV2-GhGDEF3。

[0017] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0018] 本发明首次发现非洲菊中GhGDEF3基因的表达能够控制过渡花长度的大小，当抑制该基因的表达时，能够使重瓣的非洲菊变成半重瓣，在非洲菊重瓣花的形成中具有重要的影响，为非洲菊在花型方面的分子研究及其育种提供了理论指导，具有重要的应用价值。

附图说明

[0019] 图1为实施例1中重瓣‘粉秀’非洲菊及其半重瓣突变体花序图；其中，A为重瓣型，B为半重瓣型。

[0020] 图2为实施例2中重瓣‘粉秀’非洲菊及其半重瓣突变体中GhGDEF3基因在过渡花中的表达分析。

[0021] 图3为实施例3中病毒沉默GhGDEF3基因后重瓣‘粉秀’非洲菊花序比较分析；其中，A为清水对照，B为空载对照，C为病毒沉默处理。

[0022] 图4为实施例3中病毒沉默GhGDEF3基因后非洲菊花序GhGDEF3基因的表达量分析；其中，a为过渡花，b为雄蕊，c为边缘舌花，d为盘花。

具体实施方式

[0023] 下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

[0024] 实施例1重瓣‘粉秀’非洲菊及其半重瓣突变体表型分析

[0025] 盛开期时，计数半重瓣与重瓣花的边缘舌花、过渡花和盘花的花瓣数，每种花型计数10朵花。测量边缘舌花和过渡花长度、宽度，观察盘花发育情况。花瓣的长度为花尖端到基部的纵向最长长度，宽度所测部位为与花瓣长垂直的横向最宽处。各实验重复三次，每次测量20～30个花瓣。

[0026] 结果表明：半重瓣突变体植株整体形态和营养生长方面于重瓣型的‘粉秀’非洲菊相比没有差异，其突变表型表现在花序上(图1)。从表1可以看出，重瓣型过渡花的大小明显要大于半重瓣型；从表2可以看出，重瓣型过渡花的数目明显多于半重瓣型，而盘花的数目刚好相反，在花瓣总数上两种花型的花瓣总数无明显差异。

[0027] 表1重瓣‘粉秀’非洲菊及其半重瓣突变体头状花序的边缘舌花和过渡花花瓣大小的差异

[0028]

[0029] 注：小写字母表示显著，大写字母表示极显著。

[0030] 表2重瓣‘粉秀’非洲菊及其半重瓣突变体头状花序花瓣数的差异

[0031] 部位 重瓣(个) 半重瓣(个)边缘舌花 55.62±1.92aA 55±1.41aA
过渡花 189.13±14.49aA 135.67±10.95bB
盘花 327±31.06aA 407±23.06bB
总计 571.75±32.35aA 598.33±24.86aA

[0032] 注：小写字母表示显著，大写字母表示极显著。

[0033] 实施例2在重瓣‘粉秀’非洲菊及其半重瓣突变体中GhGDEF3基因的表达特性[0034] 1、总RNA提取

[0035] 取重瓣‘粉秀’非洲菊及其半重瓣突变体花序初开期、半开期、盛开期和衰败期的边缘舌花、过渡花、盘花和雄蕊分别提取RNA，RNA的提取和纯化过程依照Magen RNA plus试剂盒提取，提取步骤根据说明书进行。取1μg总RNA利用PrimeScript反转录试剂盒(TaKaRa)进行RNA反转录，将反转录所得的cDNA产物稀释10倍后用于实时荧光定量PCR。

[0036] 2、GhGDEF3基因荧光定量PCR检测

[0037] 非洲菊GhGDEF3的基因在NCBI上的编号为FJ817421.1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，利用Primer Premier 5.0软件在GhGDEF3基因的3’非翻译区设计荧光定量PCR引物：

[0038] 上游引物F(SEQ ID NO：3)：AAACGATTCACAACAGGC；

[0039] 下游引物R(SEQ ID NO：4)：CCATTTGTGGGTATCCGT；

[0040] 引物的特异性通过凝胶电泳、测序和溶解曲线检验，使用标准曲线法检测每对引物的扩增效率和相关系数。试验使用ABI7500荧光定量PCR系统，反应体系为20μL，其中包含10μL iTaq Universal SYBR Green Supermix(Bio-Rad)、0.2μM上/下游引物、2μL cDNA模板和适量纯水。反应程序为95℃预变性30s，随后95℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，
40个循环，溶解曲线程序为从60℃开始，以1％的升温速度至95℃。每个样品进行三次技术重复。内参基因为actin：

[0041] 上游引物F(SEQ ID NO：5)：CTCTTGGAGGTGGTTGAT；

[0042] 下游引物R(SEQ ID NO：6)：CGTAACCAGACCAGGATT。

[0043] 荧光表达量计算采用2-ΔΔCT法进行计算。

[0044] 结果表明：GhGDEF3基因在半开期时，两种花型的表达量都达到最大，并且该时期在过渡花和雄蕊当中两种花型的表达量差异最大，在过渡花中，重瓣型的表达量高于半重瓣型，而在雄蕊中刚好相反(图2)。

[0045] 实施例3GhGDEF3的病毒沉默(VIGS)实验

[0046] 1、GhGDEF3基因的克隆

[0047] 根据NCBI上目的基因GhGDEF3的核苷酸序列，设计合成以下基因全长克隆引物：

[0048] 上游引物(SEQ ID NO：7)：5’-ATGGCGAGAGGGAAGATCCAG-3’；

[0049] 下游引物(SEQ ID NO：8)：5’-TTAGCCAAGCAAAGCATATGTGGC-3’。

[0050] 以重瓣‘粉秀’非洲菊的cDNA为模板，采用ExTaq酶进行PCR扩增，使用TBE缓冲液制作1.0％的琼脂糖凝胶，然后将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，使用上海生工的胶回收试剂盒进行胶回收，使用40μL洗脱液洗脱回收产物。使用rTaq DNA聚合酶(TaKaRa)对回收产物进行加A尾反应，反应条件为72℃保温30min。连接载体使用pMD19-T(TaKaRa)，16℃连接3h。将10μL连接产物与100μL大肠杆菌感受态细胞DH5α混合，冰浴30min。42℃热激90s，迅速冰浴2min。加入900μL液体LB，混合后于37℃摇床摇动1h。离心去上清液，在含100μg/mL Amp的LB固体培养基平板表面涂40μL的X-gal(20mg/mL)和4μL IPTG(200mg/mL)，然后涂布适量转化液。37℃倒置培养12～16h。用灭菌的枪头从LB固体培养基上挑取白色单菌落接种于含有100μg/mL Amp的LB液体培养基中，于控温水浴摇床上37℃、180rpm过夜培养。经菌液PCR检测后，使用上海生工的质粒小提试剂盒抽提过夜培养细菌的质粒，委托广州艾基生物有限公司进行目的基因序列测序，将测序结果与已登录的GhGDEF3基因序列进行同源比对。

[0051] 2、VIGS-GhGDEF3重组载体的构建

[0052] 本发明所用的载体为pTRV2载体，该载体可通过CloneExpress@的方法将目的基因GhGDEF3基因导入到该载体中，由35S启动子驱动目的基因的表达。GhGDEF3基因的VIGS引物：

[0053] 上游引物F(SEQ ID NO：9)：GTGAGTAAGGTTACCGAATTCATGGCGAGAGGGAAGATCCAG；

[0054] 下游引物(SEQ ID NO：10)：CGTGAGCTCGGTACCGGATCCTTAGCCAAGCAAAGCATATGTGG；

[0055] 用与目的基因所含酶切位点相同的酶对pTRV2载体进行双酶切，在37℃下酶切30min。同时用KOD高保真酶进行目的片段PCR的扩增，反应程序为92℃预变性2min，98℃变性10s，68℃退火30s，35个循环。再将酶切产物和PCR产物进行纯化回收，然后根据诺唯赞公司CloneExpress@无缝克隆试剂盒进行连接，连接程序为37℃反应30min，降至4℃或立即冰浴。

[0056] 3、重组质粒转化根癌农杆菌

[0057] 取2μL重组质粒DNA加入农杆菌感受态中，混匀，冰浴30min，转入液氮中冷冻5min，然后37℃水浴5min。在超净工作台中加入800μL YEP液体培养基，28℃，250rpm，2h，再4000rpm离心2min，去上清。用移液枪将离心管底部菌液悬浮，涂布于含有100μg/mL的Kan的YEP固体培养基平板上，在28℃培养1～2天，直至长出菌斑。用含有100μg/mL的Kan的YEP的液体培养基筛选出阳性转化子。菌液检测阳性转化子。经1％的琼脂糖凝胶电泳检测VIGS-GhGDEF3重组载体构建成功。

[0058] 4、VIGS-GhGDEF3重组载体通过农杆菌转化非洲菊

[0059] 挑选6个长势基本一致，发育至蕾期的重瓣‘粉秀’非洲菊花序，留取大约10cm的花梗，用于后续的侵染实验。将过夜培养，分别带有pTRV1、pTRV2和pTRV2-GhGDEF3载体的农杆菌菌液4000rpm离心10min；离心后得到的菌体用侵染液(10mmol/L 2-吗啉乙磺酸+40mg/L乙酰丁香酮+10mmol/L氯化镁，pH5.6)悬浮菌体细胞；悬浮后使菌液浓度达到OD600＝0.8～1.0，静置3h；将带有pTRV2-GhGDEF3载体和pTRV2载体的农杆菌菌液分别与pTRV1辅助载体的农杆菌菌液按1：1的比例混合；将事先备好的‘粉秀’非洲菊花序浸没在不同农杆菌混合侵染液中，以带有pTRV2载体和pTRV1载体的农杆菌混合液为对照(MOCK)，以清水为空白对照(CK)，将各处理同时置于气压为-0.10～-0.09MPa条件下，负压处理30～40min，随后慢慢恢复正常大气压；将各组材料取出先用自来水轻轻冲洗干净,然后蒸馏水润洗3次，用滤纸吸干花序上的水，瓶插于装有200mL 3％浓度蔗糖水的组培瓶中。8℃条件下黑暗培养3d，然后在昼夜12h交替，白昼25℃，黑夜16℃的条件下培养7d，每隔3d更换瓶插液。

[0060] 结果表明：将携带目的基因的病毒抽真空到蕾期的重瓣‘粉秀’非洲菊花序中，经培养10天后，病毒沉默处理的花序边缘舌花呈现卷曲的现象，过渡花的花瓣明显缩短(图3，表3)，与空载对照处理和清水处理形成鲜明对比，不过在花瓣数目上，三种处理没有明显差异。

[0061] 表3病毒沉默GhGDEF3基因后重瓣‘粉秀’非洲菊过渡花花瓣大小的差异[0062] 性状 清水对照(mm) 空载对照(mm) 病毒沉默(mm)长度 17.24±0.36aA 17.28±0.37aA 11.33±0.67bB
宽度 3.56±0.33aA 3.59±0.25aA -

[0063] 注：小写字母表示显著，大写字母表示极显著。

[0064] 通过荧光定量PCR的方法进行基因表达水平的检测，表明在非洲菊花序中GhGDEF3基因的表达已被沉默。GhGDEF3基因在重瓣‘粉秀’非洲菊病毒沉默后，在边缘舌花、过渡花、盘花和雄蕊当中，GhGDEF3分别下降了37.91％、51.45％、39.89和46.91(图4)。

[0065] 最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。